冬季補飼對妊娠后期藏母羊瘤胃揮發(fā)性脂肪酸、微生物群落結(jié)構(gòu)和羔羊發(fā)育的影響

周 力，李蔣偉，張瑩瑩，張懷霞，馬博妍，高占紅，吳占月，侯生珍，王志有，桂林生

(青海大學農(nóng)牧學院，西寧810016)

作為青藏高原及其毗鄰地區(qū)的特有物種，藏羊?qū)Ω吆０蔚貐^(qū)少氧、嚴寒和牧草匱乏等特殊惡劣環(huán)境具有良好的適應力，是高原畜牧業(yè)最為珍貴的種質(zhì)資源[1]。長期以來，不僅為牧區(qū)人民提供生產(chǎn)及生活的必需品如肉、骨和毛等，同時也是青海省畜牧業(yè)經(jīng)濟的主要支柱之一[2]。由于青藏高原平均海拔4 000 m以上，嚴酷的自然環(huán)境和氣候條件導致牧草生長期較短，枯草期長達9個月之久，而藏母羊妊娠后期正值枯草季節(jié)。由于枯草季節(jié)牧草中粗蛋白和脂肪含量只占青草季節(jié)的68.9 %和34.4%[3]，長期的營養(yǎng)攝入不足不僅影響妊娠期母羊分娩機能和產(chǎn)后恢復，同時還限制胎兒的正常生長發(fā)育。

作為反芻動物最復雜的生物體系之一，瘤胃微生物群落具有大量的基因資源。飼糧結(jié)構(gòu)、宿主遺傳和飼養(yǎng)管理等因素均能對微生物的內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生明顯的影響[4]。飼糧作為微生物發(fā)酵的底物，其性質(zhì)和組成直接影響微生物的定植過程。董春曉等[5]試驗發(fā)現(xiàn)，相較于葵花籽殼組日糧和油菜秸稈組日糧,玉米秸稈組和玉米芯組日糧不僅可以確保育肥湖羊的生產(chǎn)性能, 并且有利于纖維分解菌的生存, 可促進纖維素在瘤胃中的降解。在羔羊上的研究發(fā)現(xiàn)，增加高谷物飼料的比例，能夠顯著降低瘤胃微生物群落的豐富度和多樣性[6]。其他研究也指出在飼糧中添加植物油[7]、抗生素[8]、微生態(tài)制劑[9]以及維生素[10]等均能明顯的影響瘤胃細菌結(jié)構(gòu)，從而達到調(diào)控瘤胃發(fā)酵模式的目的。目前，關于冬季補飼對藏羊瘤胃微生物多樣性的研究鮮有相關報道。基于此，本研究通過16 S rDNA高通量測序技術測定妊娠后期藏羊瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的多樣性，從微生物角度闡述冬季補飼對藏母羊瘤胃揮發(fā)性脂肪酸、微生物菌群及羔羊生長發(fā)育的影響，為促進藏羊生產(chǎn)力提供理論依據(jù)和技術途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及地點

選擇年齡（3歲）、胎次（2胎）及體重（45.67±3.12 kg）相近的健康妊娠期藏羊440只，隨機分為處理組（test，T）和對照組（control check，CK），每組220只。試驗時間為2018年12月—2019年1月。養(yǎng)殖地點位于青海省海南州同德縣河北鄉(xiāng)夏知邁村。

1.2 試驗設計

試驗母羊同期發(fā)情，集中配種。妊娠前期（配種后0～105 d），所有母羊均為放牧飼養(yǎng)；妊娠后期（配種后106～150 d），處理組母羊在放牧基礎上，歸牧后每只母羊補飼0.1 kg·d-1精料補充料。對照組歸牧進入圈舍后不接受補飼。所有試驗羊放牧草場條件一致，自由飲水，歸牧時間為每天19:30。藏羊未有現(xiàn)行飼養(yǎng)標準，參考中國肉羊飼養(yǎng)標準（NY/T 816-2004）[11]進行日糧配制?；A日糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成和營養(yǎng)水平表（干物質(zhì)基礎）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets（DM basis）

