薔薇屬月季組花色變化與花香相關性分析

周利君，于 超，程璧瑄，羅 樂，潘會堂，張啟翔

(花卉種質創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室，國家花卉工程技術研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，園林環(huán)境教育部工程研究中心，林木花卉遺傳育種教育部重點實驗室，北京林業(yè)大學 園林學院，北京 100083)

月季（Rosaspp.）為薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（RosaL.）多年生藤本或花灌木. 經過近200 多年的選育，現代月季已有35 000 多個品種，具有馥郁的花香和絢麗的花色，在切花、盆花以及園林中廣泛應用[1]. 許多中國古老月季品種在現代月季育種史上發(fā)揮了重要作用，現代月季的15 個重要親本有10 個來源于中國[2]. 月季組種質資源在現代月季品種的培育過程中發(fā)揮了重要作用，其中月月粉（R.chinensis‘Old Blush’）提供了四季開花特性，香水月季（R. odorata）提供了茶香（甜香）特性[3]. 中國是薔薇屬資源重要的分布中心之一，共有95 種（其中65 種為特有種），其原種資源約占全世界的三分之二[4]. 薔薇屬野生分布由東北至西南逐漸增多，云南、四川為其分布中心[5]，其中月季花主要分布在四川，香水月季主要分布在云南. 香水月季是云南特有的國家Ⅲ級瀕危保護植物[6]，其姿態(tài)優(yōu)美、香氣濃郁且適應性較強. 《中國植物志》[7]中對月季組中一些種的表型描述較為寬泛，例如實際考察發(fā)現香水月季各變種間存在很多過渡類型，民間將其通稱為“香水月季”，并不能將其簡單地歸為已知的4 個變種，導致目前香水月季的研究中，材料來源各異，研究結論也有所差異. 因此，開展月季組的資源調查收集與研究，促進這些野生資源的開發(fā)應用意義重大.

花色和花香作為植物重要的觀賞性狀，是鑒定和區(qū)分不同品種的主要指標，影響植物的觀賞價值和經濟價值[8]. 同時，花色和花香是昆蟲授粉的重要線索，某些顏色或香味的改變會影響授粉者的訪問、覓食和著陸行為，對物種進化產生重要作用[9].已有大量研究發(fā)現，花香和花色物質合成代謝存在共享生化途徑，一是花青素的合成與揮發(fā)物苯環(huán)型/苯丙素化合物的產生都在莽草酸路徑上共用同一個前體物質—苯丙氨酸[10]. 二是植物中MEP 生物合成路徑能夠同時產生類胡蘿卜素和揮發(fā)性的萜類物質. 因此，有研究者推測，生物合成路徑的多效交互可能提前適應植物產生特定的色-香組合模式，色素的產生或缺失能夠決定花組織中揮發(fā)物合成的類型和含量[10]. 研究者發(fā)現月季花中的花青素合成可能與某些揮發(fā)性化合物的產生有關，并推測這種共同調節(jié)可能阻礙月季雜交種中色素沉著和特定氣味的結合[11].

目前廣泛使用CIELab 系統(tǒng)進行花色表型數量化描述[12-13]. 課題組對前期在西南地區(qū)收集的10份月季組材料（3 份香水月季、3 份月季花以及4份在云南省野外新發(fā)現的月季組材料）進行花香成分和釋放規(guī)律測定和分析時，發(fā)現某些花香化合物的釋放與花色呈現一定規(guī)律，通過本試驗進行這10 份材料的花色描述和變化研究，并進行花香釋放與花色變化的相關性初步探索.

1 材料與方法

1.1 試驗材料以10 份薔薇屬月季組材料為研究對象，持續(xù)多年對其進行花部、葉部等基本性狀進行觀測（表1）. 分別取其3 個開花階段（a：花蕾期；b：初開期；c：盛開期）進行相關測定，分級標準參照Zhou 等[14]的研究. 材料栽植于云南省玉溪市澄江市的陽宗鎮(zhèn)南國山花種植基地（102.98°E，24.86°N，海拔1 800 m），生長狀態(tài)良好.

