康復(fù)新液治療潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的效果

金旭敏，孫潔，薛鵬鵬，董偉杰，陶信潔，徐荷林

溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035，1.實(shí)驗動物中心；2.藥學(xué)院；3.第一臨床醫(yī)學(xué)院

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis,UC）是一種以黏膜炎癥和潰瘍形成為主要病理特征的慢性疾病[1-2]。UC發(fā)病機(jī)制目前不完全清楚，普遍認(rèn)為與遺傳、環(huán)境等綜合因素導(dǎo)致的結(jié)腸黏膜屏障損傷有關(guān)[3-4]。目前臨床上UC治療仍以緩解炎癥反應(yīng)的口服小分子藥物如抗炎免疫抑制和抗生素等為主要手段[5-6]，但不能防止炎癥的反復(fù)發(fā)作，而且多次治療容易使UC演進(jìn)為更為頑固的炎癥病癥[7]。研究發(fā)現(xiàn)，康復(fù)新液（KFX）具有改善胃腸黏膜創(chuàng)面微循環(huán)和抑菌抗炎抗水腫的作用[8]，可以用于放射性直腸的治療[9]，但是KFX對結(jié)腸黏膜的屏障修復(fù)作用仍然缺乏一定的支持。本研究的KFX采用口服給藥，以地塞米松液體灌腸劑為陽性藥物[10]，通過對比評價KFX對UC的治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 葡聚糖硫酸鈉（DSS）購于美國Sigma公司；KFX（湖南科倫制藥有限公司）和地塞米松（DXM，國藥集團(tuán)容生制藥有限公司）；髓過氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）檢測試劑盒（武漢愛博泰克生物科技有限公司）。IL-6 兔多克隆抗體（DF6087，1:200，Affinity，江蘇親科生物研究中心有限公司）；IL-1β兔多克隆抗體[AB9722，1:200，Abcam?，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司]；TNF-α小鼠單克隆抗體[52B83，1:100，Santa Cruz?，Santa Cruz Biotechnology（上海）Co.，Ltd.]。SpectraMax M3酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），Nikon正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司），內(nèi)窺鏡影像系統(tǒng)（SD-618型，沈陽沈大內(nèi)窺鏡有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組：按照文獻(xiàn)[11-12]方法，4% DSS加入小鼠飲用水，連續(xù)喂養(yǎng)6 d，建立UC模型。模型建立后，小鼠出現(xiàn)毛發(fā)紊亂，大便疏松甚至便血，表現(xiàn)出明顯的UC癥狀。15只造模成功小鼠分為3組，每組5只，分別為口服0.9%氯化鈉溶液組（Saline組）、地塞米松溶液灌腸組（DXM組）和KFX口服組（KFX組），在第7天開始給藥治療。0.9%氯化鈉溶液或KFX，每次1 mL，每日3次灌胃給藥，連續(xù)治療7 d；DXM溶液以0.05 mg/kg劑量，每次0.1 mL，每日3次，用注射器經(jīng)直腸3～4 cm處灌注給藥，給藥后倒置小鼠15 s，連續(xù)給藥7 d。治療期間每日觀察小鼠的體質(zhì)量以及糞便情況，對其疾病活動指數(shù)（disease activity index,DAI）進(jìn)行評分。治療終點(diǎn)，處死各組小鼠，分離結(jié)腸組織，觀察結(jié)腸外觀并測量其長度。體質(zhì)量變化率（%）=第n天體質(zhì)量/初始體質(zhì)量。

1.2.2 結(jié)腸長度及MPO活性檢測：通過脾臟質(zhì)量間接評價治療后UC小鼠整體炎癥的緩解情況[13]。治療終點(diǎn)（第13天）處死各組小鼠，收集小鼠脾臟稱重比較。收集整個結(jié)直腸觀察結(jié)直腸形態(tài)，并測量結(jié)腸長度。取距離肛門6 cm以上的結(jié)腸組織100 mg，組織勻漿器勻漿，10 000×g離心10 min，取上清液，利用試劑盒測定組織MPO活性。

1.2.3 結(jié)腸鏡觀察：麻醉小鼠后將灌胃針接在注射器上，對小鼠灌注1 mL 0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行腸道清洗。用少量甘油潤滑內(nèi)窺鏡鏡頭，將鏡頭插入小鼠肛門，在電腦屏幕上進(jìn)行觀察。在造模第6天、第10天以及第13天對小鼠的結(jié)腸表面形態(tài)進(jìn)行內(nèi)窺鏡觀察，對其表面形態(tài)進(jìn)行評分比較。潰瘍評分：0分為無明顯潰瘍；1分為輕度充血、水腫、表面光滑、潰瘍散在分布數(shù)量1～2處；2分為黏膜粗糙呈顆粒狀、有糜爛水腫出血、潰瘍散在分布數(shù)量大于2處；3分為高度充血水腫、黏膜表面有壞死及部分區(qū)域潰瘍；4分為重度出血糜爛，明顯大面積潰瘍。炎癥評分：0分為無明顯炎癥；1分為黏膜細(xì)顆粒狀改變；2分為黏膜表面發(fā)紅、糜爛；3分為黏膜表面明顯潰瘍、出血；4分為黏膜表面大范圍潰瘍、出血。

