非洲豬瘟病毒編碼蛋白功能及疫苗研究進(jìn)展

安一娜 楊靜靜 高 敏 董彥君

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京100193

ASF 是ASFV 感染引發(fā)的豬類疾病，患病豬表現(xiàn)為高熱、心率加快、呼吸困難、皮膚發(fā)紺、脾及淋巴結(jié)等免疫器官水腫出血；不同毒力的毒株感染會(huì)導(dǎo)致不同的臨床表現(xiàn)，感染后通常在3～10 d 內(nèi)死亡，家豬死亡率接近100%。

ASFV屬DNA 雙鏈目，非洲豬瘟病毒屬，是非洲豬瘟病毒科中唯一的DNA 蟲媒病毒，這種病毒可通過直接或間接接觸感染多種真核生物；ASFV 主要侵染豬的巨噬細(xì)胞，感染后，病毒的早期復(fù)制集中于細(xì)胞核，隨后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中完成剩下的復(fù)制過程，ASFV 基因組龐大，隨著近幾年相關(guān)研究的開展，病毒蛋白的結(jié)構(gòu)及功能逐漸清晰，但仍有大量蛋白功能尚不清楚，這極大地制約了對(duì)ASF 的防控。2019年相關(guān)綜述總結(jié)了50 個(gè)已知功能的AS?FV 編碼蛋白[1-11]。近年來，相關(guān)研究取得了巨大進(jìn)展，所以本文將對(duì)目前已知功能的91 種ASFV 編碼蛋白及ASF 相關(guān)疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行歸納總結(jié)，以期為揭示ASFV 致病機(jī)制及ASF 疫苗開發(fā)提供相關(guān)信息。

1 ASFV病毒特性

1.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)

ASFV 是一種由多層同心結(jié)構(gòu)域組成的大型雙鏈DNA 病毒，外觀呈20 面體形態(tài)，平均直徑為220 nm[1-2]。ASFV 獨(dú)有的5 層結(jié)構(gòu)由內(nèi)而外分別為類核、核殼、內(nèi)囊膜、核衣殼、外囊膜。病毒的中心是由線性DNA 雙鏈裝配而成的類核，直徑為70～100 nm，包含病毒基因組和核蛋白，如DNA 結(jié)合蛋白p10 和pA104R，類核包含了合成和修飾早期所需的轉(zhuǎn)錄因子，其中包括多亞基RNA 聚合酶、帽狀酶和早期轉(zhuǎn)錄因子；類核的外層被核殼蛋白包裹，核殼是一層厚約30 nm 的蛋白質(zhì)層，該結(jié)構(gòu)域主要由聚蛋白pp220 和pp62 的加工產(chǎn)物以及pS273R 蛋白構(gòu)成[2]；核殼的外周附著一層脂質(zhì)包膜稱為內(nèi)囊膜，內(nèi)囊膜主要來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，蛋白p54[3]、p17[4]和pE248R[5]是其主要組成成分；內(nèi)囊膜的外層為核衣殼，衣殼的外觀為長13 nm、寬5～6 nm 的六角形棱柱狀，間距為7.4 nm，中間有一個(gè)中心孔[1]，蛋白p72和pE120R 是核衣殼的主要成分[6]；病毒顆粒的最外層為外囊膜，它是病毒通過質(zhì)膜出芽時(shí)獲得的[7]，有報(bào) 道稱p12[8]、CD2v（pE402R）[9]、p24[10]等均 定 位于外膜。

1.2 編碼蛋白

ASFV 基因共編碼151～167 個(gè)開放閱讀框（open reading frames，ORFs）。通過查閱NCBI的AS?FV基因文庫發(fā)現(xiàn)，目前ASFV 編碼的蛋白有159種，其中已知功能的有91 種，預(yù)測功能的有9 種，未知功能的有59 種。將這些已知功能的蛋白按其在感染宿主時(shí)發(fā)揮的作用可分為六類，分別是：病毒結(jié)構(gòu)蛋白及參與病毒形態(tài)發(fā)生的蛋白；參與病毒入侵的蛋白；病毒進(jìn)入細(xì)胞后參與病毒復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄的酶和因子；參與宿主機(jī)體免疫調(diào)控的蛋白；參與跨膜的蛋白以及多基因家族編碼的病毒蛋白[11]（圖1-2）。

