4859枚非優(yōu)質(zhì)胚胎和廢棄胚胎囊胚培養(yǎng)的臨床觀察

曹曉敏 劉 麗 邸建永 劉 燁 徐鳳琴

天津市第一中心醫(yī)院(300192)

在不孕癥患者的體外受精-胚胎移植(IVF-ET)治療周期中，僅有少數(shù)胚胎具有可利用價值，50%以上的胚胎因發(fā)育異常而被丟棄。如何從大量廢棄胚胎和不夠冷凍標準的胚胎中挑選出有發(fā)育潛能的胚胎，提高其利用率，僅見數(shù)篇小樣本回顧性報道[1-4]。為探討廢棄胚胎和新鮮周期移植后不夠冷凍標準胚胎的發(fā)育潛能及繼續(xù)培養(yǎng)形成囊胚移植后的臨床結(jié)局，本文收集廢棄的和新鮮周期移植后不夠冷凍標準的D3胚胎行囊胚培養(yǎng)的數(shù)據(jù)，分析囊胚形成情況，將形成的可利用囊胚冷凍保存，凍融周期與移植凍融D3的胚胎進行比較，分析其臨床利用價值。

1 對象和方法

1.1 研究對象

收集本院2014年10月-2019年2月行IVF-ET及卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)周期廢棄和部分非優(yōu)質(zhì)胚胎，按照表1的標準進行胚胎評分并行囊胚培養(yǎng)[5]。本研究經(jīng)本院倫理委員會討論批準，所有患者均簽署“自愿將廢棄胚胎用于科學研究的知情同意書”。

表1 卵裂期胚胎分級標準[5]

1.2 相關定義

①廢棄胚胎：第3天(D3)Ⅲ+～Ⅳ級胚胎。②非優(yōu)質(zhì)胚胎：D3卵裂球數(shù)目≥10個或≤6個的Ⅰ～Ⅲ級胚胎。③卵裂期胚胎冷凍標準：D3卵裂球數(shù)7～9個，Ⅰ～Ⅱ+級胚胎，優(yōu)質(zhì)胚胎標準：D3卵裂球數(shù)7～9個，Ⅰ～Ⅱ級胚胎。④冷凍囊胚標準：第5天(D5)或第6天(D6)的3期以上，內(nèi)細胞團或滋養(yǎng)層評分為B級以上的囊胚。⑤優(yōu)質(zhì)囊胚：D5或D6的3期以上，內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層評分為B級或A級的囊胚。

1.3 培養(yǎng)方法

囊胚培養(yǎng)液(G2 plus,瑞典 Vitrolife 公司產(chǎn)品)在35mm的培養(yǎng)皿中制作30μl的微滴，覆蓋礦物油，置于37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中平衡過夜。將D3廢棄的胚胎和移植后不夠冷凍標準的胚胎在囊胚培養(yǎng)液中漂洗后，轉(zhuǎn)移至新鮮的囊胚培養(yǎng)微滴中培養(yǎng)至D5～D6，觀察記錄胚胎的發(fā)育情況，囊胚的評分依據(jù)Gander分級法[6-7]。

1.4 囊胚的冷凍和復蘇

囊胚的冷凍和復蘇按照玻璃化冷凍試劑盒和玻璃化凍融試劑盒(KITAZATO,日本)說明書操作。凍融囊胚存活的標準為凍融培養(yǎng)2h觀察到囊胚腔的擴張。

1.5 凍融胚胎移植

取卵周期移植未孕患者行凍融周期，復蘇D3廢棄和部分非優(yōu)質(zhì)胚胎未達到冷凍標準的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)形成的囊胚和D3可利用的胚胎(冷凍、復蘇方法相同)進行移植，移植后28d，超聲觀察到胚芽及孕囊即為臨床妊娠，記錄孕囊個數(shù)、流產(chǎn)情況(超聲觀察到妊娠囊后到不滿28周前妊娠結(jié)束)，持續(xù)妊娠者隨訪至分娩。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布計量資料比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用卡方檢驗或fisher確切概率檢驗。多組比較有統(tǒng)計學差異時進行組間兩兩比較，并采用Bonferroni方法進行多重檢驗校正。采用logistic回歸進行多因素回歸分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 囊胚形成情況

收集1195個取卵周期廢棄的D3胚胎和移植術后不夠冷凍標準的非優(yōu)質(zhì)胚胎共計4859枚，使用G2序貫微滴培養(yǎng)至D5～D6，共形成囊胚2020枚，總囊胚形成率41.6%(2020/4859)，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率32.7%(661/2020)。其中培養(yǎng)廢棄胚胎2345枚，囊胚形成率18.3%(430/2345)，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率15.1%(65/430)。培養(yǎng)移植術后不夠冷凍標準的非優(yōu)質(zhì)胚胎2514枚，囊胚形成率63.2%(1590/2514)優(yōu)質(zhì)囊胚形成率37.5%(596/1590)。本研究進行多組率比較時采用了Bonferroni多重檢驗校正，校正后的檢驗水準α’=0.05/6=0.0083。廢棄胚胎的囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率均低于非優(yōu)質(zhì)胚胎組。不孕類型、受精方式不同患者優(yōu)質(zhì)囊胚形成率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。但囊胚形成率隨患者年齡增加減低，年齡>35歲患者囊胚形成率明顯減低(P<0.05)。見表2 。

