反芻動物重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)環(huán)狀RNA的研究進(jìn)展

雷嬡嬡,仲 濤 (四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 6111300)

circRNA(circular RNA)于1976年在病毒中被首次發(fā)現(xiàn)[1]，3年后在動物細(xì)胞和真菌酵母中也發(fā)現(xiàn)了circRNA的存在[2]。隨后在小鼠SRY基因、大鼠和人類細(xì)胞色素基因中也發(fā)現(xiàn)了circRNA[3-5]，但人們并沒有認(rèn)識到circRNA的重要性[6]。近年來，在越來越多的物種中均發(fā)現(xiàn)了circRNA，且來自不同物種的circRNA卻有許多序列是同源序列。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA不僅是剪接體介導(dǎo)的錯誤剪接的副產(chǎn)物，而且是通過順式作用元件和反式作用因子調(diào)控反向剪接的產(chǎn)物，且circRNA的序列比線性RNA穩(wěn)定[6]，另外還發(fā)現(xiàn)大多數(shù)circRNA的表達(dá)水平相比于其線性RNA表達(dá)要高[7]。迄今為止，研究人員已經(jīng)在多種生物組織和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)至少有10%的基因能夠產(chǎn)生circRNA[8]。

1 circRNA的特點(diǎn)及形成

circRNA由于其獨(dú)特的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)[8]和缺少可被RNA外切酶(包括RNase R)識別末端多聚腺苷酸A，與線性RNA相比更穩(wěn)定，半衰期也更長[9]。circRNA在不同組織、不同時間和不同種屬中有表達(dá)特異性，通常circRNA比線性RNA表達(dá)水平要低[10]，但在癌組織和癌細(xì)胞中，線性轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平較高，可能與線性轉(zhuǎn)錄本容易被核酸外切酶識別磷酸二酯鍵，在癌細(xì)胞環(huán)境中易達(dá)到合成與降解的平衡相關(guān)[11]。

circRNA大多來源于已知的蛋白質(zhì)編碼基因，包含一個或多個外顯子和內(nèi)含子。根據(jù)來源及形成方式，可將circRNA分為三類：外顯子環(huán)狀RNA(Exonic circular RNA)、內(nèi)含子環(huán)狀RNA(Intronic circular RNA )、外顯子和內(nèi)含子環(huán)狀RNA(Exonic-Intronic circular RNA,)[12-14]。來源于內(nèi)含子的circRNA，主要存在于細(xì)胞核中，目前對其形成有兩種假說，一是含有內(nèi)含子的特殊結(jié)構(gòu)，先形成閉合的套鎖結(jié)構(gòu)，再在相關(guān)脫支酶及核酸外切酶的共同作用下得到circRNA。另一種假說是前體tRNA的外顯子兩端的內(nèi)含子堿基配對，之后環(huán)化的外顯子被釋放形成circRNA[15-16]。來源于外顯子的circRNA大多存在于細(xì)胞質(zhì)中，它是由前體mRNA經(jīng)過特殊的背接法產(chǎn)生的[17]。外顯子環(huán)化過程主要有兩種機(jī)制：一種是直接的反式剪接，另一種是外顯子跳讀[18]。外顯子環(huán)狀RNA是在生物體內(nèi)最豐富的環(huán)狀RNA類型，外顯子環(huán)化依賴于兩側(cè)的內(nèi)含子互補(bǔ)序列。側(cè)翼內(nèi)含子之間或單個內(nèi)含子內(nèi)部的RNA配對之間的競爭可調(diào)節(jié)外顯子環(huán)化效率，反向重復(fù)Alu對的交替形成和它們之間的競爭可以導(dǎo)致選擇性的RNA環(huán)化，從而產(chǎn)生由單個基因產(chǎn)生的多個環(huán)狀RNA轉(zhuǎn)錄本[19]。

