基于小鼠背脊皮翼視窗的腫瘤微環(huán)境活體可視化研究

江一航，肖輝雨，2，曹仲林，3，翟鵬，徐周睿，李麗，鄒曉敏，馬名澤，王曉梅，林桂淼，許改霞

1.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，廣東深圳518055；2.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，廣東深圳518057；3.貴州民族大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，貴州貴陽550025；4.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部，廣東深圳518055；5.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，廣東深圳518055

前言

腫瘤微環(huán)境是腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的內(nèi)環(huán)境，是由腫瘤細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞及其周圍的組織、免疫細(xì)胞、血管、細(xì)胞外基質(zhì)等共同形成的動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)［1-3］。其中，腫瘤新生血管將提供腫瘤組織新陳代謝所必需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)，以促進(jìn)腫瘤的迅速生長(zhǎng)。如果可以清晰觀察腫瘤新生血管的形狀及變化，便可實(shí)現(xiàn)腫瘤治療及轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)。腫瘤生長(zhǎng)中血管的監(jiān)測(cè)和成像對(duì)解析和干預(yù)腫瘤生長(zhǎng)，相關(guān)藥物研制、篩選和評(píng)價(jià)具有重要意義［4-6］。

背脊皮翼視窗（Dorsal Skin Fold Window Chamber,DSFC）是一種小動(dòng)物活體原位光學(xué)成像的輔助工具，通過在小鼠或兔子身上構(gòu)建可以進(jìn)行光學(xué)成像的透明窗口，拓展成像深度，使腫瘤微環(huán)境的血管、細(xì)胞甚至血流狀況得以可視化，大大提高了對(duì)病理生理學(xué)中微觀血管化的理解［7-10］。Palmer等［11］介紹了DSFC用于活體小鼠光學(xué)功能成像的方法，指出視窗模型對(duì)于研究活體的基因表達(dá)、血管重塑、血管新生以及腫瘤生長(zhǎng)和侵襲具有一定的應(yīng)用價(jià)值。2018年，Staresinic等［12］利用DSFC模型評(píng)價(jià)鈣電穿孔法的抗腫瘤效果，結(jié)果表明，鈣電穿孔法對(duì)正常血管和腫瘤局部血管具有相同程度的作用，主要通過破壞血管導(dǎo)致腫瘤壞死。

活體光學(xué)成像是一種在亞細(xì)胞水平上研究生理和病理過程的無損、微擾的成像方法，已被證明是一種能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤發(fā)展監(jiān)測(cè)、腫瘤治療評(píng)估的強(qiáng)大工具［13-14］。活體光學(xué)成像技術(shù)具有高分辨率、高靈敏度、可視化、能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，但是其成像深度淺，無法在傳統(tǒng)小鼠腫瘤模型中獲得腫瘤微環(huán)境的精確信息。

本研究利用轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）的小鼠乳腺癌細(xì)胞（4T1）構(gòu)建了DSFC 的乳腺癌熒光腫瘤模型，結(jié)合體視熒光顯微鏡和激光散斑成像（Laser Speckle Imaging, LSI）儀，連續(xù)監(jiān)測(cè)活體小鼠腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤局部血管狀態(tài)，同時(shí)采集腫瘤面積、體積、血管流量等參數(shù)隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)。在此基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)的抗腫瘤基因納米藥物PCL-PDEM-siRNA［15］對(duì)小鼠視窗內(nèi)腫瘤和腫瘤血管的抑制效果，揭示了該藥物對(duì)4T1 乳腺腫瘤生長(zhǎng)的連續(xù)動(dòng)態(tài)作用效果。本研究為腫瘤微環(huán)境的精細(xì)化成像和定量分析提供了新的策略，對(duì)腫瘤生物學(xué)的基礎(chǔ)研究和抗腫瘤藥物研發(fā)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞培養(yǎng)液由89%的RPMI-1640 培養(yǎng)液（購買于美國(guó)Gibco 公司）加入10%胎牛血清（購買于美國(guó)Thermo Scientific 公司）和1% 雙抗（購買于美國(guó)Thermo Scientific公司）混合而成，37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中預(yù)熱。4T1 細(xì)胞系（小鼠乳腺癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白GFP）購于廣州吉妮歐生物科技有限公司。按0.5×104個(gè)/孔密度將腫瘤細(xì)胞接種在12 孔板，置于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 裸鼠背脊翼視窗腫瘤模型構(gòu)建

