青海湖裸鯉幼魚熱激蛋白60基因克隆及其在碳酸鹽堿度脅迫下的表達

劉一萌，包 錟，李 航，么宗利，孫 真，高鵬程，周 凱，王 菲，來琦芳

（中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點實驗室，上海 200090）

青海湖位于我國西北部，地處有著“世界屋脊”之稱的青藏高原東北角［1－2］，海拔在3 200 m左右，是我國最大的內(nèi)陸封閉湖，也是最大的鹽堿湖［3－4］。受蒸發(fā)以及淡水流入減少等因素的影響［5］，青海湖的堿度（carbonate alkalinity，CA）逐年增 加，已達 到29 mmol·L－1（pH 9.1～9.5）［6－8］。在如此極端環(huán)境下，生活著唯一的經(jīng)濟魚類青海湖裸鯉（GymnocyprisprzewalskiiKessler 1876）。不同于其他鯉科魚類，青海湖裸鯉有生殖洄游的習性，可穿梭于淡水和鹽堿水環(huán)境。幼魚出生于河流等淡水水體中，待成長到一定階段便隨著水流游入青海湖中生活［9－10］。青海湖裸鯉幼魚由淡水轉(zhuǎn)入高堿度水域，能夠快速適應環(huán)境，然而其中的分子機制目前并不清楚。

熱激蛋白（heat shock protein，簡稱Hsp）是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的熱應激蛋白。當生物體受到環(huán)境中物理、化學、生物條件刺激時，會大量產(chǎn)生這類蛋白［11］，參與到生物體生理代謝調(diào)節(jié)、正常生理活動維持中。熱激蛋白包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40、Hsp10以及小分子量Hsp等6個家族［12］。其中熱激蛋白60（heat shock protein 60，簡稱Hsp60）的主要功能是參與蛋白質(zhì)的正確折疊、穩(wěn)定大分子結構和裝配以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控［13－16］，因此編碼熱激蛋白60的Hsp60基因在應激反應中存在一定的應答能力，以維持細胞、組織和器官內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。青海湖裸鯉幼魚從淡水水域進入高碳酸鹽堿度的青海湖中，各組織器官中的Hsp60基因是否也會對堿度變化以及高堿度環(huán)境做出反應，其是如何表達的，這些方面的相關研究尚鮮見報道。

本研究克隆了青海湖裸鯉的Hsp60基因mRNA全長序列并進行生物信息學分析，通過模擬青海湖裸鯉幼魚在由淡水進入青海湖高碳酸鹽堿度水體這一過程中，魚體受到高堿度脅迫時Hsp60基因在青海湖裸鯉幼魚各組織器官的表達狀況，揭示青海湖裸鯉Hsp60基因受到高堿度脅迫時發(fā)揮的作用，以期為探討和研究高碳酸鹽堿度脅迫條件下水生生物體內(nèi)分子響應機制研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗用魚處理

本實驗采用的青海湖裸鯉來自青海省青海湖裸鯉救護中心，為淡水池塘養(yǎng)殖的青海湖裸鯉幼魚，空運回中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所水產(chǎn)養(yǎng)殖技術實驗室并暫養(yǎng)于魚類養(yǎng)殖循環(huán)系統(tǒng)（鹽度0～1，溫度18℃，碳酸鹽堿度1～2 mmol·L－1，pH 7.5～8）中，每日早、中、晚各投喂商業(yè)用魚飼料1次，馴化3個月后進行實驗。選取的實驗用魚體長為（13.45±0.65）cm，體質(zhì)量為（11.21±0.83）g。為模擬青海湖裸鯉幼魚由淡水進入高碳酸鹽堿度的青海湖這一過程，配制與青海湖相似碳酸鹽堿度［29 mmol·L－1，pH 9.3；實際為（26±0.57）mmol·L－1，pH 9.2～9.5］的實驗用水（配制方法參考衣曉飛等［17］）。設置暫養(yǎng)于淡水的青海湖裸鯉幼魚為對照組，將裸鯉幼魚進行急性碳酸鹽堿度脅迫，并在脅迫1、3、6、9、12、24、48、72、96、168 h時取樣，每個取樣時間點取3條魚樣品做重復，每條魚的取樣組織為腦、鰓、肝、腸、腎、肌肉以及皮膚組織，樣品置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol試劑（Invitrogen，USA）提取組織總RNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，用Nanodrop 2000 spectrophotometer（Thermo Fisher Scientific，USA）檢測并記錄RNA濃度。根據(jù)各組織RNA濃度取約1μg總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，Takara，Japan）將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA并儲存于－20℃條件下。