1.3 樣品采集

試驗結(jié)束后，從試驗組和對照組中隨機選擇 5只和 6 只母羊頸靜脈放血屠宰后，采集瘤胃內(nèi)容物于無菌離心管中，3 500 r·min-1離心 15 min，取上層液體混勻后通過4層紗布過濾，將濾液分為2份，一份裝于5 mL凍存管中，用于測定瘤胃細菌多樣性；另一份用于測定瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量。同時，每組隨機選擇100只新生羔羊，測定其體重、體高、體長、胸圍及尻寬等生長發(fā)育指標。

1.4 瘤胃液VFA含量測定

參考Liang等[12]方法進行，利用氣相色譜儀（Thermo Scientific，美國）測定瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸的含量。

1.5 16 S rRNA PCR擴增

采用 E.Z.N.A.?stool DNA Kit（Omega Bio-tek,Norcross, GA, USA）試劑盒提取瘤胃液DNA。所提取的DNA質(zhì)量及濃度通過Nanodrop 1000 spectrophotometer （Thermo Scientific，Wilmington，USA）進行檢測。利用 Illumina HiSeq 2500 PE250 平臺檢測微生物V3+V4可變區(qū)多樣性，分析瘤胃微生物多樣性及不同水平豐度。PCR擴增上游引物為：5′-CCTAC GGGNGGCWGCAG，下游引物為5′-GGACTACHVG GGTATCTAAT。具體反應程序為：95 ℃ 2 min后進行35個循環(huán)，依次為 95 ℃ 2 min和72 ℃ 30 s，然后72 ℃延長 5 min。本試驗中，將高度相似性的序列(97%)歸為1個操作分類單位（Operational taxonomic units，OTU），測序數(shù)據(jù)采用UPARSE 軟件進行OTUs聚類分析，相關圖表采用R語言數(shù)據(jù)包進行繪制。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行初步整理，利用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），T檢驗法比較2組數(shù)據(jù)的差異顯著性，所有數(shù)據(jù)以平均值±標準差（mean±SD）表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 冬季補飼對新生羔羊生長發(fā)育的影響

由圖1可見，冬季補飼能夠顯著影響新生羔羊的體重、體高和胸圍。處理組羔羊的體重、體高和胸圍分別比對照組羔羊高出29.07 %、11.82 %和12.69 %，差異顯著（P＜ 0.05）。體長和尻寬差異不顯著（P＞ 0.05）。

圖1 冬季補飼對新生羔羊生長發(fā)育的影響Figure 1 Effect of dietary supplements on growth traits of lamb during the cold season

2.2 冬季補飼對妊娠后期藏母羊瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

由表2可見，處理組瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）、丙酸和丁酸含量顯著高于對照組(P＜0.05)；同時乙酸和異丁酸顯著低于對照組（P＜0.05）。

表2 冬季補飼對妊娠后期藏母羊瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響Table 2 Effect of supplemental feeding in winter on volatile fatty acid content in rumen fluid of Tibetan ewes during late pregnancy

2.3 測序結(jié)果

本試驗中，11份瘤胃液樣本中總共獲得原始序列1 252 166條，其中有效序列1 155 747條，序列度蓋度為92.30 %。相似度大于97 %的有效序列聚類為3418個OTU，其中2194個OTU為2組母羊共有，637個OTU為對照組獨有，587個OTU為處理組獨有。

2.4 冬季補飼對妊娠后期母羊瘤胃微生物Alpha多樣性的影響

應用Wilcoxon法對Alpha多樣性中Chao1、Ace、Shannon和Simpson等指數(shù)進行分析（表3），結(jié)果顯示，與處理組相比，對照組的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)分別顯著（P＜ 0.05）。Chao1 指數(shù)和Ace 指數(shù)方面，兩組間差異不顯著（P＞ 0.05）。

表3 瘤胃微生物Alpha多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity indexes of rumen microbiota

2.5 冬季補飼對妊娠后期母羊瘤胃微生物Beta多樣性的影響

基于Unifrac算法在OTU水平上對瘤胃微生物進行principal co-ordinates analysis （PCoA），圖3（a）結(jié)果顯示，2組藏羊聚類明顯，說明冬季補飼對藏羊瘤胃微生物區(qū)系存在具有顯著的影響。此外，為更好地反映數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)，對2組藏羊樣本進行nonmetric multidimensional scaling（NMDS）分析，結(jié)果進一步佐證了兩組藏羊瘤胃微生物區(qū)系差異明顯（圖3（b））。