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求和目的，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用購自于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心6～8 周齡22～25 g 的BALB/c 裸鼠于SPF條件下飼養(yǎng)，目的在于保證植入背脊翼視窗后裸鼠可以進(jìn)行正常的飲食和作息，有利于實(shí)現(xiàn)活體動(dòng)態(tài)連續(xù)監(jiān)測(cè)。本研究中所有的動(dòng)物手術(shù)和實(shí)驗(yàn)操作過程都嚴(yán)格遵照深圳大學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備部和醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的規(guī)定。在DSFC 手術(shù)和成像過程中，小鼠持續(xù)吸入1.5%異氟醚和30%氧氣以及70%氮?dú)獾幕旌蠚怏w麻醉，維持核心溫度為37 ℃。如圖1 所示，小鼠麻醉狀態(tài)下實(shí)施DSFC 手術(shù)，使用縫合線將皮膚固定于視窗框架，視窗玻片直接嵌入皮膚開口處［16-18］。待小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，微量進(jìn)樣針取5.5×105個(gè)4T1 細(xì)胞從視窗區(qū)域外部皮下注射，將細(xì)胞注射在于視窗中央血管交匯處。腫瘤生長(zhǎng)至第4天，根據(jù)視窗內(nèi)圖像判斷腫瘤視窗模型是否構(gòu)建成功，成功模型應(yīng)用于后續(xù)藥物治療效果動(dòng)態(tài)成像觀察。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療

如圖1 所示，對(duì)成功構(gòu)建視窗后的小鼠隨機(jī)分為空白組、磷酸緩沖液組、腫瘤組以及納米藥物治療組，每組3～4 只。其中，空白組作為對(duì)照不進(jìn)行任何操作。磷酸緩沖液組在空白組的基礎(chǔ)上第0 天進(jìn)行磷酸緩沖液注射，旨在研究注射操作對(duì)視窗內(nèi)毛細(xì)血管血流灌注量的影響。而腫瘤組以及納米藥物治療組均在第0 天開始，在視窗內(nèi)接種4T1 腫瘤細(xì)胞，不同的是納米藥物治療組在第4 天開始注射納米藥物PCL-PDEM-siRNA。從第0 天到第18 天持續(xù)對(duì)各組進(jìn)行活體成像。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療Fig.1 Grouping of experimental mice and the corresponding treatment strategy

1.4 腫瘤尺寸的測(cè)量方法

在DSFC腫瘤模型實(shí)驗(yàn)中，我們根據(jù)傳統(tǒng)小鼠腫瘤模型的腫瘤體積計(jì)算方法：利用ImageJ軟件讀取明場(chǎng)或熒光圖片上腫瘤的長(zhǎng)（L）和寬（W），公式如下：

根據(jù)式（1）計(jì)算得到腫瘤的體積。此外，考慮到DSFC腫瘤模型中，腫瘤在垂直于視窗的方向上生長(zhǎng)受限，且生長(zhǎng)區(qū)域并不規(guī)則，我們也用ImageJ軟件勾選出明場(chǎng)和熒光圖像中腫瘤區(qū)域，對(duì)腫瘤的面積進(jìn)行計(jì)算。

1.5 血流灌注量的計(jì)算方法

根據(jù)激光散斑成像儀拍攝出的圖像，用軟件自帶微血管管徑測(cè)量工具測(cè)量感興趣血管的直徑（D）及流速（v）。將感興趣血管直徑的軟件讀數(shù)（R）換算為單位μm，記放大倍數(shù)為M，計(jì)算公式如下：

根據(jù)轉(zhuǎn)換得到的D值和軟件讀數(shù)（v）值，計(jì)算出單根血管單位時(shí)間內(nèi)的灌注量即血流灌注量Q，計(jì)算公式如下［19-20］：

1.6 主要實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)儀器主要包括：臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（H-1850R, Eppendorf），超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD,Airtech），共聚焦顯微鏡（TCS SP5 II, Leica），二氧化碳培養(yǎng)箱（HERAcell vios 160i, Thermo Fisher Scientific），移動(dòng)式麻醉機(jī)（R520,瑞沃德），熒光分光光度計(jì)（Cary Eclipse, Aglien），超純水儀（Milli-Q，Millipore），流式細(xì)胞儀（FACS Calibur, BD），熒光顯微 鏡（BX51, OLYMPUS），體視顯微鏡（SZX16,OLYMPUS），激光散斑成像系統(tǒng)（BVI, TEK SQRAY），馬爾文激光粒度儀（Zetasizer-Nano-ZS-90,Malvern Panalytical）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)組間的數(shù)據(jù)比較采用單方差分析法（ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤視窗模型的構(gòu)建