1.3 GpHsp60全長基因的擴增和克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫（美國國立生物技術信息中心）中下載青海湖裸鯉腎組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRA數(shù)據(jù)文件號：SRR1542353），利 用SRA Toolkit（https：／／trace.ncbi.nlm.nih.gov／Traces／sra／sra.cgi？view＝software）軟件將SRA數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)為fastq格式文件，用Trimmomatic v0.36［18］去接頭以及低質(zhì)量堿基序列，剩下高質(zhì)量數(shù)據(jù)使用Trinity v2.6.5［19］進行de novo拼接，軟件參數(shù)設置為默認選項。根據(jù)斑馬魚（Daniorerio）（NM＿181330.3）和 金 魚（Carassius auratus）（MT602074）的Hsp60基因序列，與拼接好的青海湖裸鯉序列文件進行本地Blast［20］（Blast＋v2.8.1）比對，根據(jù)獲得序列片段設計引物（表1），以鰓組織的cDNA為模板，進行PCR擴增并克隆GpHsp60基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）。根據(jù)獲得的GpHsp60基因ORF區(qū)序列片段，設計5′UTR和3′UTR的巢式引物（表1），采用cDNA末端快速克隆技術（rapidamplification of cDNA ends，RACE）依據(jù)試劑盒說明書（SMARTer RACE 5′／3′Kit，Takara，Japan），對GpHsp60基因的5′UTR和3′UTR進行擴增和克隆?？寺～@得的所有序列均交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

表1 GpHsp60基因相關引物序列Tab.1 Nucleotide primers used in the cloning of GpHsp60 gene

1.4 GpHsp60基因序列分析

使用在線蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析軟件ProtParam（https：／／web.expasy.org／protparam／）計算蛋白質(zhì)分子量、等電點和親水性［21］；利用Prosite（https：／／prosite.expasy.org）進行氨基酸結構域預測［22］，用Swiss-model對氨基酸序列進行蛋白 質(zhì) 三 維 結 構 預 測［23］，采 用Blast軟 件（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi）在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行相似性比較，下載撫仙金線鲃（Sinocyclocheilus grahami）、安 水 金 線 鲃（Sinocyclocheilus anshuiensis）、鯽（Carassius auratus）、鳊（Megalobramaamblycephala）、青魚（Mylopharyngodonpiceus）、 草 魚（Ctenopharyngodon idella）、大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabryanus）、泥 鰍（Misgurnus anguillicaudatus）和斑馬魚（Daniorerio）的Hsp60基因序列進行序列比較，選取鱖（Siniperca chuatsi）作為外群進行分析。利用Clustal W［24］對所有序列做排列，并用Mega 6.0軟件［25］進行比對，設置Bootstrap值為1 000進行最大似然法（maximum likelihood）聚類分析。

1.5 GpHsp60基因熒光定量檢測

根據(jù)獲得樣品的GpHsp60全長基因序列，在CDs區(qū)設計熒光定量引物（表1），分別以不同處理時間點的cDNA樣品為模板，以生活于淡水中的青海湖裸鯉幼魚各組織cDNA為參照，以青海湖 裸 鯉 的EF1a（elongation factor 1-alpha，GpEF1a）為內(nèi)參基因［8］，采用SYBR Green熒光染料法（北京全式金生物公司），進行實時熒光定量檢測。反應體系為20μL，反應程序為預變性95℃3 min；95℃變性20 s，56℃退火20 s，72℃延伸20 s，共計40個循環(huán)。對下機數(shù)據(jù)使用ΔΔCT值法進行相對定量分析，以淡水組青海湖裸鯉幼魚對應各組織表達量作為參照，采用SPSS V22軟件進行t檢驗和單因素方差（one-way ANOVA）分析，使用Turkey檢驗進行多重比較差異顯著性分析（P＜0.05時差異顯著），使用Origin 9軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 GpHsp60基因的克隆與分析

克隆獲得GpHsp60cDNA全長為2 995 bp（圖1），ORF區(qū)為1 728 bp，5′UTR和3′UTR序列大小分別為137 bp和113 bp。在3′UTR上含有典型的真核生物mRNA六核苷酸多腺苷化加尾修飾位點“AATAAA”。將獲得的GpHsp60基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，顯示與其他魚類的Hsp60基因高度相似。GpHsp60基因編碼氨基酸575個，分子量為61.34 kDa，理論等電點為5.38，總平均親水值為－0.084，具有線粒體Hsp60基因高度保守的ATP結合結構域（199～206：ITVKDGKT）、標簽序列（430～441：AAVEEGIVlGGG）以及C端“GGM”重復序列（559～573：GGMGGMGGMGGMGGM），判定所獲青海湖裸鯉幼魚的GpHsp60為Hsp60基因，并將GpHsp60基因提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，獲得收錄號（GenBank accession）為MT602074。