圖3 Beta多樣性分析Figure 3 Analysis of Beta diversity

2.6 冬季補飼對妊娠后期母羊瘤胃微生物相對豐度的影響

門水平上，擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）以及疣微菌門（Verrucomicrobia）相對豐度較高，2組和分別占細菌總量的55.80 %、16.56 %及14.75 %，為優(yōu)勢菌門（表4）。通過對比排名前10菌門的差異發(fā)現(xiàn)，2組的3個優(yōu)勢菌門差異并不顯著（P＞ 0.05），但處理組的藍藻菌門（Cyanobacteria）的豐度僅為0.98 %，比對照組低1.04 %（P＜ 0.05）。

表4 門水平上瘤胃細菌組成分析Table 4 Composition analysis of rumen bacteria at phylum level

屬水平上，普雷沃菌屬-1（Prevotella-1）、理研菌科RC9腸道群（Rikenellaceae-RC9-gut-group）和普雷沃氏菌科-UCG-001（Prevotellaceae-UCG-001）為藏羊的瘤胃微生物優(yōu)勢菌屬（表5）。通過對比排名前10菌門的差異發(fā)現(xiàn)，兩組的3個優(yōu)勢菌門差異并不顯著（P＞ 0.05）。

表5 屬水平上瘤胃細菌組成分析Table 5 Composition analysis of rumen bacteria at genus level

2.7 功能預測

利用Tax4Fun軟件進行KEGG Pathway的功能性注釋，結(jié)果如圖4所示，2組妊娠期藏母羊瘤胃微生物主要富集于復制和修復（replication and repair）、碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、信號轉(zhuǎn)導（signal transduction）、氨基酸代謝（amino acid metabolism）、輔因子和維生素代謝（metabolism of cofactors and vitamins）、核苷酸代謝（nucleotide metabolism）和能量代謝(energy metabolism)等功能通路。

圖4 KEGG注釋分布圖Figure 4 Distribution graph of KEGG annotation

3 討論與結(jié)論

3.1 冬季補飼對新生羔羊生長發(fā)育的影響

青藏高原惡劣的氣候環(huán)境以及由于懷胎造成瘤胃擠壓使得妊娠藏母羊營養(yǎng)長期攝入不足，造成產(chǎn)后癱瘓、生產(chǎn)弱羔或死羔現(xiàn)象頻發(fā)。因此，科學補飼是維持妊娠藏母羊自身和胎兒發(fā)育必不可少的生產(chǎn)環(huán)節(jié)。董凌云等[13]研究發(fā)現(xiàn)，補飼顆粒飼料能夠促進妊娠母羊的采食量、消化量和氮保留量，同時增加新生羔羊體重。此外，李聯(lián)萍等[14]同樣證實，妊娠母羊產(chǎn)羔前一個月補飼精料補充料能夠提高羔羊存活率。本研究中，妊娠后期藏母羊補飼精料后，不僅能夠提高新生羔羊的初始體重，同時還顯著增加其體高和胸圍指標，這與上述研究結(jié)果基本一致。推測可能存在2方面原因，首先補充精料可促進母羊血液中growth hormone（GH）、insulin-like growth factor-1（IGF-1）和insulin-like growth factor-1（IGF-2）濃度，而這些因子一定程度能通過刺激上皮細胞DNA合成，促進瘤胃上皮乳頭發(fā)育，進而維持瘤胃功能[15]。其次，補飼精料為母羊提供了更為充足的碳源和氮源，促進瘤胃微生物的繁殖，維持瘤胃的正常功能[16]。故妊娠母羊營養(yǎng)的攝入充分能夠最大程度上維持并促進羔羊的生長發(fā)育。

3.2 冬季補飼對妊娠后期藏母羊瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸含量的影響

反芻動物瘤胃的發(fā)育狀況與其發(fā)酵功能密切相關，瘤胃內(nèi)微生物能夠在厭氧條件下產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸（包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等）和菌體蛋白，為機體提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)[17]。靳繼鵬等[18]認為，高山細毛羊瘤胃乙酸/丙酸隨著補飼料中粗料的增加呈現(xiàn)升高態(tài)勢。劉敏雄[19]曾報道, 當粗飼料含量增高時, 纖維素分解菌占優(yōu)勢, 乙酸含量上升,而飼糧中淀粉含量高時, 分解淀粉的微生物占優(yōu)勢,丙酸含量顯明顯增多。Serment等[20]研究指出，在日糧維持需要的基礎上再提高20%的能量, 能明顯降低乙酸的含量，總VFA濃度會隨精料比例的增加而上升, 乙酸/丙酸則下降。本試驗中，對照組瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）、丙酸和丁酸含量顯著低于處理組；同時乙酸和異丁酸顯著高于處理組，這與上述研究結(jié)論相似。