1.2.4 HE、PAS及免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色方法：取距離肛門6 cm以上的結(jié)腸組織，10%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，組織切片機(jī)切成厚度為5 μm的薄片，用HE染色、AB-PAS染色和免疫熒光染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料用±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組治療效果比較 3組小鼠造模6 d內(nèi)的體質(zhì)量明顯減輕，并且Saline組在實(shí)驗結(jié)束時沒有恢復(fù)。第7天開始DXM組和KFX組小鼠出現(xiàn)不同程度的體質(zhì)量上升，表明病變腸道功能逐漸恢復(fù)。KFX組小鼠的體質(zhì)量較DXM組在第12天恢復(fù)得更接近初始體質(zhì)量，表明該組病變腸恢復(fù)最好。Saline組小鼠DAI評分明顯升高，而DXM組和KFX組DAI評分隨著第7天開始治療逐漸下降，且KFX組的評分低于DXM組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A、圖1B。整個治療過程中，Saline組中的小鼠出現(xiàn)軟糞便伴有輕微的腹瀉痕跡，并且嚴(yán)重程度逐漸增強(qiáng)，在肛門部位顯示水樣糞便和大出血。DXM組和KFX組小鼠第7天腹瀉和糞便出血明顯緩解，第8天2組小鼠糞便轉(zhuǎn)為正常，并未見出血癥狀。Saline組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)明顯腫脹和萎縮；DXM組和KFX組小鼠結(jié)腸組織腫脹有所緩解，DXM組仍有數(shù)只出現(xiàn)不同程度的結(jié)腸萎縮；與DXM組比，KFX組結(jié)腸腫脹與萎縮有所減少；與Saline組比，DXM組和KFX組小鼠結(jié)腸長度明顯恢復(fù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1C、圖1D。Saline組小鼠出現(xiàn)明顯的脾臟腫大，DXM組和KFX組小鼠脾腫大有明顯緩解，KFX組與Saline組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1E。表明KFX組的治療能有效緩解UC小鼠免疫系統(tǒng)的激活。

圖1 3組對DSS誘導(dǎo)UC小鼠的治療效果比較

2.2 3組小鼠炎癥反應(yīng)比較 Saline組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)較高的MPO水平，DXM組和KFX組小鼠結(jié)腸組織MPO水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2A。這些結(jié)果表明，KFX治療可有效地緩解免疫細(xì)胞的激活，抑制中性粒細(xì)胞結(jié)腸組織的浸潤，緩解潰瘍性結(jié)腸的炎癥。

2.3 3組小鼠結(jié)腸形態(tài)比較 造模第5天，各組小鼠結(jié)腸均出現(xiàn)嚴(yán)重的潰瘍性糜爛，出現(xiàn)大面積的滲血和腫脹的黏膜，與觀察到的結(jié)腸炎嚴(yán)重程度、血便程度、結(jié)腸外觀相一致。第9天，DXM組和KFX組小鼠結(jié)腸均未見潰瘍性糜爛，但仍存在黏膜腫脹；Saline組小鼠的結(jié)腸仍可見滲血和大面積潰瘍。第13天，DXM組和KFX組小鼠結(jié)腸黏膜腫脹均有所緩解，展現(xiàn)出明顯的宏觀形態(tài)修復(fù)，見圖2B。潰瘍評分表明，與Saline組比，DXM組和KFX組小鼠的黏膜恢復(fù)明顯更好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)DXM和KFX治療之后，腸鏡炎癥評分下降，與Saline組比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明DXM和KFX對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠有明顯的治療效果，見圖2C、圖2D。

圖2 3組小鼠結(jié)腸炎癥及形態(tài)比較

2.4 3組小鼠組織形態(tài)比較 第14 天Saline組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)隱窩膿腫或消失，黏膜下層和肌層水腫，炎性細(xì)胞浸潤。DXM組和KFX組治療后，隱窩形態(tài)有效修復(fù)，黏膜下層和肌層水腫有一定緩解，炎癥細(xì)胞浸潤有所減少。與DXM組比，KFX組展現(xiàn)出完整的黏膜上皮層、隱窩以及肌層黏膜和黏膜下層，相互間分界分明，各層組織未見明顯的腫脹與炎癥細(xì)胞浸潤，見圖3A。