首先在小鼠背部構(gòu)建DSFC 視窗，明場(chǎng)下利用體視顯微鏡觀察視窗內(nèi)是否有水腫、血管是否清晰、邊緣有無出血等；然后將4T1 腫瘤細(xì)胞接種到視窗中心，觀察小鼠的進(jìn)食習(xí)慣及行為狀態(tài)，并在接種4 d后在體視顯微鏡下觀察接種區(qū)域局部血管形貌及新生血管情況。

結(jié)果表明，DSFC 術(shù)后小鼠狀態(tài)良好，視窗不影響小鼠正常進(jìn)食和行動(dòng)。DSFC 構(gòu)建成功30 min 后，可在體視顯微鏡明場(chǎng)下觀察到視窗內(nèi)血管形態(tài)，血管細(xì)長(zhǎng)且形狀規(guī)則（圖2b），視窗皮下和邊緣縫合區(qū)無出血無水腫，視窗中央與邊緣厚度均勻。接種4T1細(xì)胞后4 d，肉眼可見接種部位隆起增厚，接種點(diǎn)周圍直徑小于20 μm 的毛細(xì)血管明顯增多，血管細(xì)且彎曲（圖2d），根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判斷4T1 乳腺癌DSFC 小鼠模型已構(gòu)建成功。重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明，接種4T1 細(xì)胞3～5 d 后，DSFC小鼠成瘤率可達(dá)90%以上。

圖2 小鼠DSFC成像Fig.2 Typical images of mouse dorsal skin-fold window chamber(DSFC)

為了連續(xù)、動(dòng)態(tài)觀察腫瘤及腫瘤微環(huán)境內(nèi)血管的生長(zhǎng)情況，我們利用體視顯微鏡對(duì)同一腫瘤小鼠視窗進(jìn)行22 d連續(xù)成像。如圖3所示，接種當(dāng)天為第0 天，當(dāng)天視窗內(nèi)血管清晰，接種區(qū)域無水腫；接種第2 天可見接種區(qū)域增厚，局部毛細(xì)血管數(shù)量增加，遠(yuǎn)端毛細(xì)血管變形連接，周邊大血管增粗；從第4 天到第22天，顯微鏡可下觀察到腫瘤區(qū)域逐步增厚擴(kuò)大，部分靠近接種區(qū)域的血管因與腫瘤位置重疊已無法觀測(cè)，腫瘤周邊的毛細(xì)血管增多、變粗。

圖3 體視顯微鏡下第0～22天腫瘤生長(zhǎng)變化（標(biāo)尺為2 mm）Fig.3 Tumor growth observed under stereomicroscope from day 0 to day 22(Scale bar:2 mm)

2.2 腫瘤視窗活體動(dòng)態(tài)成像

為了進(jìn)一步研究該視窗在腫瘤藥物療效中的功能，我們選擇實(shí)驗(yàn)室前期開發(fā)的抗腫瘤基因納米藥物PCL-PDEM-siRNA 對(duì)視窗內(nèi)腫瘤進(jìn)行治療，利用熒光體視顯微鏡和激光散斑成像儀，對(duì)視窗內(nèi)血管形態(tài)、腫瘤尺寸、血流灌注量等參數(shù)進(jìn)行持續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，從而研究該納米藥物的抗腫瘤特性。

首先在體視顯微鏡明場(chǎng)下觀察各組實(shí)驗(yàn)小鼠視窗內(nèi)的血管形態(tài)，并定量分析視窗內(nèi)腫瘤的面積和體積，如圖4 所示。圖4 顯示的是典型的體視顯微鏡明場(chǎng)成像結(jié)果：由圖4a 可見，空白組血管形態(tài)、數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)均無明顯變化；磷酸緩沖液組注射區(qū)域在第8 天出現(xiàn)直徑900 μm 的小片陰影，且陰影區(qū)域毛細(xì)血管增多，在第12 天，陰影區(qū)域變淡減小，而毛細(xì)血管繼續(xù)增多變粗。而在第16 天，陰影區(qū)域完全消失，血管形態(tài)恢復(fù)到第4 天的狀態(tài)，推測(cè)是針頭注射引起的短暫炎癥，炎癥發(fā)生在針頭注射的第4～8天。

