CsgRNA減少APOBECs在Cas9-D10A介導的基因編輯過程中引入的突變

任蓉蓉，陳紅全

1.浙江醫(yī)院 醫(yī)學檢驗科，浙江 杭州 310013；2.浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院 檢驗科，浙江 杭州 310016

CRISPR/Cas9系統是強大的基因編輯工具，近幾年得到廣泛的應用[1-4]。近期，研究者將APOBECs（members of the apolipoprotein B mRNA-editing enzyme,catalytic polypeptide-like）蛋白和CRISPR系統緊密的聯系在了一起[5-7]。我們的前期研究發(fā)現應用Cas9-D10A/sgRNA進行基因編輯時，APOBEC-3B蛋白能夠引入非目的突變[5]，因此有必要優(yōu)化Cas9-D10A/sgRNA系統的保真性。應用Cas9-D10A/sgRNA進行基因編輯時，D10A能夠切割雙鏈DNA的單鏈后形成切口樣結構，從而暴露出DNA單鏈，而APOBECs蛋白具有胞苷脫氨酶活性，能夠攻擊單鏈DNA的胞嘧啶脫氨使其變?yōu)槟蜞奏?，使單鏈DNA發(fā)生堿基突變。本研究根據上述現象提出以下理論設想：對Cas9-D10A/sgRNA系統設計csgRNA（chaperone sgRNA），使D10A進行基因編輯時產生的DNA單鏈結構能夠與csgRNA形成堿基互補配對，從而形成雙鏈樣結構，降低APOBECs的攻擊，以減少APOBECs對Cas9-D10A進行的基因操作形成的單鏈DNA引入突變，從而降低突變率。

1 材料和方法

1.1 質粒構建與引物設計 Cas9（pST1374-N-NLSFlag-linker-Cas9）、D10A（pST1374-N-NLS-flaglinker-D10A）、H840A（pST1374-N-NLS-flag-linker-H840A）和dCas9（pST1374-N-NLS-flag-linker-dead Cas9）等表達載體由上?？萍即髮W黃行許教授饋贈，sgRNA表達載體由pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro（Addgene 51133）構建完成；sgRNA4和FANCF打靶位點的sgRNAs序列和其各自的上下游PCR引物序列見表1。

表1 sgRNAs序列和引物序列

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染 293FT、293FT-A3B和293FTA3Bm細胞系由上?？萍即髮W陳佳教授饋贈，所有細胞均在DMEM（10566，美國Gibco公司）+10% FBS（16000-044，美國Gibco公司）、37 ℃條件下培養(yǎng)；細胞以2×105/孔，接種于12 孔細胞培養(yǎng)板，8 h后用LipofectamineTM2000（美國Thermo Fisher Scientific 公司）轉染，轉染試劑包括125 μL Opti-MEM+2 μg Cas9表達載體+1 μg sgRNA表達載體+3 μL Lipofectamine，24 h后加終質量濃度為 1 μg/mL的嘌呤霉素（ant-pr-1，美國InvivoGen公司）藥篩，48 h后用酚氯仿法抽提基因組DNA。

1.3 T7EN1酶切實驗 首先用PCR方法擴增sgRNA打靶位點上下游DNA序列，PCR反應程序如下：94 ℃，5 min；（98 ℃，10 s，72～62 ℃，每循環(huán)降低1 ℃，15 s；72 ℃，30 s）10個循環(huán)，（98 ℃，10 s；62 ℃，15 s；72 ℃，30 s）25個循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃ 保持，PCR產物用PCR清潔試劑盒（美國Axygen公司，AP-PCR-50）純化，純化后的PCR產物進行退火（體系為：NEB Buffer2，2 μL，PCR產物，200 μg，純水補齊至20 μL。退火程序：95 ℃ 5 min；95～85 ℃，每秒降低2 ℃；85～25 ℃，每秒降0.1 ℃；4 ℃保持）。退火產物放于冰上，每個體系加入0.3 μL T7核酸內切酶I，37 ℃孵育25 min，之后用2.5%瓊脂糖凝膠電泳（100 V，25 min）。

1.4 統計學處理方法 采用GraphPad Prism5統計學軟件進行分析，2組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 APOBEC-3B顯著增強Cas9-nickase基因編輯的突變率 有研究表明APOBEC-3B過表達可顯著增強Cas9-nickase基因編輯的突變率[5]。本研究首先在293FT-A3B過表達細胞系上檢測Cas9-nickase的基因編輯效率。選取sgRNA4和sgFANCF打靶位點，構建載體，脂質體法轉染293FT、293FT-A3B和293FTA3Bm細胞系，通過T7EN1酶切實驗檢測其編輯效率，結果如圖1所示，Cas9在三種細胞系上對四個位點均產生了非常明顯的切割條帶，在293FT-A3B過表達細胞系中，Cas9-D10A對兩個位點均產生了明顯的切割，Cas9-H840A的切割條帶較弱，而在293FT和293FT-A3Bm細胞系則檢測不到肉眼可見的切割條帶，這表明APOBEC-3B過表達顯著增強了Cas9-D10A進行基因編輯時產生的突變。