與Saline組比，DXM組和KFX組的小鼠結(jié)腸組組織學(xué)評分均得到改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3B。Saline組出現(xiàn)明顯的杯狀細(xì)胞缺失和黏液分泌減少，而DXM組和KFX組均呈現(xiàn)出良好的杯狀細(xì)胞形態(tài)，表明有效改善了UC導(dǎo)致的杯狀細(xì)胞損傷；且與DXM組比，KFX組出現(xiàn)更完好的杯狀細(xì)胞的形態(tài)，見圖3C。與Saline組比，DXM組和KFX組AB-PAS陽性區(qū)域面積明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖3D。表明DXM和KFX有效改善了杯狀細(xì)胞的缺失，增加了黏液的分泌。

圖3 3組修復(fù)DSS誘導(dǎo)UC的杯狀細(xì)胞

2.5 3組小鼠結(jié)腸組織的炎癥因子水平 在治療第14天，Saline組IL-1β、IL-6和TNF-α表達(dá)均明顯上升，DXM和KFX組治療后熒光表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且KFX組IL-1β、IL-6和TNF-α熒光強(qiáng)度均低于DXM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。熒光強(qiáng)度統(tǒng)計結(jié)果如圖4B所示，結(jié)果說明KFX和DXM均能夠有效地發(fā)揮抗炎作用，從而產(chǎn)生治療UC的效用，且KFX具有更好的抗炎效果。

圖4 3組小鼠結(jié)腸組織的炎癥因子水平

2.6 KFX修復(fù)DSS誘導(dǎo)的UC小鼠的黏膜屏障 如圖5 所示，在第14天Saline組結(jié)腸上皮層僅有微弱、分散的Claudin-5、ZO-1和Occludin-1相關(guān)熒光，表明細(xì)胞間緊密連接被嚴(yán)重破壞。DXM和KFX組治療后，結(jié)腸上皮層出現(xiàn)明顯的熒光，與Saline組比，KFX組中Claudin-5、ZO-1和Occludin-1的表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；KFX組中Claudin-5、ZO-1和Occludin-1熒光強(qiáng)度明顯高于DXM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），表明KFX組黏膜屏障修復(fù)得更為完整。

圖5 3組修復(fù)DSS誘導(dǎo)UC的黏膜屏障

3 討論

UC以黏膜炎癥和潰瘍?yōu)橹饕±硖卣?，臨床呈現(xiàn)反復(fù)發(fā)作不愈的特點(diǎn)，癌變風(fēng)險高，預(yù)后差，已被WHO列為現(xiàn)代難治病之一[14]。持續(xù)或反復(fù)出現(xiàn)的結(jié)腸炎癥是導(dǎo)致結(jié)腸纖維化狹窄、結(jié)腸癌的重要原因[15]。目前臨床UC治療仍以小分子抗炎藥物和抗生素等緩解炎癥反應(yīng)為主要手段，但不能防止炎癥的反復(fù)發(fā)作，缺乏有效的根治藥物。加之嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)如腎損傷、免疫抑制引發(fā)的感染等，目前小分子藥物對UC的治療臨床獲益十分有限[16]。

KFX是以美洲大蠊干燥蟲體分離提取物精制而成的一種生物制劑[17]。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，KFX具有促進(jìn)組織修復(fù)、抗炎、抑菌的作用，因此有望用于UC的治療。研究報道KFX治療消化性潰瘍有效率可達(dá)到93%[9]。KFX具有促進(jìn)表皮生長因子表達(dá)以修復(fù)黏膜的作用，且可通過抑制AP-1、NF-κB、IL-4等炎性遞質(zhì)的表達(dá)來達(dá)到全身及局部的抗炎作用[18]。

緊密連接蛋白廣泛分布于上皮、內(nèi)皮、間皮細(xì)胞膜上，在細(xì)胞間組成分子屏障，調(diào)節(jié)分子和離子在細(xì)胞間隙的彌散。UC小鼠腸道黏膜上皮中，緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。Claudin-5、ZO-1和Occludin-1 蛋白在腸黏膜屏障功能維持中起重要作用。本研究進(jìn)一步對治療后小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行Claudin-5、ZO-1和Occludin-1免疫熒光染色，以評價結(jié)腸黏膜修復(fù)情況，結(jié)果表明KFX對黏膜屏障有很好的修復(fù)作用。

本課題的KFX采用口服給藥方式，以DXM溶液灌腸作為對照組，對比評價KFX的黏膜屏障修復(fù)作用。與Saline組相比，DXM或KFX展現(xiàn)出較明顯的炎癥緩解，黏膜屏障結(jié)腸組織形態(tài)修復(fù)。而且KFX相比DXM展現(xiàn)出更為有效的治療效果，可能原因如下：①KFX具有促進(jìn)組織修復(fù)、抗炎、抑菌的作用；②KFX具有促進(jìn)表皮生長因子表達(dá)的作用，較DXM不良反應(yīng)更少。