圖1 ASFV編碼蛋白功能分類［12］

圖2 非洲豬瘟編碼蛋白分布

2 ASFV感染過程中的相關(guān)蛋白

ASFV 復(fù)制包括立即-早期-中期-晚期4 個(gè)階段。ASFV 主要依賴大胞飲、網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入巨噬細(xì)胞，然后沿微管系統(tǒng)被傳送至細(xì)胞核周圍，隨后進(jìn)入核開啟病毒復(fù)制，早期的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)分布在核周形成病毒工廠；病毒感染晚期，波形蛋白和線粒體包裹著病毒DNA、膜蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白和部分宿主蛋白被招募至病毒工廠，包裝形成的病毒粒子利用微管離開病毒工廠到達(dá)細(xì)胞膜，通過出芽的方式被釋放至細(xì)胞外（圖3）。

圖3 ASFV感染過程

2.1 ASFV復(fù)制過程

1）ASFV 吸附與入侵。ASFV 感染周期始于病毒吸附、入侵宿主細(xì)胞。由O61R 基因編碼的ASFV p12蛋白，是病毒感染晚期表達(dá)的內(nèi)膜蛋白；研究發(fā)現(xiàn)，純化的ASFV p12 蛋白與易感的Vero 細(xì)胞作用后能夠抑制ASFV 與Vero 的結(jié)合，表明p12 和ASFV能夠識(shí)別共同的細(xì)胞受體，p12介導(dǎo)ASFV與宿主細(xì)胞的吸附，但其發(fā)揮作用的機(jī)制還有待研究[13]。除p12外，由CP204L、E183L基因編碼的病毒早期膜蛋白ASFV p32、ASFV p54 以及由B646L 基因編碼的衣殼蛋白ASFV p72 均在病毒吸附和入侵易感細(xì)胞方面具有重要作用。Gomez-Puertas 等[14]發(fā)現(xiàn)，抗p72 和抗p54 的血清均能抑制約60%的ASFV 對(duì)Ve?ro 細(xì)胞和豬巨噬細(xì)胞的吸附；抗p32 血清盡管不能抑制病毒吸附，但能抑制95%病毒的入侵。由EP402R 基因編碼的ASFV CD2v 蛋白是病毒外膜蛋白，具有類似于黏附受體CD2 的結(jié)構(gòu)，所以能夠吸附具有CD2 配體的豬紅細(xì)胞[15]。此外，pEP153R 也參與了病毒趨向和吸附宿主細(xì)胞過程[16]。最近，Matamoros 等[17]發(fā)現(xiàn)定位在ASFV 內(nèi)膜、富含半胱氨酸多肽結(jié)構(gòu)的pE199L 蛋白，雖與病毒的結(jié)合、內(nèi)吞、裝配以及釋放無關(guān)，但在病毒與宿主細(xì)胞的膜融合以及病毒進(jìn)入細(xì)胞核的過程中起著重要作用。

2）ASFV 復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。與ASFV 的復(fù)制、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白大多是病毒自身合成的。參與DNA 復(fù) 制 的ASFV 蛋 白 有pF778R、pF334L、pF1055L、pG1211R、CP530、pK196R、pA104R、PCNA樣蛋白、泛素結(jié)合酶等。參與mRNA 轉(zhuǎn)錄的有RNA聚合酶類（pNP1450L、pEP1242L、pH359L、pD205R、pC147L 和pD339L 等），mRNA 修飾酶（甲基轉(zhuǎn)移酶pEP424R、加帽酶pNP868R 和多聚腺苷聚合酶pC475L 等）；轉(zhuǎn)錄因子pG1340L、解旋酶pD1133L 及含有解旋酶結(jié)構(gòu)域的pQ706L 和pB962L 等也可能參與ASFV 轉(zhuǎn)錄過程。ASFV 擁有一套由DNA 連接酶pNP419L、DNA X 型聚合酶、pO174L 和II 類脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶pE296R等組成的堿基修復(fù)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以糾正巨噬細(xì)胞激活的氧化反應(yīng)對(duì)病毒基因組造成的破損，保證病毒基因組的完整性[18]。ASFV 表達(dá)的復(fù)制高保真dUTP 酶pE165R 能夠在低dUTP 濃度下降低脫氧尿苷錯(cuò)配的概率，保證堿基配對(duì)的準(zhǔn)確性[19]。此外，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ還能夠應(yīng)對(duì)雙螺旋結(jié)構(gòu)在DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組時(shí)遇到的拓?fù)鋯栴}。大量的研究表明MGF360 基因?qū)Σ《荆ú灰欢ㄊ茿SFV）在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制是至關(guān)重要的，但最近Ramirez 等[20]通過刪除ASFV-Georgia（ASFVG）的MGF360-1L 構(gòu)建的重組病毒ASFV-G-Δ MGF360-1L，經(jīng)體外體內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)證明，MGF360-1L 對(duì)病毒毒力并不是必不可少的。同年，Ramirez等[21]又刪除ASFV-G 基因組中的X69R 基因構(gòu)建了ASFV-G-ΔX69R 重組病毒，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明刪除X69R基因?qū)Σ《緩?fù)制沒有顯著影響。