腫瘤視窗模型在接種4T1 腫瘤細(xì)胞第4 天后分為2 組，觀察PCL-PDEM-siRNA 藥物對(duì)腫瘤的抑制作用。由圖4a后兩行圖像可見，與腫瘤組相比，納米藥物治療組在第8天開始腫瘤區(qū)域停止增大，血管形態(tài)基本穩(wěn)定且毛細(xì)血管的數(shù)量開始減少，也沒有出現(xiàn)遠(yuǎn)端毛細(xì)血管連接、血管向腫瘤部位收縮的現(xiàn)象。為準(zhǔn)確把握腫瘤的變化情況，我們對(duì)腫瘤組和納米藥物治療組的腫瘤面積與體積進(jìn)行定量分析。圖4b是利用傳統(tǒng)腫瘤計(jì)算公式計(jì)算得到的腫瘤體積變化趨勢(shì)圖，可見納米藥物治療組在第8 天后，可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，從而使腫瘤的尺寸維持在一定范圍內(nèi)不變化；考慮到DSFC 視窗模型會(huì)使腫瘤縱向生長(zhǎng)受限，我們同時(shí)也對(duì)視窗內(nèi)腫瘤面積進(jìn)行計(jì)算，如圖4c 所示，腫瘤面積的變化與體積變化總體趨勢(shì)是相同的，納米藥物治療組的明顯腫瘤抑制效應(yīng)發(fā)生在藥物注射后第4天。

為避免手動(dòng)劃分腫瘤區(qū)域的人為誤差，我們對(duì)腫瘤視窗區(qū)域進(jìn)行熒光成像，利用4T1細(xì)胞轉(zhuǎn)染的綠色熒光蛋白，可以清晰勾勒出腫瘤生長(zhǎng)情況（圖5）。由圖5 可知，在腫瘤組接種腫瘤細(xì)胞后第4 天可觀察到邊界清晰的腫瘤形態(tài)；第8天腫瘤組的腫瘤尺寸持續(xù)增大，綠色的腫瘤區(qū)域內(nèi)部出現(xiàn)黑色的管狀結(jié)構(gòu)為無熒光的新生血管；相對(duì)于第4天的注射納米藥物治療組，第8 天的治療組的腫瘤也增大，但腫瘤內(nèi)部新生血管的數(shù)量明顯少于腫瘤組；第12 天腫瘤組的腫瘤繼續(xù)增大，腫瘤內(nèi)部的新生血管數(shù)量增多且更為粗大，而納米藥物治療組的腫瘤尺寸與第8天無顯著差別，腫瘤內(nèi)血管數(shù)量和形態(tài)維持穩(wěn)定；第16天腫瘤組的腫瘤大小繼續(xù)增大，腫瘤內(nèi)部血管數(shù)量繼續(xù)增加，中央細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯減弱，推測(cè)中央?yún)^(qū)域發(fā)生細(xì)胞壞死；而納米藥物治療組的腫瘤尺寸在藥物注射第4天后就不再增加，腫瘤內(nèi)部新生血管數(shù)量和形態(tài)無明顯變化。對(duì)腫瘤區(qū)域的體積和面積的定量計(jì)算如圖5b 和圖5c 所示，納米藥物治療組的腫瘤體積及面積從第8天開始趨于穩(wěn)定，不再變化。該結(jié)果與熒光定性分析的結(jié)果一致，也與圖4明場(chǎng)分析的結(jié)果一致。

圖4 腫瘤生長(zhǎng)變化圖（標(biāo)尺為2 mm）Fig.4 Typical stereomicroscope images and tumor growth curves(Scale bar:2 mm)

由圖5可知，視窗內(nèi)熒光圖像的形狀和明場(chǎng)圖像的形狀不完全一致。明場(chǎng)下腫瘤區(qū)域大多為圓形，熒光圖像下則不是，而且治療后的形狀則更加不規(guī)則。此外，由于腫瘤附近和腫瘤內(nèi)部的血管及血流灌注量是反應(yīng)腫瘤微環(huán)境的重要指標(biāo)，我們利用激光散斑成像儀，對(duì)腫瘤視窗內(nèi)血流灌注量也進(jìn)行了定量分析。