表2 不同來源胚胎培養(yǎng)后囊胚和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率比較

2.2 卵裂數(shù)及胚胎分級與囊胚形成情況

以是否形成囊胚作為應變量，以卵裂球數(shù)和胚胎分級為自變量做logistic回歸分析，結(jié)果提示與卵裂球數(shù)≥10個相比，卵裂球數(shù)7～9個時形成囊胚的概率為0.893(95%CI 0.602～1.325)，而卵裂球數(shù)4～6個時，則為0.572(95%CI 0.393～0.831)。與Ⅰ～Ⅱ級胚胎相比，Ⅱ+～Ⅲ胚胎形成囊胚的概率為0.737(95%CI 0.578～0.941)，而Ⅲ+級胚胎為0.750(95%CI 0.456～1.235 )，而Ⅳ級胚胎為0.471(95%CI 0.350～0.634)。

2.3 卵裂球數(shù)和胚胎分級與優(yōu)質(zhì)囊胚形成情況

在2020個形成囊胚的胚胎中，以是否形成優(yōu)質(zhì)囊胚作為因變量，以卵裂球數(shù)和胚胎分級為自變量做logistic回歸分析，結(jié)果提示與卵裂球數(shù)≥10個相比，7～9個時形成囊胚的概率為0.725(95%CI 0.598～0.896)，4～6個時為0.498(95%CI 0.396～0.628)。與Ⅰ～Ⅱ級胚胎相比，Ⅱ+～Ⅲ級胚胎形成囊胚的概率為0.442(95%CI 0.365～0.536)，Ⅲ+級胚胎為0.155(95%CI 0.070～0.344)，Ⅳ級胚胎為0.150(95%CI 0.074～0.304)。

2.4 集合培養(yǎng)胚胎的數(shù)目與囊胚形成情況

每個微滴培養(yǎng)胚胎數(shù)目不同囊胚形成率有統(tǒng)計學差異(P=0.023)。每個微滴培養(yǎng)1枚胚胎優(yōu)質(zhì)囊胚形成率16.3%，與每個微滴培養(yǎng)2、3、4、7個胚胎相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 集合培養(yǎng)不同胚胎數(shù)與囊胚和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率比較(%)

2.5 移植情況

405個凍融周期移植中取卵周期移植未孕患者中行凍融D3可利用胚胎移植204個(D3胚胎組)，廢棄的D3胚胎和不夠冷凍標準的非優(yōu)質(zhì)胚胎形成的囊胚解凍移植201個(胚囊組)。兩組患者年齡、不孕類型、內(nèi)膜準備方案及子宮內(nèi)膜的厚度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。D3胚胎移植數(shù)多于囊胚移植數(shù)(P<0.05)。D3優(yōu)質(zhì)胚胎移植數(shù)多于優(yōu)質(zhì)囊胚移植數(shù)(P<0.05)。D3胚胎與囊胚凍融移植周期妊娠率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。但D3胚胎著床率低于囊胚組(P=0.026)。兩組的流產(chǎn)率、雙胎率、單卵雙胎率、出生嬰兒體重及出生畸形率也均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表4。

表4 D3胚胎和囊胚凍融移植周期患者一般情況及臨床結(jié)局比較

3 討論

在不孕患者IVF-ET治療周期中，絕大多數(shù)生殖中心選擇D3胚胎移植或冷凍保存，根據(jù)目前人類輔助生殖技術胚胎培養(yǎng)室采用的定點形態(tài)學評分方法，卵裂期有>50%的胚胎因發(fā)育異常最終被廢棄，如何從大量廢棄胚胎和不夠冷凍標準的胚胎中識別有發(fā)育潛能的胚胎，提高其利用率，尚需大量臨床數(shù)據(jù)證實。

本研究分析本中心1195個取卵周期中廢棄的4859枚D3胚胎和不夠冷凍標準的非優(yōu)質(zhì)胚胎進行囊胚培養(yǎng)和移植的結(jié)果提示，患者的不孕類型和受精方式不影響優(yōu)質(zhì)囊胚的形成。患者年齡、胚胎分級、卵裂球數(shù)目和囊胚培養(yǎng)方法影響囊胚的形成。凍融移植周期解凍培養(yǎng)的囊胚和正常的D3胚胎臨床結(jié)局沒有差別。

