基于高通量芯片對小兒流感生物信息學分析

金 虹，李曉嵐

(泰康同濟(武漢)醫(yī)院 兒科, 湖北 武漢 430050)

急性呼吸道感染是兒童最常見的疾病，流感病毒是常見病原之一。學齡前兒童流感病毒感染率較高。通常認為流感是一種輕微的疾病，但是在有潛在慢性疾病的兒童中，可能會導致較高的病死率。眾所周知，流感病毒可引起季節(jié)性暴發(fā)、流行和大流行。20世紀曾有4次流感大流行，據報道，1918年第一次流行的H1N1流感病毒感染了全世界5億人，導致5 000萬至1億人死亡，占世界人口的3%～5%。2009年的豬源性H1N1毒株也造成全球約17 000人死亡[1]。流感病毒屬于正黏病毒科的RNA病毒，有3種類型(A型、B型和C型)，分段的病毒基因組被包裹在一個含脂質的表面包膜中，其表面有2種主要的表面抗原：血凝素(hemagglutinin, H)和神經氨酸酶(neuraminidase, N)。流感病毒的亞型是由這些H和N抗原決定的。A型病毒有許多亞型，它們具有不同的H和N抗原組合(例如H1N1、H3N2、H5N1), B型和C型病毒沒有已知的亞型[2]。A型病毒能感染多種物種(人、禽、豬、馬)，且其抗原不穩(wěn)定，已知可在病毒基因組內發(fā)生突變(抗原轉移)，人群對此沒有免疫力，尤其是嬰幼兒，每一次的流感病毒株都屬于新抗原，且很容易在人與人之間傳播，造成疾病爆發(fā)和大流行。小兒是流感病毒的易感人群，6個月以下小兒因為母乳的被動免疫而較少感染本病，6個月至3歲兒童是流感病毒感染的高危人群，重癥流感占比較高。年長兒童感染流感病毒與成人相似，主要臨床表現為急性發(fā)熱、寒戰(zhàn)、流鼻涕、咳嗽、咽喉痛、頭痛和肌痛，重癥患者可繼發(fā)中耳炎、鼻竇炎、敗血癥、心肌炎和腦炎等，而嬰幼兒流感癥狀不典型[3]。當前對流感的診斷主要依靠病史、臨床癥狀及相關流行病學資料，而病毒核酸及抗體的檢查又往往滯后，即便對于一個經驗豐富的臨床醫(yī)生來說，對伴有發(fā)熱的呼吸道疾病患兒做出病因診斷仍是非常困難的。因此，我們需要進一步了解流感病毒的發(fā)病機制和機體對應的生物學改變，篩選出可能的臨床標志物，為早期臨床診斷及防控決策提供新的參考標準?；谏镄畔W的發(fā)展和高通量測序技術的進步，本研究利用現有的基因芯片數據庫對流感患者和正常人的差異基因(differential gene, DEG)進行分析，闡述新的發(fā)病機制，為臨床的診療和疾病預防提供新的依據及方法。

1 資料與方法

1.1基因芯片數據的獲取 以“influenza”，“children”，“pediatrics”為關鍵檢索詞，在基因表達數據庫(gene expression database, GEO)搜索兒童流感病毒感染相關數據庫。最終共檢索到相關的GSE42026，GSE29366，GSE34205，GSE38900等4個芯片數據庫。

1.2DEG的篩選 通過基因分析表達工具(GEO2R)對正?；颊吆土鞲胁《靖腥净颊咄庵苎狣EG進行篩選，篩選條件：P<0.05且LogFC>1或LogFC<-1。對DEG繪制火山圖，同時繪制韋恩圖對DEG進行取交集分析。

1.3DEG的功能富集分析 對所有的DEG進行大規(guī)模的基因本體(gene ontology, GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)分析，分析DEG所富集的相關信號通路。GO分析主要包括細胞成分、分子功能以及生物過程。