3）ASFV 組裝與釋放。pp220 和pp60 酶切產(chǎn)物以及pS273R 構(gòu)成的病毒核心層外包裹p17、p54 和p72 等內(nèi)膜蛋白組裝形成病毒粒子。成熟的病毒粒子依賴運(yùn)動(dòng)蛋白激酶和ASFV 衣殼蛋白，從病毒工廠運(yùn)動(dòng)到細(xì)胞膜，通過出芽的方式離開宿主細(xì)胞。

2.2 ASFV的免疫逃逸

ASFV 能夠表達(dá)多種免疫調(diào)節(jié)蛋白，抗衡宿主細(xì)胞的免疫系統(tǒng)和抗病毒機(jī)制，抑制宿主蛋白合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，為病毒的繁殖和擴(kuò)散提供有利條件。

1）ASFV 調(diào)控宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯。ASFV 能夠通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯達(dá)到抑制宿主的抗病毒免疫和促進(jìn)自身蛋白表達(dá)的目的，參與此過程的蛋白主要有pA238L 和pDP71L 等。pA238L 是ASFV早期表達(dá)蛋白，包含與IκB類似的錨蛋白重復(fù)序列，是病毒在巨噬細(xì)胞中復(fù)制的非必需蛋白；AS?FV pA238L 能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 與NFAT 的活化和促炎因子與免疫調(diào)控因子的分泌，還能下調(diào)iNOS 啟動(dòng)子活性抑制抗病毒反應(yīng)[22]。pDP71L 是AFSV 高度保守的晚期表達(dá)蛋白，位于ASFV 基因組的可變區(qū)；ASFV pDP71L 能夠招募蛋白磷酸酶1（protein phosphatase 1，PP1），促使真核翻譯因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）去磷酸化，從而促使病毒利用宿主表達(dá)系統(tǒng)大量合成所需蛋白；同時(shí)eIF2α 去磷酸化還能抑制peIF2α-ATF4-CHOP 信號(hào)通路的激活，抑制細(xì)胞凋亡，這有利于病毒的大量增殖[23]。

2）ASFV 調(diào)控宿主細(xì)胞信號(hào)通路。位于ASFV可變區(qū)的多基因家族主要包括MGF100、MGF110、MGF300、MGF360 和MGF505/530；其中MGF360 和MGF505/530 能夠抑制干擾素（interferon，IFN）和促炎因子的分泌，促使病毒的免疫逃逸[24]。MGF360家族成員pA276R 能夠抑制干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3，進(jìn)而抑制IFN-β 的 產(chǎn) 生；MGF505/530 家族成員pA538R 能夠同時(shí)抑制IRF3 和NF-κB，從而抑制IFN 的表達(dá)和JAK-ATAT 信號(hào)通路[25]。另外，ASFV編碼的其他蛋白也能夠通過抑制IFN 產(chǎn)生免疫逃逸。pI329L 是Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）家族同源蛋白，是ASFV 感染晚期表達(dá)的跨膜蛋白；ASFV pI329L 能夠通過抑制TLR 下游接頭蛋白的活性，阻斷IRF3、NF-κB的活化和下游基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制TLR3 介導(dǎo)的信號(hào)通路和IFN 的產(chǎn)生[25]。ASFV中國株pDP96R 也能抑制IFN 的產(chǎn)生和NF-κB 的活化[26]。