目前囊胚培養(yǎng)方法多采用微滴法集合培養(yǎng)，即將發(fā)育速度相近的胚胎置于1個微滴進行培養(yǎng)，充分利用其自分泌和旁分泌因子相互促進發(fā)育[8]。本研究根據(jù)每個微滴培養(yǎng)胚胎數(shù)目不同分成7組，不同組囊胚形成率差異雖有統(tǒng)計學意義(P=0.023)。每個微滴培養(yǎng)1枚胚胎組優(yōu)質(zhì)囊胚形成率與每個微滴培養(yǎng)2、3、4、7枚胚胎組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但與每個微滴培養(yǎng)5、6枚胚胎組相比差異無統(tǒng)計學意義?？赡苁怯捎诿總€患者用于培養(yǎng)的胚胎數(shù)目不定，無法嚴格的做到發(fā)育速度相近的胚胎共培養(yǎng)，質(zhì)量差與質(zhì)量佳胚胎混合培養(yǎng)可能掩蓋了7組囊胚形成率的差異。文獻報道[9-10]，集合培養(yǎng)更容易耗竭培養(yǎng)液中的營養(yǎng)，另外質(zhì)量差的胚胎分泌的因子釋放到培養(yǎng)液中對其他胚胎生長也會產(chǎn)生負面影響。本研究結(jié)果提示：集合培養(yǎng)除相互促進發(fā)育外，不排除質(zhì)量差胚胎分泌物質(zhì)對胚胎發(fā)育的阻礙作用。

本研究對患者年齡分組比較其囊胚形成情況，患者年齡<35歲各組囊胚形成率沒有差異，35歲后囊胚形成率顯著減低，36～40歲囊胚形成率34.7%，年齡>40歲的患者囊胚形成率僅有15.4%。與文獻報道一致[11-12]。眾所周知，隨著年齡增加女性生育潛能降低，女性35歲后卵巢功能急劇衰退，卵子和胚胎質(zhì)量下降，妊娠率降低，流產(chǎn)率增加，胚胎染色體異常發(fā)生風險增加，文獻報道高齡女性非整倍體胚胎比例較年輕女性高5倍[13-15]。本研究>35歲患者囊胚形成率減低可能與胚胎質(zhì)量較差有關。但本研究優(yōu)質(zhì)囊胚形成率各組沒有明顯差異，有悖現(xiàn)有論點，原因目前還不清楚，有待于積累更多的數(shù)據(jù)進一步分析。

胚胎分級和卵裂球數(shù)對囊胚形成的影響，本研究Ⅰ-Ⅱ級胚胎培養(yǎng)后囊胚和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率最高，如果Ⅰ～Ⅱ胚胎培養(yǎng)后囊胚形成的概率為1，那么Ⅱ+～Ⅲ級胚胎囊胚形成概率為0.737，Ⅲ+和Ⅳ胚胎囊胚形成概率0.750和0.471。表明囊胚的形成與胚胎分級密切相關，Ⅰ～Ⅱ級胚胎更容易形成囊胚和優(yōu)質(zhì)囊胚。在不孕癥患者的輔助生殖治療過程中有少數(shù)患者因為胚胎質(zhì)量差而放棄移植，本研究表明Ⅳ級胚胎有0.471的概率形成囊胚和0.150的概率形成優(yōu)質(zhì)囊胚，且目前已有Ⅳ級胚胎凍融周期妊娠的病例，因此廢棄胚胎的囊胚培養(yǎng)可以最大限度的提高胚胎的利用率。研究發(fā)現(xiàn)，卵裂球數(shù)目≥7個的D3胚胎更容易發(fā)育成優(yōu)質(zhì)囊胚[16]。本研究也得出類似的結(jié)論，不同的是筆者培養(yǎng)的是廢棄的D3胚胎和非優(yōu)質(zhì)胚胎，卵裂球數(shù)目≥10個的D3胚胎囊胚形成率和優(yōu)質(zhì)囊胚形成率最高，卵裂球數(shù)目7～9個次之，4～6個明顯降低。因此可推測，為避免盲目大量培養(yǎng)造成不必要的工作量和培養(yǎng)箱的緊張，卵裂球數(shù)目≤4個的D3胚胎沒有囊胚培養(yǎng)的必要。

本文比較了取卵周期移植未妊娠患者行凍融胚胎移植周期中復蘇的D3胚胎和復蘇囊胚的臨床結(jié)局，結(jié)果在移植囊胚數(shù)和優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)明顯少于D3胚胎的前提下，兩組妊娠率、流產(chǎn)率、雙胎率、單卵雙胎率、出生嬰兒男女比例、出生嬰兒體重及出生畸形率均無明顯差異；移植囊胚組的著床率高與移植D3胚胎組(P=0.026)。此數(shù)據(jù)顯示出囊胚移植的優(yōu)勢。因此在IVF/ICSI周期中D3胚胎可利用數(shù)目充足的情況下，可考慮選擇行囊胚培養(yǎng)，形成可利用囊胚冷凍保存，再擇期解凍移植。

綜上所述，本研究證實：①部分廢棄的D3胚胎繼續(xù)培養(yǎng)有形成優(yōu)質(zhì)囊胚的潛能。②不孕類型、受精方式不影響優(yōu)質(zhì)囊胚的形成。③集合培養(yǎng)有利于囊胚的形成，其中胚胎的質(zhì)量而不是胚胎的數(shù)量影響囊胚和優(yōu)質(zhì)囊胚的形成。④D3胚胎級別越高、卵裂球數(shù)目越多越易形成囊胚。