1.4DEG的蛋白互作分析 將DEG輸入String 12.0在線網站進行蛋白互作網絡分析。然后，將蛋白網絡互作數據庫導入Cytoscape進行數據分析，采用Cyto-Hubba插件分析蛋白質相互作用網絡關聯度，篩選出樞紐基因。

2 結 果

2.1DEG篩選 GSE42026數據庫上調基因344個，下調基因418個，GSE29366數據庫上調59個，下調312個，GSE34025數據庫上調37個，下調93個，GSE38900數據庫上調47個，下調276個。對所有DEG進行匯總分析，發(fā)現共同上調基因1個，共同下調基因29個，見表1～2，圖1～2。

圖1 DEG篩選分析

表1 4組數據庫一般情況

表2 DEG的基因篩選情況

2.2GO和KEGG富集分析 對DEG進行GO分析發(fā)現，在生物學過程方面主要富集在Ⅰ型干擾素信號通路，細胞對Ⅰ型干擾素的反應、病毒基因組負調控和干擾素-γ介導信號通路，見圖3，表3。分子功能主要包括2′-5′-寡聚腺苷酸合成酶(2′-5′-oligoadenylate synthase, OAS)活性、雙鏈RNA結合物、轉移酶以及核苷酸轉移酶活性，細胞成分主要包括線粒體、細胞外間隙、胞外區(qū)、溶酶體及細胞質，見圖4。KEGG分析主要富集在甲型流感、麻疹、單純皰疹病毒感染、丙型肝炎信號通路，見表4，圖5。

表3 兒童流感患者DEG的GO富集分析

表4 兒童流感患者DEG的KEGG通路分析

圖2 DEG基因篩選過程

圖3 DEG的GO富集分析

圖4 DEG的GO分析：BP-生物學過程、CC-細胞組分和MF-分子功能

圖5 兒童流感患者DEG的KEGG通路分析

2.3蛋白互作網絡圖 通過STRING數據庫對兒童流感發(fā)病的DEG構建PPI網絡，見圖6。應用 Cytoscape 將蛋白網絡可視化，Cyto-Hubba 插件根據節(jié)點數篩選出前10個樞紐基因，分別是：IFIT3、MX1、OAS3、OAS2、OAS1、IFI27、IFI44、RSAD2、IFI44L、LY6E，顏色越深代表節(jié)點數越多，見圖7。

圖6 靶基因PPI網絡關系

圖7 前10樞紐基因關系

3 討 論

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染性疾病，可在全世界范圍內暴發(fā)和流行。在兒童中，流感是導致急性呼吸道疾病最常見原因之一。其主要是通過受感染者的飛沫或直接與人或寄生蟲接觸傳播流感病毒，臨床表現與其他病毒導致的呼吸性疾病的臨床癥狀相似，包括急性發(fā)熱、發(fā)冷、流鼻涕、咳嗽、疥瘡、頭痛和肌痛。目前臨床主要依靠病毒培養(yǎng)、鼻咽拭子RT-PCR或血液中的特異性中和抗體來完成確診，且其陽性率低，往往需要患者住院幾天后才能進行確診，缺乏早期特異性診斷標志物。同時患兒感染流感病毒可從輕微表現發(fā)展到重癥流感和急性呼吸窘迫綜合征，呼吸衰竭甚至死亡[4]。當前對流感病毒感染患兒的治療主要是以廣譜抗病毒為中心的支持治療，缺乏高效特異性窄譜藥物，且隨著病毒不斷突變，耐藥株也不斷增加，因此進一步明確流感病毒感染機制，更好地理解病毒與宿主的相互作用，篩選出流感病毒感染的標志物至關重要。