3）ASFV 調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡。ASFV 在感染初期能夠抑制宿主細(xì)胞凋亡，有利于病毒的大量增殖；在感染后期促進(jìn)宿主細(xì)胞凋亡，有利于病毒的釋放。ASFV 編碼的抑制凋亡的蛋白有pEP153R、pA224L、pA179L 和pDP71L，促進(jìn)凋亡的蛋白主要有p54。ASFV pEP153R 是與C 型凝集素具有同源性的凝集素類蛋白，在病毒感染早期和晚期均有表達(dá)；pEP153R能夠下調(diào)MHC-Ⅰ的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，并參與病毒感染細(xì)胞和病毒與血細(xì)胞的吸附過程[16]。pA224L 在ASFV 感染晚期表達(dá)，在不同毒株中同源率在九成以上；ASFV pA224L 能夠通過抑制TNF-α 誘導(dǎo)的Caspase 3 的激活從而抑制細(xì)胞凋亡[16]。pA179L 屬于Bcl-2 家族，在ASFV 感染早期和晚期均有表達(dá)；Bcl-2 家族蛋白能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡，由抑制細(xì)胞凋亡的Mcl-1、Bcl-2、Bcl-2、Bcl-XL等和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bad、Bak、Bax、Bid、bik 等組成；在多種細(xì)胞系中均證明ASFV pA179L 能夠與家族其他成員相互作用，抑制細(xì)胞凋亡[16]；此外，ASFV pA179L 能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，抑制饑餓誘導(dǎo)的自噬[27]。p54是ASFV的結(jié)構(gòu)蛋白，通過表達(dá)ASFV p54能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，ASFV 編碼的CD2v 具有抑制淋巴細(xì)胞增殖的功能[28]，ASFV L83L 能夠通過與IL-1β結(jié)合來破壞宿主先天免疫應(yīng)答[29]。

各國科學(xué)家仍在不斷解析其他未知功能的蛋白。病毒蛋白p285L 和pK145R 的豐度高、但功能未知，直到2019年被指出p285L是病毒DNA復(fù)制之前就表達(dá)的基因早期產(chǎn)物，pK145R 則表達(dá)于晚期；預(yù)測膜蛋白p285L 能夠定位于純化過的病毒顆粒內(nèi)，晚期蛋白pK145R 雖在病毒粒子里檢測不到，但卻能夠在感染的細(xì)胞中不斷積累，至于它們是否與病毒復(fù)制相關(guān)仍有待研究[30]。Ramirez 等[31]在2020年利用酵母雙雜交系統(tǒng)證明ASFV 的MGF360-16R基因編碼的轉(zhuǎn)錄晚期蛋白與SERTAD3 和SDCBP（參與核轉(zhuǎn)錄和宿主內(nèi)病毒裝運(yùn)的宿主蛋白）之間存在相互作用，但敲除MGF360-16R 構(gòu)建的重組病毒ASFV-G-MGF360-16R，無論在體內(nèi)外均表現(xiàn)出和親本ASFV-G 相似的毒力，說明MGF360-16R 基因與ASFV-G毒力無關(guān)。

3 ASFV疫苗

早在上世紀(jì)就有ASFV的報(bào)道，但由于ASFV龐大的基因組及其復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制，至今沒有研發(fā)出安全有效的疫苗。目前，ASF 相關(guān)疫苗主要包括滅活疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗和核酸疫苗等。

3.1 滅活疫苗

使用物理或化學(xué)的方法滅活變性ASFV，使其失去感染能力的同時(shí)保留免疫原性而制成ASF 滅活疫苗，這是一種傳統(tǒng)的疫苗制備方法。但迄今為止，各種滅活方式制備的ASFV 滅活苗均不能保護(hù)機(jī)體免受ASFV 強(qiáng)毒株的攻擊。Blome 等[32]利用二元乙炔亞胺（diacetylenimine，DEI）滅活病毒懸液得到的滅活苗，配以佐劑Polygen（TM）或Emulsigen（R）-D，免疫后能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗ASFV 特異性抗體，但沒有產(chǎn)生針對(duì)同源毒株的攻毒保護(hù)作用，可能是因?yàn)楫a(chǎn)生的抗體不能與ASFV 發(fā)生中和反應(yīng)。所以ASFV滅活疫苗還需要進(jìn)一步研究。

3.2 弱毒疫苗

利用自然選擇或人工的手段可篩選出毒力弱化的病毒株，從而制備成ASF 弱毒疫苗。弱毒苗具有免疫原性良好，抗體持續(xù)周期較長等優(yōu)點(diǎn)。目前，可將ASF 弱毒苗分為天然弱毒苗和人工弱毒苗。