表1 試驗材料基本性狀及采集地點Tab. 1 The basic characters and the collection places of the ten tested roses

1.2 花色參數測定采集新鮮花朵后，放置于同一桌面按材料順序擺放，單瓣花隨機取完整花瓣，重瓣花取中層完整花瓣，正面（內面）朝上，依次用色差儀（NF555，Nippon Denshoku Industries Co. Ltd.，Japan）按CIELab 表色體系測定參數L*（明度，從黑到白，0～100）、a*（色相，由綠到紅，數值由負數到正數）和b*（色相，由藍到黃，數值由負數到正數），C*（飽和度C* = (a*2+b*2)1/2）和h（色調角h= tan-1(b*/a*)），使花色參數量化. 測量時將花瓣正面朝上，平放于干凈的白紙上，再將集光口對準分別對準花瓣上表皮中央位置進行測量，重復測定3 次，最終計算平均值代表該樣品的花色量化值[16]. 同時，通過頂空-固相微萃取聯合氣相色譜-質譜法對中國植物志上有明確記載的前6 份材料（OO、OG、OE、CSW、CSR、COB）分別對花蕾期、初開期、盛開期的花朵進行花香成分測定，并采用外標曲線法定量，具體測定步驟以及花香揮發(fā)物的種類與含量參照文獻[14].

1.3 數據分析利用Excel 2016 計算參數均值及標準差，通過IBM SPSS Statistics 24 軟件計算花色參數與花香化合物相關性系數，使用Origin 2018軟件制圖.

2 結果與分析

2.1 10 種月季花色比較分析將試驗材料3 個開花階段的花色參數取平均值，代表該材料花朵主要顏色特征. 結果表明，10 份月季材料的花色表型參數分布廣泛，在以L*、C*、h值構成的CIELCh 空間分布如圖1 所示.L*表示亮度，數值變化范圍為0～100，值越高顏色就越淺. 10 份研究材料中，野生單瓣白月季花（CSW）顏色最淺（L*=59.15），而另一個變種野生單瓣紅月季花（CSR）顏色最深（L*=91.13）.C*值表示顏色的飽和度，數值大于0，其值越大表明顏色越鮮艷. 10 份材料的花色飽和度范圍為14.84～49.53，野生單瓣白月季花飽和度最低，月月粉（COB）最鮮艷.h是色調角，也是顏色在色系中定位的方式，取值范圍從0～360°.h值越靠近0°（360°），顏色越紅；靠近90°，顏色越黃；靠近180°，顏色越綠；靠近270°，顏色越藍. 這些材料的顏色較為豐富，h值變化范圍從8.03°～315.81°，其中靠近0°（360°）和90°的紅黃兩色的頻率較高.

圖1 被試材料在CIELCh 空間的分布Fig. 1 Distribution of ten tested roses in CIELCh space

王峰等[17]利用CIELab 測色體系將227 個月季種質資源的花色分為7 個色系，并對其在a*、b*二維圖上進行分布研究，各類花色只有第Ⅲ象限沒有分布. 本研究的10 份材料在a*、b*色相坐標系中（圖2），也分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限，分別代表了不同顏色類型. 第Ⅰ象限（a*＞0，b*＞0）的5 份材料為紅色系（第①組），當a*越高紅色更深，a*值較低的單瓣粉暈大花香水月季（RC1，a*=4.22）和單瓣香水月季（OO，a*=11.54）為淺粉紅色，粉紅香水月季（OE，a*=23.32）為純正的粉紅色，野生單瓣紅月季花（a*=45.97）為深紅色. 其中佛見笑（RC2）的b*值（28.54）較高，表現為橙紅色. 第Ⅱ象限（a*＜0，b*＞0）為黃白色（第②組），黃色隨b*值升高而加深. 其中野生單瓣白月季花幾乎為純白色帶粉暈，重瓣淡黃香水月季（RC3）花朵為淡黃色，大花香水月季（OG）為亮黃色. 第Ⅳ象限（a*＞0，b*＜0）為紫紅色系（第③組），月月粉和玫紅香水月季（RC4）的花朵均為相近的紫紅色.

