雞糞堆肥中優(yōu)勢菌及復(fù)合固化菌劑載體的篩選

邵 穎，鄭倩倩，趙鑫銘，宋祥軍，涂 健，祁克宗

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控安徽省重點實驗室，安徽省動物性食品質(zhì)量與生物安全工程實驗室，合肥 230036)

畜禽養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，與之而來的畜禽糞便的污染問題愈加突出。畜禽養(yǎng)殖業(yè)每年產(chǎn)生約38億t畜禽糞便，但有效處理率不及50%[1]，養(yǎng)殖業(yè)糞便污染占農(nóng)業(yè)污染總量的65%[2]。同時堆放的畜禽糞便會導(dǎo)致病原體污染、抗生素污染和重金屬污染等，給公共衛(wèi)生帶來巨大的挑戰(zhàn)。目前常用的干燥處理法存在投資大、耗能大以及處理溫度過高帶來肥效差和易燒苗等缺點[3]。因此研發(fā)安全且高效的堆肥復(fù)合菌劑處理畜禽污染具有重要意義。

堆肥是一種依靠自然界廣泛存在的微生物以可控的方式促進(jìn)可降解有機質(zhì)轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定有機質(zhì)的生化過程[4]。堆肥作為養(yǎng)殖糞污無害化處理和資源利用的重要方式，本質(zhì)是微生物腐化和礦化有機質(zhì)形成穩(wěn)定的腐殖質(zhì)的過程[5]。從20世紀(jì)30年代開始，國內(nèi)外就開始了對堆肥中所添加的微生物菌劑進(jìn)行研制和應(yīng)用。微生物菌劑已經(jīng)成為制約堆肥效果的關(guān)鍵性因素[6]。常見的微生物菌劑主要有乳酸菌、芽孢桿菌、白腐菌和木霉等，其中芽孢桿菌（Baciillus）具有耐高溫、快速復(fù)活和較強分泌酶等優(yōu)勢，是堆肥菌劑中使用最廣泛的菌屬。在有氧和無氧條件下都能存活，是環(huán)境中最常見的細(xì)菌類群，特殊的厚壁型結(jié)構(gòu)與胞內(nèi)組分具有良好的耐酸、耐堿和耐高溫能力，能有效降低糞便中的臭味和氨氣等有害氣體。Schlegelmilch等[7]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌制作的復(fù)合菌劑對畜禽糞便有良好的除臭效果，氨氣和硫化氫去除率較高。徐杰等[8]報道4株強纖維素降解芽孢桿菌，等比例混合進(jìn)行堆肥，添加菌劑的堆肥中纖維素降解率提高19.83%，總氮損失率降低10%，同時具有良好的除臭效果等。

本研究以安徽規(guī)模養(yǎng)雞場不同時期堆肥樣品為研究對象，通過高通量測序分析了不同堆肥時期的優(yōu)勢細(xì)菌，以油脂、淀粉、纖維素、明膠分解性能和生理生化檢測，篩選出3株芽孢桿菌，同時對菌株生長產(chǎn)酶條件進(jìn)行單因素研究。并比較沸石粉、麥殼粉、稻殼粉和玉米芯粉4種載體的菌體接種有效活菌率以及菌體保存期等指標(biāo)，確定了最佳細(xì)菌載體，為后期開展無害化處理養(yǎng)殖業(yè)所產(chǎn)生糞便污染的提供實用性研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品采集：選取安徽懷寧縣規(guī)模蛋雞養(yǎng)殖場槽式發(fā)酵床，堆肥前期（發(fā)酵2 d）、中期（發(fā)酵15 d）和腐熟時期糞樣（發(fā)酵45 d），各時期3份，共計9份。

1.2 堆肥樣品高通量測序分析

使用天根生化科技（北京）有限公司的細(xì)菌DNA提取試劑盒提取采集的雞糞堆肥樣品中的微生物DNA，經(jīng)核酸測定儀檢測合格后用于后續(xù)試驗，PCR產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫，上機測序以及測序結(jié)果的分析委托北京諾禾致源科技股份有限公司。