圖1 T7EN1酶切凝膠圖顯示APOBEC-3B過表達顯著增加了Cas9-nickase/sgRNA的突變率

2.2 csgRNA降低由APOBEC-3B引起的Cas9-nickase基因編輯突變率 為降低APOBEC-3B對Cas9-D10A進行基因編輯時引入的突變，我們擬通過csgRNA策略予以解決，其原理示意圖見圖2A。根據以上理論原理，本研究在sgRNA4和sgFANCF位點上設計csgRNA，其長度為20 bp，構建雙U6（sgRNA+csgRNA）載體、轉染293FT-A3B細胞系，T7EN1酶切實驗檢測結果見圖2B，結果顯示在A3B過表達細胞系中，csgRNA降低了D10A在sgRNA4和sgFANCF打靶位點所產生的切割條帶，這表明csgRNA策略能夠降低D10A進行基因編輯時APOBEC3B蛋白對單鏈DNA的攻擊，從而減少突變的發(fā)生。

圖2 CsgRNA策略對Cas9-D10A基因編輯效率分析

2.3 csgRNA條件的優(yōu)化 對csgRNA的長短、作用位置進行優(yōu)化。選取sgRNA4打靶位點，設計了24個csgRNA，其長度和作用位置見圖3A，構建雙U6載體，脂質體法轉染293FT-A3B細胞系，T7EN1酶切實驗檢測基因編輯效率，結果見圖3B。1、2、8、9、10、13號csgRNA其D10A切割條帶顯著降低了，其csgRNA對Cas9的切割條帶無影響。對Cas9和D10A產生的切割條帶進行灰度掃描，D10A/Cas9切割條帶灰度值比值見圖3C，其中1、11、15、21號csgRNA和S4比差異無統計學意義（P＞0.05），其他csgRNA差異均具有統計學意義（P＜0.05）。8號（csgRNA長度為16 bp、向PAM端延伸2個堿基）和9號（csgRNA長度為20 bp、向PAM端延伸4個堿基）csgRNA既能確保Cas9/sgRNA4的基因編輯效率，對降低D10A/sgRNA4進行基因編輯時APOBEC-3B蛋白引入的突變其效果相對更好一些。

圖3 csgRNA長度和位置的優(yōu)化

2.4 8 號csgRNA在Cas9 nickase上的作用效果 選取8號csgRNA，以sgRNA4和sgFANCF為打靶位點，在293FT-A3B細胞系上進一步驗證8號csgRNA的保護性效果，并看其在Cas9-D10A和Cas9-H840A上的作用效果。轉染293FT-A3B細胞系，T7EN1酶切結果和D10A/Cas9切割條帶灰度值比值見圖4，8號csgRNA在sgRNA4和sgFANCF位點上均顯著降低Cas9-D10A的表達，差異有統計學意義（P＜0.05）。以上結果表明在sgRNA4和sgFANCF打靶位點上，8號csgRNA可明顯降低APOBEC-3B對D10A進行基因編輯時產生的突變。

圖4 csgRNA在Cas9 nickase上的作用效果

3 討論

自從CRISPR/Cas9 系統被研究者成功開發(fā)出來，其廣泛應用于生命科學研究[8-11]，但其臨床應用（如基因治療）一直受限于嚴重的脫靶效應[12-14]，因此進一步提高特異性是其臨床應用的前提。本研究結果顯示，在sgRNA4和sgFANCF位點上，csgRNA 策略對D10A/sgRNA系統有明顯保護作用，而對H840A/sgRNA保護性無效果，這是因為H840A蛋白只有RuvC切割活性結構域，RuvC切割DNA非互補鏈，隨后的缺口過程暴露的DNA互補鏈和sgRNA結合的雙鏈結構占據主要部分，因此csgRNA策略主要降低APOBECs對D10A/sgRNA系統進行基因編輯時產生的突變；在對csgRNA條件進行優(yōu)化時，發(fā)現較短的csgRNA保護性效果不佳，可能是因為D10A蛋白切割DNA單鏈后暴露的缺口過大造成的，這需要進一步驗證。

科學家們在提高CRISPR/Cas9系統保真性方面付出了巨大的努力，如通過優(yōu)化sgRNA的設計來提高CRISPR系統的保真性[15]、高保真性Cas9蛋白的開發(fā)[16]、利用Cas9-D10A結合雙sgRNAs策略降低的脫靶效應的研究[17]等，但這些方法均不能有效抑制APOBECs對Cas9-D10A/sgRNA系統進行基因操作時引入的突變[5]。最近研究者將CRISPR-Cas9系統融合ArIIA4-Cdt1 表達元件，其在確?；蚓庉嬓实耐瑫r，可降低脫靶效應[18]，這是學者們在提高CRISPR系統保真性上的又一大進步。我們設想，將融合ArIIA4-Cdt1的CRISPR系統與csgRNA策略相結合，對APOBECs高表達的細胞進行基因編輯時，其保真性會進一步提高。

免疫細胞基因編輯在治療人類各種疾病方面具有廣闊的潛力[12，19-21]，然而免疫細胞中APOBECs高水平表達并且在細胞激活過程中APOBECs的表達持續(xù)上調[5，22]，這就使人們對免疫細胞進行基因編輯時更需謹慎。本研究為降低APOBECs對Cas9-D10A/sgRNA系統進行基因編輯時產生的突變提供了csgRNA策略，為其進一步向臨床應用，尤其是對APOBECs高表達的初始T細胞進行基因編輯時，做出了一定的貢獻。

綜上，本研究通過csgRNA策略成功降低了 APOBECs對Cas9-D10A/sgRNA進行基因編輯時引入的突變，為提高CRISPR系統保真性提供參考。