圖2 被試材料在a＊、b＊色相坐標系的分布Fig. 2 Distribution of ten tested roses in a*，b* coordinate system

2.2 不同階段花色變化分析同一品種不同發(fā)育時期的花朵顏色在CIELCh 空間分布也呈現較大差異和不同的變化趨勢. 從其L*、a*、b*值變化情況看（圖3），單瓣香水月季、粉紅香水月季、月月粉、和玫紅香水月季的a*值整體呈現下降趨勢，L*值反之呈上升趨勢，這些品種的粉色或紅色花都隨著花朵開放慢慢變淺. 野生單瓣白月季花和佛見笑的a*值先上升后降低，野生單瓣白月季花的粉色隨花朵綻放先變深再變淺為近白色，而佛見笑則是橙色逐漸加深再變淺. 另一種情況是整體紅色明顯隨花朵開放也增強的材料，即a*值整體呈現明顯上升趨勢的野生單瓣紅月季花和單瓣粉暈大花香水月季，其中單瓣粉暈大花香水月季的花蕊也隨花色變化明顯地由粉白變成深紅色. 黃色系的大花香水月季和重瓣淡黃香水月季的a*值在不同發(fā)育期基本保持穩(wěn)定，但b*值明顯下降，說明黃色花隨花朵開放逐漸變淺，其中大花香水月季褪色更加明顯.

圖3 被試材料的花色參數L＊、a＊、b＊值在3 個開花階段的變化Fig. 3 The variation of flower color parameters L*，a* and b* of ten tested roses in three flowering stages

2.3 花色與花香釋放相關性分析薔薇屬植物花瓣的紅色主要來自于花青苷，黃色主要由類胡蘿卜素形成，兩種色素共同形成橙色，所有顏色的花瓣中均存在黃酮醇. Schmitzer 等[18]發(fā)現現代月季KORcrisett 花瓣中花青苷總含量和主要花青苷物質各自的含量與花色參數a*、b*、h極顯著正相關，與L*極顯著負相關. 萬會花[19]發(fā)現月季花色中類胡蘿卜素中（9Z）-紫黃質是影響色相b*的關鍵色素，具有極顯著的正效應，對月季黃色形成起關鍵作用. 本研究以6 種月季材料各自3 個開花時期釋放的花香化合物總量，其在3 個代謝途徑上（萜烯類、苯環(huán)類和脂肪酸衍生物類）的花香組分含量以及與其對應的花色參數L*、a*、b*、C*、h共9 個指標，進行雙因素相關性檢驗，計算各個指標間的皮爾森相關系數（表2）. 從各代謝途徑的花香化合物總量看，與紅色相關的a*值并未與和花青素共用一個前體物質的苯環(huán)類化合物呈現明顯的負相關關系，萜烯類化合物總量也未與同在MEP 生物合成路徑上的類胡蘿卜素影響的黃色參數（b*值）呈現顯著相關性. 苯環(huán)類代謝途徑上的花香化合物總量與花瓣的b*值呈現極顯著正相關關系（P＜ 0.01），呈現花色越黃，苯環(huán)類花香化合物含量越高的規(guī)律，由此推測月季苯環(huán)類花香化合物代謝途徑與黃色物質例如黃酮醇、類胡蘿卜素等代謝途徑可能存在一定相關性.

表2 花色參數與不同代謝途徑上化合物含量的相關性Tab. 2 Correlation between flower color parameters and compound content in different metabolic pathways

曾祥玲[10]對桂花（Osmanthus fragrans）的花色和香味進行研究，發(fā)現橙黃色的丹桂積累類胡蘿卜素含量較高，缺乏將類胡蘿卜素裂解產生相應α-紫羅酮、β-紫羅酮和二氫-β-紫羅酮衍生香氣物質的類胡蘿卜素裂解雙加氧酶的作用，造成丹桂的花香不及花色較淡的金桂和銀桂. 本研究以33 種主要花香化合物釋放量與花色參數進行相關性檢驗（圖4），發(fā)現β-紫羅酮（β-Ionol）釋放量與b*值極顯著正相關（rb*=0.817**），與a*值顯著負相關（ra*=-0.523*），反而呈現β-紫羅酮在黃色花中釋放增多的現象. 此外，與產生黃色的類胡蘿卜素同在MEP路徑的揮發(fā)性萜類反而與b*值呈現顯著正相關關系，例如芳樟醇（Linalool，rb*=0.626**）、石竹烯（Caryophyllene，rb*=0.700**），其余萜烯類化合物大部分與b*值呈不顯著的負效應. 另外，苯環(huán)類代謝途徑上的一些物質，表現出和a*值極顯著或顯著負相關，與b*值極顯著正相關，例如3,5 二甲氧基苯（3,5-Dimethoxytoluene，ra*=-0.491*，rb*=0.897**)、一 種 丁 子 香 酚（ 3-Allyl-6-methoxyphenol，ra*=-0.673**，rb*=0.914**） 、 甲 基 丁 香 酚（ Methyl eugenol，ra*=-0.504*，rb*=0.915**）、（E）-異丁香酚（(E)-Isoeugenol，ra*=-0.582*，rb*=0.748**），這可能和產生紅色的花青素與揮發(fā)物苯環(huán)型/苯丙素化合物共用苯丙氨酸合成產物相關.