3.3 冬季補飼對妊娠后期藏母羊瘤胃微生物菌落結(jié)構(gòu)的影響

本試驗通過多樣性分析發(fā)現(xiàn)對照組的Shannon和Simpson指數(shù)分別顯著高于和低于處理組，說明對照組瘤胃微生物多樣性優(yōu)于處理組。楊碩等[21]發(fā)現(xiàn)，補飼精料不但能夠顯著降低大青山絨山羊瘤胃細菌的OTUs 數(shù)量，同時還顯著降低細菌的多樣性。該結(jié)論與本研究相近。說明，盡管日糧中的精料可以在一定程度上能夠為細菌提供更多的蛋白以及碳水化合物，保證細菌的生長量需求[22]。但是，伴隨著精料的增加，非結(jié)構(gòu)碳水化合物同樣會隨著增加，導致瘤胃產(chǎn)生乳酸和揮發(fā)性脂肪酸的大量生成，可能一定程度上降低了pH值下降，而過低的pH值不利于瘤胃中降解纖維物質(zhì)的細菌的活性。

3.4 冬季補飼對妊娠后期藏母羊瘤胃微生物相對豐度的影響

反芻動物的瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性受諸多因素影響，如營養(yǎng)、遺傳以及宿主年齡等，尤其是日糧的結(jié)構(gòu)組成、營養(yǎng)配比及飼喂方式進能顯著影響瘤胃中微生物內(nèi)平衡[23]。本研究結(jié)果揭示，妊娠后期藏母羊瘤胃微生物優(yōu)勢菌群分別是擬桿菌門和厚壁菌門，其相對豐度分別為55.80 %和16.56 %，該結(jié)果與Liu等[24]在山羊瘤胃微生物的研究結(jié)果一致。前期，諸多研究證實，日糧的類型和組成對瘤胃中擬桿菌門具有一定程度的影響[25]。王柏輝等[26]以蘇尼特羊為研究對象，發(fā)現(xiàn)日糧中亞麻籽能夠顯著提高瘤胃細菌中擬桿菌門的相對豐度。本研究發(fā)現(xiàn)，冬季補飼有降低瘤胃擬桿菌門的趨勢。結(jié)合擬桿菌門的功能，即通過靶向結(jié)合多糖，如纖維素、果膠以及木聚糖等，能夠為宿主瘤胃微生物提供大量的碳源，進而參與機體的碳水化合物代謝[27]。

3.5 冬季補飼對妊娠后期藏母羊瘤胃微生物KEGG通路的影響

李海琴等[28]試驗表明，湖羊瘤胃中占比最高的功能為碳水化合物的代謝，其次為氨基酸代謝，與COG數(shù)據(jù)庫所預測的碳水化合物、轉(zhuǎn)錄和氨基酸運輸與代謝功能一致。閆小蘭等[29]試驗顯示，羔羊瘤胃內(nèi)菌群功能主要集中在碳水化合物代謝和氨基酸代謝。本研究進行KEGG數(shù)據(jù)庫對比分析后發(fā)現(xiàn)，復制和修復（replication and repair）、碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）、信號轉(zhuǎn)導（signal transduction）等功能基因的相對豐度在2組中較高，與上述研究結(jié)果相似。補飼精料能夠為瘤胃提供更多的營養(yǎng)物質(zhì)，使得細菌主要富集于碳水化合物代謝相關通路。

妊娠后期藏母羊的冬季補飼能夠提高瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸、丙酸和丁酸的含量，同時為胎兒的生長發(fā)育提供必要的營養(yǎng)需求，但本研究中精料的攝入量一定程度上影響了母羊瘤胃細菌的多樣性。因此，如何在維持胎兒營養(yǎng)需求和母羊瘤胃健康之間尋求平衡，是團隊后期在藏羊營養(yǎng)調(diào)控方面研究的重點。