子癇前期大鼠胎盤細(xì)胞自噬水平變化及黃芩苷的干預(yù)作用

徐秋蓮，王建芳，徐恒，牛艷昕，戴希望

金華市人民醫(yī)院 產(chǎn)科，浙江 金華 321000

子癇前期（preeclampsia,PE）是以高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)的產(chǎn)科常見病[1]。PE的發(fā)生與胎盤細(xì)胞異常反應(yīng)密切相關(guān)[2]。自噬是真核細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境刺激的一種防御機(jī)制[3]。然而，自噬過度或自噬不足均可導(dǎo)致疾病的發(fā)生[4]。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，Beclin 1和LC3 蛋白表達(dá)增加，而P62蛋白表達(dá)減 少[3-4]。黃芩苷是黃芩的主要有效成分，屬于黃酮類化合物，是祖國(guó)醫(yī)學(xué)多種保胎處方中的主要藥物之一，對(duì)PE具有抗氧化、抗炎、抗興奮性氨基酸毒性和抗凋亡等作用[5-6]。黃芩苷對(duì)自噬有雙向調(diào)節(jié)作用[7-8]。本研究采用亞硝基左旋精氨酸甲酯皮下注射制作PE大鼠模型，使用黃芩苷和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）作為干預(yù)手段，揭示胎盤細(xì)胞自噬與PE發(fā)生的關(guān)系及黃芩苷對(duì)胎盤細(xì)胞自噬的干預(yù)作用，從而為完善PE的發(fā)病機(jī)制研究和黃芩苷用于臨床治療PE提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 Wistar孕鼠（清潔級(jí)，體質(zhì)量220～250 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，以實(shí)驗(yàn)鼠陰道發(fā)現(xiàn)精子并有陰栓脫落當(dāng)日確定為妊娠第1日）；亞硝基左旋精氨酸甲酯（規(guī)格：500 mg/支，美國(guó)Sigma公司）；3-MA（50 mg/支，北京樂博生物科技有限公司）；黃芩苷注射液（5 g/支，上海脈鉑醫(yī)藥科技有限公司）；倒置拍照顯微鏡（IX51，上海徠卡公司）；無(wú)菌操作臺(tái)（SW-CJ-1FD，蘇州凈化有限公司）；低速離心機(jī)（5702R，上海盧湘儀器廠）；垂直電泳槽（DYCZ--24DN，北京六一儀器廠）；電轉(zhuǎn)儀（DYCZ-40，北京六一儀器廠）；水平搖床（TS-1，海門其林貝爾儀器制造有限公司）；尾動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè)儀（ALC-NIBP，上海奧爾科特公司）；全自動(dòng)生化分析儀（AU5831，蘇州貝克曼庫(kù)爾特生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模：本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，將48只Wistar孕鼠隨機(jī)分成4組，每組12只。正常妊娠組大鼠自妊娠13 d起連續(xù)皮下注射0.9%氯化鈉溶液1.5 mL/d至妊娠21 d。子癇前期組大鼠自妊娠13 d起連續(xù)皮下注射亞硝基左旋精氨酸甲酯100 mg/（kg·d）至妊娠21 d制作PE動(dòng)物模型[9]。黃芩苷組和自噬抑制組大鼠除了子癇前期組處理外，同時(shí)從妊娠16 d起，每天分別給予腹腔注射黃芩苷50 mg/（kg·d）[10]和3-MA 15 mg/（kg·d）[11]至妊娠21 d。在妊娠21 d，應(yīng)用尾動(dòng)脈血壓監(jiān)測(cè)儀測(cè)定大鼠尾動(dòng)脈血壓[12]，收集大鼠24 h尿液，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠24 h尿蛋白含量[12]。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡（Western blot）：取每組大鼠胎盤組織，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫印跡方法，使用β-actin（1:1 000）、Beclin 1（1:2 000）、LC3-II（1:2 000）和P62（1:1 000）等兔抗大鼠一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（1:2 000），采用ImageJ軟件分析Western blot結(jié)果，以β-actin水平為內(nèi)對(duì)照，比較相對(duì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組孕鼠尾動(dòng)脈血壓及24 h尿蛋白水平比較 子癇前期組較正常妊娠組尾動(dòng)脈收縮壓和舒張壓及24 h尿蛋白水平顯著升高（P＜0.05），黃芩苷組和自噬抑制組較子癇前期組尾動(dòng)脈收縮壓和舒張壓及24 h尿蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組孕鼠尾動(dòng)脈血壓及尿蛋白水平比較（每組n=12，±s）

2.2 各組孕鼠胎盤細(xì)胞Beclin 1、LC3-II和P62 蛋白表達(dá)水平比較 子癇前期組較正常妊娠組大鼠胎盤細(xì)胞Beclin 1 和LC3-II蛋白表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05），而P62蛋白表達(dá)水平顯著減少（P＜ 0.05）；黃芩苷組和自噬抑制組較子癇前期組大鼠胎盤細(xì)胞Beclin 1 和LC3-II蛋白表達(dá)水平顯著減少（P＜0.05），而P62蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組孕鼠胎盤細(xì)胞Beclin 1、LC3-II和P62蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