圖4 花色參數與主要花香化合物含量的相關性Fig. 4 Correlation between flower color parameters and content of major volatile compounds

3 結論與討論

月季花色絢爛多彩，目前擁有除純正藍色以外的其他花色，且變色、復色、花斑等品種多樣. 本試驗的10 種材料，也表現出豐富的花色，隨花朵發(fā)育綻放發(fā)生明顯且不同趨勢的變化. 月月粉、玫紅香水月季、粉紅香水月季花色較穩(wěn)定，只有輕微褪色；佛見笑橙紅兩色交融形成漸變花紋；大花香水月季和重瓣淡黃香水月季初開為黃逐漸變白；單瓣粉暈大花香水月季初開白中帶粉紅花紋，隨花朵開放粉色逐漸侵占整個花瓣乃至花蕊；兩種野生單瓣月季花也表現出明顯的差異，初開為白中帶粉，但野生單瓣白月季花逐漸變白，而野生單瓣紅月季花逐漸變成深紅色. 這些材料生長強健，花量大，且茶香（甜香）或果香味濃郁，均值得園林綠化開發(fā)利用，也是研究花色物質形成與變化的優(yōu)良材料.

花色物質與花香之間的關系目前還未得到統(tǒng)一的結論，雖然已有一些研究，但在不同的物種中表現出明顯的差異，在相同的物種中情況也十分復雜. 相關研究表明，在龍爪蘭（Dactylorhiza ramana）中，紅色品種釋放大量的芳樟醇，黃色品種卻釋放大量的苯甲醛和少量的芳樟醇[20]，但是本研究結果呈現出黃色月季比紅色月季釋放更多的芳樟醇.此外，也有研究表明強壯紅門蘭（Orchis mascula）的紫花和白花所釋放的花香沒有差異[21]. 本試驗中白色和紅色的野生單瓣月季花花色差異極大，但是所釋放的花香化合物種類十分相似.

雖然色香關系復雜，但是花色遺傳研究表明，花色變異的機制對花香的影響確實很重要. 例如，反義抑制香石竹（Dianthus caryophyllus）中花青素代謝關鍵酶編碼的F3H基因可阻礙花青素合成，使得代謝轉移到苯甲酸的產生上，導致苯甲酸甲酯的合成量增加，產生能被人類嗅覺識別的芳香氣味[22]；向矮牽牛（Petunia axillaris）中轉入擬南芥花青素合成途徑調節(jié)基因AtPAP1，可以在改變花色的同時增加苯乙醛釋放量[23]；將AtPAP1轉入月季亦能夠使其萜類揮發(fā)物含量增加并被人類嗅覺所區(qū)分. Raymond 等[11]嘗試重構月季次級代謝通路，提出花香和花色相互關聯調節(jié)的模型. 本試驗發(fā)現不同花色的月季所釋放的花香化合物含量與花色參數呈現一定相關性，推測這些花香化合物的代謝途徑可能與月季花色物質相關代謝途徑相關聯，但是與之相關的花色物質、代謝途徑和相互影響的具體情況，尚待檢測花色物質成分進一步研究驗證. 這些發(fā)現可為后期深入解析月季花香和花色形成機制和調控網絡奠定基礎，從而為月季的花香及花色育種改良提供參考.