基于高通量生物信息學技術，本研究利用GEO，對流感患者和正常健康兒童外周血總RNA表達譜數據進行分析，通過對4個數據庫相同基因取交集進行分析發(fā)現差異表達的基因30個，其中上調基因1個，下調基因29個。通過對DEG進行富集分析發(fā)現，流感患兒細胞對干擾素的反應、病毒基因組負調控和干擾素-γ介導信號通路發(fā)生明顯改變。干擾素是體內重要抗病毒因子，當流感病毒進入細胞時，病原體識別受體(pathogen recognition receptors, PRRs)檢測病毒RNA(vRNA)，并啟動干擾素基因的轉錄。干擾素轉錄后，介導干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs)的表達或通過旁分泌時在鄰近非感染細胞中的表達[5]。ISGs可以阻止病毒包膜和內質體膜之間的融合，促進蛋白降解，抑制流感病毒的轉錄和翻譯，激活細胞抗病毒基因表達。線粒體作為哺乳動物天然抗病毒信號轉導的平臺，通過線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS)和MAVS的激活改變線粒體形態(tài)。線粒體動力學、物理性質以及由此引起的MAVS分布和聚集的變化在調節(jié)先天免疫反應中起著重要作用[6]。線粒體伸長和融合促進MAVS聚集成活性復合體，而線粒體的分裂和裂變削弱了維甲酸誘導基因Ⅰ(RIG-I)樣受體(retinoic acid-inducible gene I [RIG-I]-like receptors，RLR)信號通路[7]。研究發(fā)現甲型流感病毒M2蛋白與MAVS共定位并相互作用，正調控MAVS介導的先天免疫，促進線粒體融合，增加線粒體數量。進一步的研究表明，M2蛋白誘導活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生是激活巨自噬/自噬和增強MAVS信號通路所必需。重要的是，M2蛋白的質子通道活性是ROS產生和拮抗自噬途徑以控制MAVS聚集所必需，從而增強MAVS信號活性[8]。KEGG分析主要富集在甲型流感、麻疹、單純皰疹病毒感染、丙型肝炎信號通路，提示流感病毒和其他病毒存在相似的感染途徑。

干擾素是一類細胞因子，在機體固有免疫和調節(jié)性免疫過程中有重要作用，主要是通過調節(jié)Janus激酶-信號轉導子和轉錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK-STAT)信號通路并促進ISGs的表達來實現，其中三角形四肽重復蛋白(interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats, IFIT)是ISGs中最有效的蛋白之一。IFIT3又叫維甲酸誘導基因G(retinoic acid-induced G, Rig-G)，最初是在維甲酸處理急性早幼粒白血病細胞的時候被發(fā)現的。除了維甲酸之外，IFIT3還能在各種造血細胞或者實體瘤細胞中被干擾素誘導表達，例如頭頸癌細胞、肺小細胞癌細胞、宮頸癌細胞以及上皮樣的WISH細胞[9]。研究發(fā)現干擾素治療導致乙型肝炎患者IFIT3明顯升高，而肝細胞的病毒感染也導致干擾素非依賴性IFIT3的直接上調。某些ISGs在乙型肝炎病毒(HBV)感染中的相反作用，提示IFIT3可能是治療HBV感染的一個新靶點。并且IFIT3的表達是接受干擾素治療患者預后的重要標志，IFIT3高表達與患者的預后相關[10]。動物研究中豬四肽重復序列3干擾素誘導蛋白(porcine interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3, poIFIT3)是干擾素-α/β和豬流感病毒(swine influenza virus, SIV)最易誘導的基因之一。感染SIV的豬肺泡巨噬細胞(porcine alveolar macrophages, PAM)中poIFIT3上調，過度表達能有效抑制SIV的復制，而poIFIT3的抑制作用增加了SIV的復制。進一步的實驗表明，poIFIT3的C端在其抗病毒活性中起主要作用。此外，poIFIT3可通過IRF3和NF-κB介導的信號通路顯著增強干擾素-β啟動子活性, 通過靶向MAVS增強干擾素-β的產生[11]。