PE是一種始于胎盤、累及全身多臟器的，對(duì)孕產(chǎn)婦和胎兒甚至有致命影響的并發(fā)癥，臨床常表現(xiàn)為高血壓和蛋白尿[1]。亞硝基左旋精氨酸甲酯皮下注射是制作PE動(dòng)物模型的經(jīng)典方法[9]。本研究采用此方法制作大鼠PE模型，在妊娠21 d測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈血壓及24 h尿蛋白水平，結(jié)果顯示，PE大鼠的尾動(dòng)脈收縮期和舒張期動(dòng)脈壓及24 h尿蛋白水平均高于正常妊娠大鼠。

PE發(fā)生發(fā)展機(jī)制涉及胎盤及全身多臟器的炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞激活和細(xì)胞凋亡等復(fù)雜的病理生理過程[2]。但PE的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究尚不完善，這也阻礙了PE治療藥物的研發(fā)。自噬是一種在真核細(xì)胞中通過雙層膜狀結(jié)構(gòu)的自噬體包裹隔離待降解底物，并將其運(yùn)輸至溶酶體進(jìn)行降解和回收再利用的分解代謝過程，主要發(fā)生在缺氧、免疫損傷、應(yīng)激和營(yíng)養(yǎng)缺乏等情況下，被認(rèn)為是細(xì)胞對(duì)不良環(huán)境刺激的一種防御機(jī)制。然而，自噬過度或自噬不足均可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。自噬相關(guān)的基因有Beclin 1、LC3-II和P62 等。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，Beclin 1和LC3-II表達(dá)增加，而P62表達(dá)減少。這些蛋白表達(dá)程度的變化可以用于反映機(jī)體或細(xì)胞自噬的發(fā)生[3-4]。自噬參與腫瘤、神經(jīng)退行性病變、心血管疾病、感染和免疫功能缺陷等多種疾病的病理過程[13-15]。自噬相關(guān)的研究是目前學(xué)術(shù)界的熱點(diǎn)。

近年來(lái)，一些學(xué)者對(duì)自噬與PE發(fā)病的相關(guān)性也進(jìn)行了研究報(bào)道。在胎盤的標(biāo)本中，PE胎盤細(xì)胞Beclin 1和LC3-II蛋白及mRNA表達(dá)增加，而P62蛋白及mRNA表達(dá)減少[16]。然而，關(guān)于自噬對(duì)PE中的滋養(yǎng)細(xì)胞是促進(jìn)其存活還是導(dǎo)致其死亡或功能損傷尚不明確。本研究制作PE大鼠模型同時(shí)采用自噬抑制劑3-MA作為干預(yù)手段，數(shù)據(jù)顯示，PE大鼠確實(shí)存在胎盤細(xì)胞Beclin 1和LC3-II蛋白表達(dá)增加，而P62蛋白表達(dá)減少，而3-MA腹腔注射可以逆轉(zhuǎn)自噬相關(guān)蛋白在PE大鼠胎盤細(xì)胞的表達(dá)水平，同時(shí)也可顯著降低大鼠尾動(dòng)脈血壓及抑制24 h尿蛋白水平。因此，胎盤細(xì)胞自噬可能參與大鼠PE的發(fā)生發(fā)展過程，而抑制自噬可能成為PE治療的新途徑。

黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效。黃芩苷是黃芩的主要有效成分，屬于黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗興奮性氨基酸毒性、抗凋亡等生物活性。黃芩苷已用于臨床治療肝損傷、腦損傷、視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病[5-6]。黃芩是祖國(guó)醫(yī)學(xué)多種保胎處方中的主要藥物之一。因此，黃芩苷對(duì)胎兒及孕婦是安全可靠的。已有研究證實(shí)，黃芩苷對(duì)PE具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用[5-6]。最近，有研究顯示，黃芩苷對(duì)自噬有雙向調(diào)節(jié)作 用[7-8，17-18]。但黃芩苷對(duì)PE胎盤細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用不得而知。本研究揭示，黃芩苷不僅可以抑制胎盤細(xì)胞Beclin 1 和LC3-II蛋白表達(dá)，而且能夠提高P62蛋白表達(dá)，同時(shí)也可顯著降低大鼠尾動(dòng)脈血壓及抑制24 h尿蛋白水平。因此，黃芩苷對(duì)PE大鼠具有治療作用，而抑制胎盤細(xì)胞自噬可能是黃芩苷治療作用的重要機(jī)制之一。

綜上，本研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中揭示黃芩苷對(duì)PE具有治療作用，而抑制胎盤細(xì)胞自噬可能是黃芩苷治療作用的重要機(jī)制之一。