自然界中存在毒力較弱的毒株，NH/P68 和OUR/T88/3 就是2 株ASFV 弱毒株。NH/P68 免疫后能夠增強(qiáng)豬自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）的活性，保護(hù)機(jī)體免受AFSV 強(qiáng)毒株L60 的攻擊[33]。OUR/T88/3 免疫后，能夠保護(hù)機(jī)體抵抗OUR/T88/1的攻擊，但這種保護(hù)作用會(huì)隨著CD8+T 淋巴的衰竭而減退[34]；后又發(fā)現(xiàn)用OUR/T88/3 首免，OUR/T88/1加強(qiáng)免疫的免疫方式免疫后的豬對(duì)強(qiáng)毒株Benin 97/1 和Uganda 1965 的攻擊具有保護(hù)作用，首次證明了誘導(dǎo)交叉免疫是可行的[35]。但天然弱毒苗仍具有傳染性和致病性，免疫動(dòng)物常會(huì)出現(xiàn)高熱、關(guān)節(jié)腫脹等癥狀，還可能出現(xiàn)免疫力低的動(dòng)物不耐受等[33,35]，這也是天然弱毒苗無法推廣的原因。

研究發(fā)現(xiàn)ASFV 能夠在豬源細(xì)胞系Vero、COS及MS等多種細(xì)胞傳代致弱。早在20世紀(jì)西班牙和葡萄牙學(xué)者就使用過傳代致弱的疫苗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫后的動(dòng)物出現(xiàn)了不同程度的ASF 癥狀，大量動(dòng)物死亡，存活下來的動(dòng)物也攜帶大量的ASFV，說明連續(xù)傳代制備ASFV弱毒疫苗的方法還有待研究。

以上2 種弱毒苗均存在安全性問題，不能用于ASF的防治，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，學(xué)者們利用分子生物學(xué)手段對(duì)病毒的結(jié)構(gòu)、毒力基因組成進(jìn)行修飾，從而降低其毒力。相較于天然弱毒苗和傳代弱毒苗，重組弱毒苗更為安全，更加適合于大范圍使用。O'Donnell 等[36]利用基因工程手段敲除了AS?FV Georgia 2007（ASFV- G）的9GL（B119L）和UK（DP96R）基因，制備了雙基因敲除重組病毒AFSVG-Δ9GL/ΔUK；重組病毒經(jīng)肌肉免疫豬后，結(jié)果顯示接種重組病毒的豬不會(huì)產(chǎn)生ASF 癥狀，并在接種后的2 周內(nèi)能夠針對(duì)高毒力的ASFV Georgia 2007提供保護(hù)作用。Monteagudo 等[37]發(fā)現(xiàn)免疫CD2v（EP402R）基因缺失的BA71 株的AFSV，能夠保護(hù)豬免受BA71 攻擊的同時(shí)抵御異源病毒的攻擊，包括Georgia 2007/1。這些疫苗雖然有效，但安全性仍需要繼續(xù)增強(qiáng)。

2020年，Gladue 等[38]在缺 失了9GL 基因ASFV（ASFV-G-Δ9GL）的基礎(chǔ)上又刪除了2 個(gè)參與發(fā)病的基因（編碼CD2v和C型凝集素樣病毒基因），構(gòu)建了2 種新的重組減毒活疫苗，即ASFV-G-Δ9GL/Δ CD2v 和ASFV-G-Δ9GL/ΔCD2v/ΔEP153R，結(jié)果顯示，ASFV-G-Δ9GL/ΔCD2v/ΔEP153R 能夠顯著降低ASFV的體外復(fù)制活性，但2種重組病毒并不能使家豬產(chǎn)生針對(duì)同源病毒株ASFV-Georgia 的攻毒保護(hù)作用。同年，Borca 等[39]將敲除了1177L 基因的AS?FV-G 經(jīng)肌肉注射后發(fā)現(xiàn)，重組病毒能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的病毒特異性抗體反應(yīng)，感染豬發(fā)生了很低水平的病毒血癥；同時(shí)，ASFV-G-Δ117L 能保護(hù)機(jī)體免受ASFV-G 的攻擊，且在低劑量時(shí)仍能為機(jī)體提供保護(hù)。