2 circRNA的功能

2.1 circRNA可調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄

circRNA可與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。circRNA可以特異性結(jié)合某些蛋白，進(jìn)而與RNA或DNA結(jié)合形成復(fù)合體，促進(jìn)RNA結(jié)合蛋白(RBP)、RNA和DNA發(fā)生互作[20]?？刂泼ぜ〉鞍?muscleblind, MBL)合成的基因可經(jīng)轉(zhuǎn)錄剪接形成circMbl，circMbl可與盲肌蛋白結(jié)合負(fù)反饋調(diào)節(jié)MBL的產(chǎn)生，即MBL可促進(jìn)生成circMbl，同時促進(jìn)Mbl mRNA的生成，而 circMbl會負(fù)反饋調(diào)節(jié)MBL。circMbl作為自我調(diào)節(jié)分子可抑制circMbl和Mbl mRNA的合成，從而抑制盲肌蛋白的形成[21]。

2.2 circRNA可與蛋白質(zhì)相互作用

circRNA可與RBP結(jié)合后發(fā)揮其生物學(xué)功能。在AGO(Argonaute)蛋白參與的基因表達(dá)沉默機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，circCDR1as和circSry能夠通過結(jié)合AGO，并抑制AGO蛋白與靶標(biāo)分子結(jié)合，影響mRNA翻譯[24-25]。circANRIL可與pre-rRNA(rRNA前體)競爭性結(jié)合PES1蛋白，抑制PES1與核糖體結(jié)合，調(diào)控核糖體生成過程[26]。

2.3 circRNA可作為miRNA海綿

circRNA上存在大量miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可作為內(nèi)源性RNA與mRNA競爭miRNA，通過與miRNA結(jié)合發(fā)揮海綿作用，調(diào)控靶基因的表達(dá)[27]?？茖W(xué)家在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者和糖尿病大鼠中都發(fā)現(xiàn)circDNMT3B在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，circDNMT3B可海綿吸附miR-20b-5p，負(fù)調(diào)控miR-20b-5p在糖尿病視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，減輕視力損害[28]； circFUT10對miR-133a發(fā)揮海綿作用，通過直接與miR-133a結(jié)合并抑制miR-133a的活性來調(diào)節(jié)牛成肌細(xì)胞的分化和細(xì)胞存活[29]；在肝癌細(xì)胞中，circMTO1可發(fā)揮海綿功能吸附miR-9，抑制mRNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控癌細(xì)胞的生長[27]；circZFR通過海綿作用結(jié)合miR-130a和miR-107抑制胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)其凋亡[31]。

2.4 circRNA可翻譯功能蛋白質(zhì)

目前，circRNA翻譯機(jī)制有兩種：一種是依賴內(nèi)部核糖體嵌入位點(diǎn)(IRES)；另一種是依賴N6-甲基腺苷甲基化修飾。這兩種翻譯過程，往往是在細(xì)胞應(yīng)激狀況下被激活，從而使得特定基因啟動表達(dá)。如circβ-catenin由 IRES 驅(qū)動翻譯 β-catenin-370aa 蛋白，影響肝癌細(xì)胞的生長過程[32]，circPINT由IRES介導(dǎo)，翻譯得到PINT-87aa蛋白，抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[33]。同時部分circRNA雖然沒有IRES，仍能結(jié)合核糖體啟動翻譯。如在人的癌細(xì)胞中circE7由m6A介導(dǎo)，可編碼E7的蛋白，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖[35]，另外，小鼠的成肌細(xì)胞circZNF609，因具有開放閱讀框，可翻譯蛋白質(zhì)[35]。

2.5 circRNA可參與細(xì)胞通訊和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

在動物體的外泌體、血清等中circRNA的含量和種類都有顯著差異，推測circRNA可能參與細(xì)胞物質(zhì)和信息的傳遞交流[36]。由于circRNA對核酸外切酶有較強(qiáng)抵抗性且具有高穩(wěn)定性，判斷在機(jī)體內(nèi)可能會有circRNA積累。這種積累是否有毒目前尚不清楚，可能存在調(diào)控circRNA含量的分子機(jī)制，如降解或驅(qū)逐circRNA的分子機(jī)制，包括其他囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制或內(nèi)切酶的裂解等。有研究發(fā)現(xiàn)，分泌小泡(外泌體)中的circRNA含量與線性RNA相比較多，表明circRNA通過囊泡將信息傳遞給其他細(xì)胞，達(dá)到對細(xì)胞內(nèi)circRNA水平的控制[37]。