圖5 腫瘤生長(zhǎng)變化熒光圖（標(biāo)尺為2 mm）Fig.5 Fluorescence images and tumor growth curves(Scale bar:2 mm)

圖6a 散斑成像可清晰分辨小鼠DSFC 區(qū)域內(nèi)血流灌注量及輪廓。第4～8天，腫瘤組視野中心的信號(hào)明顯變紅，表明腫瘤附近區(qū)域的血流速度有了顯著性提高；第8～12 天，小鼠DSFC 區(qū)域血流速度進(jìn)一步加快，附近的毛細(xì)血管內(nèi)血流速度也有大幅提高；第12～16 天，腫瘤區(qū)域信號(hào)顏色趨于穩(wěn)定，結(jié)合圖6b 定量分析可知血流灌注量依舊增大?？瞻捉M和磷酸緩沖液組的血流速度無明顯波動(dòng)，但磷酸緩沖液組相較于空白組血流灌注量有明顯提升，考慮兩方面原因：一是磷酸緩沖液的注射增加了局部體液，使血流速度加快；另一方面，可能是針頭對(duì)局部的刺激造成了血流灌注量的增加。腫瘤組視窗中心（接種點(diǎn)附近）血流灌注量隨時(shí)間明顯增大。而對(duì)于納米藥物治療組，藥物注射從第4 天開始，血流灌注量相較于未治療前略微增加，可能是由于藥物注射及針頭刺激引起的，在第6天之后，血流灌注量不再變化，與注射前基本一致，在第8天后，趨于穩(wěn)定。

圖6 小鼠DSFC激光散斑成像圖（標(biāo)尺為1 mm）Fig.6 Laser speckle imaging of mouse DSFC(Scale bar:1 mm)

綜合以上體視顯微鏡的明場(chǎng)成像、熒光成像以及激光散斑成像數(shù)據(jù)，我們可以明確，抗腫瘤基因納米藥物PCL-PDEM-siRNA 對(duì)于4T1 乳腺癌有抑制效果，在藥物注射4 d 后，腫瘤尺寸不再增大，生長(zhǎng)被抑制，血流灌注量先升后降，納米藥物注射第6 天后與磷酸緩沖液組基本一致。

3 結(jié)論

監(jiān)測(cè)腫瘤微環(huán)境對(duì)研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制及預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。本文通過將DSFC模型應(yīng)用在乳腺癌腫瘤活體成像，將體視顯微與激光散斑成像應(yīng)用于腫瘤微環(huán)境的監(jiān)測(cè)，旨在為抗腫瘤藥物治療研究提供一種直觀、可視化的動(dòng)態(tài)觀測(cè)方法。本研究工作選擇生長(zhǎng)速度較快的鼠源4T1 乳腺癌細(xì)胞來構(gòu)建小鼠腫瘤DSFC 模型，在裸鼠DSFC視窗內(nèi)接種4T1 細(xì)胞3～5 d 后，90%以上的DSFC 小鼠可成功成瘤。利用此平臺(tái)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期合成的抗腫瘤納米基因治療藥物PCL-PDEM-siRNA 治療小鼠乳腺癌的過程進(jìn)行活體可視化連續(xù)觀察，可以監(jiān)測(cè)視窗達(dá)22 d 以上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，視窗內(nèi)腫瘤組的血流灌注量越來越大，腫瘤的體積和面積也增大，腫瘤內(nèi)部新生血管增多，腫瘤周圍毛細(xì)血管延長(zhǎng)、連接、變粗；而納米藥物治療組腫瘤的體積和面積在藥物注射4 d 后不再增大，腫瘤內(nèi)部新生血管數(shù)量較腫瘤組少，血流灌注量在藥物治療6 d 后趨于平穩(wěn)，該研究從可視化定性和定量的角度揭示了基因治療藥物PCL-PDEM-siRNA 對(duì)小鼠乳腺癌及其微環(huán)境的作用效果。為腫瘤微環(huán)境可視化及定量化提供新的策略，對(duì)腫瘤生物學(xué)的基礎(chǔ)研究和抗腫瘤藥物研發(fā)具有重要意義。