3.3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是通過ASFV 抗原蛋白誘導(dǎo)的特異性免疫反應(yīng)保護(hù)機(jī)體免受病毒的攻擊，ASFV 編碼的蛋白種類繁多，常以組合抗原進(jìn)行免疫，但目前還未發(fā)現(xiàn)特效的保護(hù)性抗原或抗原組合。表達(dá)重組ASFV p12 蛋白能夠抑制ASFV 與Vero 的結(jié)合[13]，ASFV p32、p54、p72 抗體能夠中和ASFV，抑制病毒吸附及內(nèi)化[14]。Borca 等[39]利用人胚胎腎細(xì)胞293（human embryonic kidney cell 293，HEK293）表達(dá)的ASFV B646L（p72）、E183L（p54）和O61R（p12）以及MVA 載體 表達(dá) 的 抗原B646L、EP153R 和EP402R（CD2v），免疫豬后發(fā)現(xiàn)，HEK293制備的抗原蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，但細(xì)胞免疫應(yīng)答較弱；而MVA 載體抗原則能誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IFN-γ。2020年的一項(xiàng)研究表明，將豬的免疫球蛋白IgG1或IgA1 Fc片段與ASFV 的p30或p54基因融合[40]，構(gòu)建能夠表達(dá)融合蛋白p30-Fcγ和p54-Fcα的重組釀酒酵母，重組酵母免疫后能夠刺激家豬產(chǎn)生p30/p54特異性抗體和較高水平的黏膜免疫[41]。

3.4 病毒活載體疫苗

大量研究表明，在ASFV 的防治過程中，細(xì)胞免疫和體液免疫均扮演了重要角色[42-43]。Lokhandwala等[42]構(gòu)建的能夠表達(dá)ASFV p32、p54、pp62 和p72 的重組腺病毒表達(dá)載體免疫后，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的高水平的特異性體液、細(xì)胞免疫應(yīng)答以及細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)；后又構(gòu)建了表達(dá)A151R、B119L、B602L、EP402RΔPRR、B438L、K205R 和A104R 的重組腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，并與佐劑混合免疫豬后發(fā)現(xiàn)，機(jī)體分泌了高水平的抗ASFV 特異性IgG 以及IFNγ[43]。雖病毒活載體ASFV 疫苗能夠同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但仍需大量實(shí)驗(yàn)證明疫苗的安全性和有效性。

3.5 核酸疫苗

核酸疫苗是選擇AFSV 保護(hù)性抗原基因，與表達(dá)載體連接構(gòu)建能夠表達(dá)ASFV 抗原基因的重組表達(dá)質(zhì)粒。Lacasta 等[44]構(gòu)建了包含4 029 個(gè)克隆，大小約130 kb 的ASFV DNA文庫，覆蓋了76% 的Ba71V 株基因，用該文庫免疫豬后發(fā)現(xiàn)，約6 成的豬能夠抵御ASFV 強(qiáng)毒株E75 的攻擊，在存活豬中能夠檢測到CD8+T含量升高。核酸疫苗存在的問題也是無法提供對(duì)ASFV 全面的保護(hù)，所以尋找保護(hù)效果好的抗原或抗原組合仍是ASF防治的關(guān)鍵。

4 結(jié) 語

近年來，隨著對(duì)ASFV 編碼蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究的不斷深入，ASFV 的結(jié)構(gòu)和感染過程逐漸清晰。但由于ASFV 基因組數(shù)量巨大，免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜，病毒致病機(jī)理仍不清楚。目前，還沒有能夠直接消滅ASFV 的特效藥，所以除了加強(qiáng)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境的消毒外，疫苗是阻斷病毒傳播的重要防治手段。目前，ASF滅活苗保護(hù)效果差，弱毒苗存在毒力返強(qiáng)和擴(kuò)大病毒傳播等安全問題；所以亞單位疫苗、病毒活載體疫苗、核酸疫苗在ASF 防治過程中具有巨大的應(yīng)用潛力，但現(xiàn)仍未開發(fā)出一款兼具安全和免疫效果好的疫苗。主要存在的問題就是ASFV 中具有良好免疫原性的保護(hù)性抗原或抗原組合仍未找到，所以還需進(jìn)一步研究ASFV 的基因組，明確其編碼蛋白，理清其感染過程及傳播機(jī)制，以期為ASF 的防治提供理論依據(jù)。