圖1 GpHsp60基因核酸以及氨基酸序列Fig.1 Nucleic acid and amino acid sequence of GpHsp60 gene

2.2 GpHsp60基因序列進化分析

使用Mega軟件對11個來自魚類的Hsp60基因序列掃描并應用最佳進化模型GTR＋I構建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。系統(tǒng)進化分析顯示，青海湖裸鯉（裂腹魚亞科）的Hsp60基因與撫仙金線鲃和安水金線鲃（鲃亞科）Hsp60基因親緣性相近。在鯉科魚類中青海湖裸鯉先與鲃亞科和鯽聚為一類，而后再與雅羅魚亞科和花鰍亞科聚類，說明裂腹魚亞科、鲃亞科和鯉亞科Hsp60基因相似度較高。

圖2 青海湖裸鯉與部分鯉亞目魚類Hsp60基因進化發(fā)育關系Fig.2 Evolutionary and developmental relationship of Hsp60 gene between G.przewalskii and other carp suborder fishes

2.3 碳酸鹽堿度脅迫下GpHsp60基因表達

通過qPCR技術對青海湖裸鯉鰓、心、腦、肝、脾、腎、腸和皮膚組織中GpHsp60基因定量分析顯示，GpHsp60在以上各組織中都有表達（圖3）。相較于對照組，堿度脅迫開始1 h后，GpHsp60在腦（1.95倍）和心臟（2.29倍）中出現(xiàn)表達量上升的現(xiàn)象，之后開始回落至對照組水平，并保持到168 h；在堿度脅迫1 h和3 h時，鰓和肝臟中的GpHsp60基因表達量較高，其中鰓中GpHsp60基因在1 h（1.99倍，P＜0.01）和3 h（1.92倍，P＜0.01）時極顯著高于淡水組，之后脅迫組青海湖裸鯉鰓中GpHsp60表達量緩慢下降，直至48 h后進入穩(wěn)定狀態(tài)，表達量回落至淡水組水平。青海湖裸鯉肝臟中GpHsp60基因在堿度脅迫下最高表達量出現(xiàn)在3 h時，是對照組的3.52倍，在6 h時恢復到處理前水平并維持至168 h；腎臟和肌肉中GpHsp60基因在脅迫3 h時，開始出現(xiàn)高表達趨勢，其中肌肉在6 h時達到最高值（3.535倍，P＜0.01），之后開始回落，12 h后恢復至對照組水平；腎臟中GpHsp60基因在魚體進入高碳酸鹽堿度環(huán)境3 h后的5個取樣時間點的表達量均維持在高水平（大于3倍對照組水平），直至48 h后恢復至對照組水平；腸和脾臟中的GpHsp60基因表達量則在裸鯉處于堿度環(huán)境1 h后，相對于對照組出現(xiàn)了下降，分別在6 h（0.257倍，P＜0.01）和12 h（0.251倍，P＜0.01）達到最低值，在堿度處理72 h后恢復至對照組正常水平；皮膚中GpHsp60表達量在脅迫前后無顯著變化（P＞0.05）。

圖3 青海湖裸鯉受堿度脅迫后9個組織器官中GpHsp60的表達量變化Fig.3 Expression of GpHsp60 in 9 tissues from G.przewalskii under alkalinity stress

3 討論

本研究共獲得GpHsp60基因序列mRNA全長共計2 995 bp，ORF可編碼575個氨基酸，并含有Hsp60保守特征序列、GGM重復序列以及ATP結合結構域［26－27］，與其他鯉科魚類Hsp60長度和特征基本一致［28－32］，確認獲得的GpHsp60序列屬于Hsp60基因家族。核苷酸序列分析顯示，青海湖裸鯉的GpHsp60與鲃亞科魚類Hsp60的相似度較高，這可能是因為裂腹魚亞科祖先源于原始鲃類魚［33］。本研究發(fā)現(xiàn)，鲃亞科、裂腹魚亞科和鯉亞科的Hsp60基因序列聚為一類，雅羅魚亞科和花鰍亞科聚為一類。陳湘粦等［34］通過鯉科魚類解剖形態(tài)學研究證實，鯉科魚類主要來源于鲃系魚和雅羅魚類，鲃亞科、裂腹魚亞科和鯉亞科來自原始鲃系魚，而雅羅魚亞科和花鰍亞科魚類是由原始雅羅魚類進化而來。