3 circRNA在反芻動物的研究進(jìn)展

已有的circRNA研究主要集中在疾病方面。例如，circRNA可作為膀胱癌[38]、結(jié)腸癌[39]和肺癌等[40]癌癥中的診斷標(biāo)記之一。但在動物方面，circRNA的研究較少，在反芻動物中已有的研究主要集中在生長發(fā)育等方面。

3.1 circRNA對反芻動物繁殖性狀的影響

3.1.1 circRNA對山羊卵細(xì)胞的調(diào)控 研究發(fā)現(xiàn)，麻城黑山羊產(chǎn)羔數(shù)比西方山羊品種多，可能與排卵率較高有關(guān)[41]。因此，Tao等[42]分別采集了麻城黑山羊和波爾山羊的排卵前卵泡，利用RNA測序技術(shù)檢測兩品種卵泡中circRNA的表達(dá)情況。在兩個山羊品種中發(fā)現(xiàn)37個差異表達(dá)circRNAs，其中chi_circ0008219可以通過海綿作用招募3個卵泡相關(guān)miRNAs(chi-miR-34c-5p、chi-miR-483、chi-miR-1468-3p)。有研究已證實(shí)，miR-34c通過與Bc1-2相互作用，參與并調(diào)控第一次胚胎分裂[43]；miR-483作為一種卵巢miRNA，在伴有排卵功能障礙的女性中會表達(dá)失調(diào)[44]；chi-miR-1468在山羊卵泡期和黃體期中存在差異表達(dá)[45]，推測circRNA可能通過與調(diào)控靶基因表達(dá)的miRNA結(jié)合來調(diào)控卵泡發(fā)育。

卵泡顆粒細(xì)胞對卵泡的生長和卵母細(xì)胞的成熟有著重要作用，陶虎等[46]構(gòu)建了山羊新環(huán)狀RNA circ_ZCCHC24的過表達(dá)載體pc-circ_ZCCHC24，研究其對山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circ_ZCCHC24后，細(xì)胞中circ_ZCCHC24的mRNA表達(dá)量升高了41.3倍(P<0.01)，山羊卵泡顆粒細(xì)胞增殖速率也有了較大提高，表明circ_ZCCHC24過表達(dá)可促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖。這些研究揭示了可以通過調(diào)控circRNA的表達(dá)，影響山羊卵泡的發(fā)育，提高山羊的繁殖性能。

3.1.2 circRNA對奶山羊子宮內(nèi)膜的影響 胚泡在子宮內(nèi)的著床能力用子宮內(nèi)膜容受性(receptive endometrium，RE)表示，RE與糖蛋白、細(xì)胞因子和甾類激素的調(diào)控等因素有關(guān)。最近的研究表明，非編碼RNA在RE的形成中起著重要的作用，Song等[47]在山羊子宮內(nèi)膜胚胎著床(receptive，R)期和胚胎著床前(pre-receptive，P)期，進(jìn)行miRNA的表達(dá)檢測分析，研究結(jié)果顯示，有442個miRNA在R期和P期中均有表達(dá)，且表達(dá)差異明顯。表明，miRNA在子宮內(nèi)膜的發(fā)育的不同階段表達(dá)情況不同。之后，Song等[48]探究了circRNA在山羊子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)R期與P期相比有334個有顯著差異表達(dá)的circRNA，并對circRNA-miRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)的進(jìn)行分析，分析結(jié)果支持circRNA作為miRNA海綿調(diào)節(jié)基因表達(dá)的觀點(diǎn)，也進(jìn)一步表明了circRNA可能發(fā)揮了海綿作用影響了山羊子宮內(nèi)膜的基因表達(dá)。

circRNA功能與其宿主基因密切相關(guān)，circRNA8077的宿主基因CRIM1在激活妊娠早期重要的血管內(nèi)皮生長因子和細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)中起重要作用[49]。CRIM1是circRNA8072的宿主基因，circRNA8072在妊娠早期表達(dá)量顯著上調(diào)，推測circRNA8072的表達(dá)可能對奶山羊子宮內(nèi)膜的容受性產(chǎn)生影響。