Mx基因是Lindenmann[12]研究A2G小鼠對流感病毒具有天然抵抗力這一現象時發(fā)現的，能抵抗黏液病毒而命名為Mx基因。Mx基因的表達受Ⅰ型干擾素介導(干擾素α/β)調節(jié)。Mx屬于GTPase動力蛋白超家族成員，具有GTPase活性，內在GTP酶活性是其抗病毒活性所必需的。Mx蛋白在大多數脊椎動物中高度保守，人MxA與小鼠Mx1具有約67%的氨基酸序列同源性。大約50年前，干擾素誘導的Mx1基因在小鼠體內, 是流感病毒的有效限制因子。攜帶功能性Mx1基因組的小鼠對甲型流感病毒感染具有抵抗力。由于Mx1是病毒復制的重要細胞內調節(jié)因子，Mx1缺乏會增加小鼠對流感感染的易感性。Mx蛋白的亞細胞定位影響其抗病毒活性。嚙齒動物Mx1位于細胞核中并限制病毒復制，而人類Mx位于細胞質中并通過阻止病毒RNA的導入來限制病毒復制，這種蛋白的缺乏增強了對流感病毒的易感性[13]。且研究發(fā)現人類Mx對Thogoto病毒、水泡性口炎病毒等多種病毒發(fā)揮抑制作用，本研究發(fā)現流感患兒體內Mx1表達降低，因此，Mx1可能是抗流感治療的另一個有效靶點。

OAS是受干擾素誘導的蛋白家族，屬于保守雙鏈RNA結合分子家族，其N端能夠結合dsRNA結合域。在機體正常情況下，OAS靜止在細胞中以低水平存在，在干擾素作用時能被強烈誘導。核糖核酸酶L是一種在感染過程中被激活的抗病毒酶，能降解病毒和細胞內的核糖核酸酶，抑制蛋白質合成，限制多種病毒的復制和傳播[14]。在人類中，有4個OAS基因是由干擾素刺激產生的，但其中只有3個編碼有催化活性的蛋白質。OAS1、OAS2和OAS3分別包含1個、2個和3個核心OAS單元，但這3種酶在與dsRNA結合時都從ATP合成2′-5′-寡聚腺苷酸(2′-5′-oligoadenylate，2-5A)。2-5A唯一確定的功能是激活核糖核酸酶L，引起病毒和細胞ssRNAs的內切核裂解，從而阻斷病毒復制，但在完整細胞中，OAS3對dsRNA的親和力高于OAS1或OAS2，這與它在核糖核酸酶L激活中的主導作用相一致[15]。

在OAS基因家族中，干擾素可以顯著誘導OAS2高表達。在細菌感染過程中，OAS2增強RNA水解酶L活性，誘導先天免疫的活化[16]。病毒感染患者和干擾素治療后OAS2的表達水平升高[17]。此外，發(fā)現OAS2可抑制日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)和其他病理性分子模式識別受體(pathogen-associated molecular patterns recognition receptors PRRSV)相關病毒的復制，寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)感染誘導OAS2表達，OAS2通過干擾素激活的JAK/STAT信號通路發(fā)揮抗ZIKV活性[18]。OASl基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與一些病毒感染性疾病易感性之間存在相關性，如SARS病毒、西尼羅河病毒、腸道病毒等。另外干擾素誘導蛋白27(interferon-induced-protein 27, IFI27)、干擾素誘導蛋白44 (interferon-induced protein 44, IFI44)、以及干擾素誘導蛋白44樣蛋白(interferon-induced-protein 44-like, IFI44L)均為干擾素誘導相關蛋白，參與病毒感染后免疫反應，且研究報道IFI27可以作為鑒別流感病毒感染和細菌感染的標志物，其特異度高達90%[19]。

綜上所述，流感病毒感染導致機體發(fā)生以干擾素為中心的一系列信號通路改變可能是小兒流感的主要發(fā)病機制，有可能為臨床提供新的治療靶點。