青海湖裸鯉幼魚在從淡水遷移至高碳酸鹽堿度的青海湖過程中，Hsp60基因在體內(nèi)多個器官組織中都會出現(xiàn)表達量升高。鰓是魚類離子平衡、滲透壓平衡和酸堿平衡調(diào)節(jié)的重要場所，是應答水環(huán)境變化的主要器官之一［35］，包含在血堿平衡中起到重要調(diào)節(jié)作用的ATPase酶類VH＋-ATPase和Na＋／K＋-ATPase以及Cl－／HCO3－交換蛋白等［36－38］。YAO等［8］發(fā)現(xiàn)，青海湖裸鯉在由淡水進入青海湖水中96 h內(nèi)，會降低碳酸酐酶基因在鰓細胞中的表達，以彌補呼吸性堿中毒。本研究中青海湖裸鯉幼魚在高堿度脅迫后，鰓中GpHsp60基因表達量在脅迫后1 h和3 h即出現(xiàn)明顯升高，推測青海湖裸鯉幼魚鰓器官受到了堿度急性脅迫影響，鰓上細胞在短時間內(nèi)招募Hsp60參與調(diào)節(jié)信號通路等分子生物學過程，引導裸露的鰓對高堿度水體做出反應，以應對鰓細胞的堿中毒。鰓中GpHsp60基因在處理后6 h表達量開始下降，直到48 h達到脅迫前水平，并維持至實驗結束。腦、肝臟、心臟和肌肉組織中的GpHsp60基因在機體進入高堿度環(huán)境后1～3 h，便出現(xiàn)高表達趨勢，顯示由GpHsp60參與的解毒作用在短時間內(nèi)發(fā)揮了有效作用。但與對照組無顯著性差異（P＞0.05）（圖3-B～E），表明環(huán)境堿度對青海湖裸鯉幼魚內(nèi)環(huán)境有著一定的影響，GpHsp60基因可能在短時間內(nèi)先高表達，保證機體內(nèi)環(huán)境各器官的正常功能，但隨即恢復到正常水平，說明青海湖裸鯉幼魚可能由自身其他機制保證了內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，因此GpHsp60基因表達量隨即下降。以上各組織細胞在受堿度脅迫后，其中的GpHsp60基因表達量作出了一定的調(diào)節(jié)，引導機體適應水體的高堿度，而在鰓、腦、肝、心臟和肌肉各組織中GpHsp60基因又能夠很快恢復至處理前水平，顯示Hsp60的作用過程用時短，說明了青海湖裸鯉可以在進入高堿度水體后快速適應環(huán)境的改變。但在腎臟中GpHsp60基因卻出現(xiàn)長達48 h的高表達狀態(tài)（圖3-F），可能是因為受堿度環(huán)境的脅迫，青海湖裸鯉內(nèi)環(huán)境被打破，而腎臟作為血液離子調(diào)節(jié)和代謝物質(zhì)排泄的重要場所［39－40］，參與了離子交換和代謝過程，以維持魚體內(nèi)酸堿和滲透平衡。環(huán)境堿度脅迫打破了內(nèi)環(huán)境的平衡，腎臟長時間進行諸如氨氮代謝、酸堿調(diào)節(jié)等功能運行時受到影響，如YAO等［8，41］發(fā)現(xiàn)，堿度脅迫96 h內(nèi)裸鯉腎臟中的碳酸酐酶基因呈低表達狀態(tài)以應對腎臟堿中毒。而線粒體型GpHsp60基因在腸和脾臟出現(xiàn)表達下調(diào)（圖3-G，H），推測原因可能是腸和脾臟受堿度脅迫后應激反應較弱，同時腸和脾臟細胞中的線粒體效率降低了，進而影響腸和脾臟的功能，顯示青海湖裸鯉幼魚在進入堿性環(huán)境初始階段，將能量主要提供給用于離子調(diào)節(jié)、酸堿平衡、運動系統(tǒng)等功能的器官上，而對于消化和血液循環(huán)等功能的投入有所降低，以快速適應新環(huán)境。在具有防水和阻止離子進出功能的皮膚（圖3-I）中，GpHsp60基因表達量無顯著性變化，說明堿度脅迫可能對青海湖裸鯉幼魚的皮膚組織影響不大。