子宮內(nèi)膜的發(fā)育與胚胎附植密切相關(guān)，miRNA和circRNA 可在山羊子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)，調(diào)控其生長。miR-26a可促進(jìn)奶山羊子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖，而circRNA3669可在奶山羊P期子宮內(nèi)膜組織中特異性表達(dá)，作為競爭性RNA吸附miR-26a，并抑制miR-26a的活性，調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的生長[50]；circRNA8073可發(fā)揮海綿作用于miR-449a，促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖[51]；一些circRNA在子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中被性腺激素(如：E2和P4)調(diào)控[48]。這些研究結(jié)果揭示了circRNA在山羊子宮內(nèi)膜的生長發(fā)育中發(fā)揮的作用，為探索反芻動物繁殖性能提供了新的方向。

3.1.3 circRNA影響乳腺組織的表達(dá) 奶牛乳腺炎的發(fā)生與遺傳、環(huán)境等因素有關(guān)。王兵兵等[52]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA circLPP參與奶牛乳腺炎的發(fā)生發(fā)展過程。circLPP通過吸附miR-615，影響其靶基因SPRED3 mRNA的表達(dá)，調(diào)控奶牛乳腺細(xì)胞的增殖，影響奶牛乳腺炎的發(fā)展過程。

Hao等[53]利用小尾寒羊和甘肅高山細(xì)毛羊探究在泌乳高峰期circRNA在乳腺組織的表達(dá)譜，得到有部分circRNA與乳腺細(xì)胞的發(fā)育和哺乳有關(guān)，例如miR-200家族在妊娠和哺乳期間表達(dá)，預(yù)測circ-001091可靶向調(diào)控miR-200b。此外，還發(fā)現(xiàn)circ-001091具有miR-29b的靶點(diǎn)，從而抑制miR-29可以減少奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳蛋白、甘油三酯和乳糖的分泌[54]。Liu等[55]研究發(fā)現(xiàn)，miR-574-5p對乳腺發(fā)育和泌乳性能有顯著影響，miR-574-5p的過表達(dá)可提高山羊乳腺上皮細(xì)胞的凋亡，降低細(xì)胞的增殖，而抑制miR-574-5p的表達(dá)則呈現(xiàn)相反的結(jié)果，進(jìn)一步探討miR-574-5p在山羊乳腺上皮細(xì)胞中作用的分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，miR-574-5p通過抑制山羊乳腺上皮細(xì)胞中PI3K/AKT mTOR通路的MAP3K9和AKT3的激活來抑制牛奶合成，circ-016910發(fā)揮海綿作用吸附miR-574-5p，可促進(jìn)羊奶的合成。以上研究表明，circRNA通過發(fā)揮海綿作用吸附miRNA影響miRNA對應(yīng)的mRNA的表達(dá)，調(diào)控乳腺細(xì)胞的發(fā)育，影響反芻動物乳腺組織的生長。

3.2 circRNA對反芻動物生長發(fā)育的影響

3.2.1 circRNA對綿羊內(nèi)分泌的影響 垂體前葉是調(diào)節(jié)動物出生后生長最重要的內(nèi)分泌器官，主要調(diào)控生長激素(GH)的基因轉(zhuǎn)錄、合成和分泌。Ye等[56]將巴馬小型豬和大型豬長白豬作為研究動物產(chǎn)后生長的理想模型對它們的垂體前葉進(jìn)行miRNA和mRNA表達(dá)譜分析，研究發(fā)現(xiàn)了222個miRNA，其中一些可能影響動物出生后生長，推測垂體中的非編碼RNA參與了出生后垂體的生長，circRNA作為胚胎垂體發(fā)育和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的新型調(diào)控因子，通過作用于miRNA影響轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。Brinkmeier等[57]研究發(fā)現(xiàn)，與某些關(guān)鍵通路相關(guān)的157個基因在小鼠發(fā)育中的前腺中表達(dá)?；谝陨涎芯砍晒?，研究人員在羊上開始進(jìn)行垂體基因的相似研究，利用miRanda和psRobot在綿羊circRNA中識別了miRNA靶點(diǎn)，豐富的KEGG和GO通路清楚地表明circRNA在垂體和激素分泌的基本生物學(xué)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，特別是甲狀腺激素信號通路、GnRH信號通路、磷脂酰肌醇信號通路。Li等[58]研究發(fā)現(xiàn)circRNA在綿羊發(fā)情和非發(fā)情期間在垂體腺中的表達(dá)模式存在大量差異，在綿羊妊娠期和產(chǎn)后兩個時期circRNA在垂體中表達(dá)存在差異[59]，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)circRNA參與了與垂體功能相關(guān)的信號通路，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了circRNA可以在綿羊腦垂體中表達(dá)發(fā)揮作用，另外circRNA在綿羊的垂體中表達(dá)的量比骨骼肌和脂肪生成中的表達(dá)要高[60]，circRNA在綿羊腦垂體中大量表達(dá)進(jìn)一步表明了circRNA對反芻動物的生長有著重要作用。

3.2.2 circRNA對山羊與牛骨骼肌的影響 在肌肉生長過程中起重要作用的肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(MEF2C)可以產(chǎn)生circRNA468，肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A(MEF2A)可以產(chǎn)生circRNA235?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)circRNA和許多與肌肉生長發(fā)育相關(guān)的miRNA相互作用影響肌肉生長發(fā)育，如miR-208、miR-133和miR-206[61]。此外，一些circRNA同時包含兩個不同miRNA的靶點(diǎn)，例如，circRNA30同時具有miR-29和miR-26位點(diǎn)，miR-29可以和Akt3靶向結(jié)合，抑制Akt3對成肌細(xì)胞增殖的作用，促進(jìn)Akt3對成肌細(xì)胞分化的作用[61]。

Cao等[62]在綿羊骨骼肌中鑒定了大量circRNA，并通過RT-PCR對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了驗(yàn)證。在KEGG通路分析中發(fā)現(xiàn)，有幾種circRNA如circRNA30、circRNA100、circRNA468、circRNA678、circRNA205和circRNA606參與了肌肉的發(fā)育和生長過程。功能預(yù)測表明circRNA在綿羊骨骼肌的生長發(fā)育過程中起著重要作用。魏雪鋒[63]在以秦川牛為材料研究中，得到miR-378a-3p可與HDAC4靶向結(jié)合，抑制牛骨骼肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肌細(xì)胞的分化和凋亡。circ LMO7 與HDAC4競爭性結(jié)合miR-378a-3p，調(diào)控牛骨骼肌的生長發(fā)育。這些研究結(jié)果證實(shí)了circRNA在反芻動物的骨骼肌中大量表達(dá)，調(diào)控反芻動物骨骼肌的生長發(fā)育。

4 結(jié) 語

隨著對circRNA的研究深入，越來越多circRNA的作用被發(fā)現(xiàn)，例如，在人類的多種腫瘤癌癥等疾病中circRNA可充當(dāng)標(biāo)志分子，但在動物生長發(fā)育中的研究較少，目前在反芻動物中發(fā)現(xiàn)，circRNA在反芻動物繁殖與生長發(fā)育的遺傳調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮作用，因此，應(yīng)加快對circRNA作用的挖掘與發(fā)現(xiàn)，為反芻動物經(jīng)濟(jì)性狀的提高提供幫助，為反芻動物的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。