1.3 菌株的分離篩選

將樣品稀釋涂布LB平板35 ℃培養(yǎng)2～3 d，參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》[9]對細(xì)菌大小、形狀、菌落、顏色和透明度等進(jìn)行形態(tài)特征觀察。通過生理生化試驗、纖維素降解試驗[10]、油脂降解試驗[9]、淀粉降解試驗[9]、明膠降解試驗[9]以及16s rRNA測序，獲得具有堆肥潛力的優(yōu)勢菌。

1.4 不同培養(yǎng)條件下纖維素酶活性測定

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)過SPSS 21進(jìn)行單因素方差分析，并以平均值與標(biāo)準(zhǔn)誤標(biāo)識，使用GraphPad Prism 7制作圖片。

酶活計算公式：U=n(μmol) X /V(mL)T(min)（U:纖維素酶；n:葡萄糖含量；X:稀釋倍數(shù)；V:反應(yīng)液中酶液加入量；T:反應(yīng)時間）

活菌率公式：R=N1/N2 （R:活菌率；N1:釋放活菌數(shù)；N2：接種細(xì)菌數(shù)）

1.5 菌劑中有效活菌數(shù)的測定

地鐵車廂普遍存在人流量眾多、人員復(fù)雜和車廂內(nèi)空間相對擁擠的情況，尤其高峰時期上述情況更為嚴(yán)重，因此提高地鐵車廂乘客的舒適度這一問題亟待解決。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

纖維素酶活性測定，按照國際標(biāo)準(zhǔn)[11]繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用DNS[11]（3，5-二硝基水楊酸）法測定不同溫度、PH、碳源和氮源培養(yǎng)條件下發(fā)酵液中纖維素酶活性。24 h恒溫培養(yǎng)，取0.2 mL發(fā)酵液50 ℃水浴10 min，然后加入2 mL DNS溶液，沸水浴5 min，冷卻至室溫后加水定容至5 mL，540 nm波長分光光度計檢測。以煮沸滅活的發(fā)酵液為空白對照。并將不同碳源、氮源的發(fā)酵液梯度稀釋，10 μL掛板記錄活菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞糞堆肥中不同堆肥階段菌群的分類學(xué)組成分析

高通量測序中門水平上的物種聚類熱圖能體現(xiàn)堆肥不同階段微生物群落的演替。如圖1所示，不同時期堆肥樣品中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)（X1為堆肥前期、F1為堆肥中期和F2為腐熟期）。在堆肥前期厚壁菌門和變形菌門相對豐富度較高，占總豐富度的61.72%；在堆肥中期和腐熟期放線菌門、擬桿菌門和異常球菌-棲熱菌門相對豐富度較高，占總豐富度的38.29%。梭菌屬（Clostridiaceae）多為致病菌，其菌群在堆肥初期占據(jù)優(yōu)勢地位，隨著堆肥時間延長，梭菌屬（Clostridiaceae）的相對豐度逐漸降低。芽孢桿菌屬（Bacillaceae）在堆肥初期也屬于優(yōu)勢菌群，僅次于梭菌屬，表明芽孢桿菌屬（Bacillaceae）細(xì)菌在堆肥前中期為活躍微生物，可以促進(jìn)堆肥的腐熟。在堆肥期間芽孢桿菌相對豐度呈現(xiàn)先降低后增加趨勢，推測堆肥中期由于溫度升高，芽孢桿菌不在適應(yīng)生存環(huán)境改變，隨著堆肥溫度下降，芽孢桿菌再次成為優(yōu)勢菌株。

新疆自治區(qū)紀(jì)委第五紀(jì)檢監(jiān)察室出具的《到案經(jīng)過》稱，根據(jù)群眾舉報反映謝暉的問題線索，紀(jì)檢部門經(jīng)初步核實后，發(fā)現(xiàn)其涉嫌嚴(yán)重違紀(jì)。2015年6月30日，經(jīng)自治區(qū)紀(jì)委常委會研究，報自治區(qū)黨委同意，決定對其立案審查。7月22日，中紀(jì)委網(wǎng)站發(fā)布了謝暉的落馬消息。同年12月29日，謝暉被刑事拘留，2016年1月16日被逮捕。

圖1 門水平上的物種聚類熱圖Figure 1 Heat map of species clustering on the level of gate

2.2 雞糞中優(yōu)勢微生物的篩選與鑒定

LB瓊脂平板初篩雞糞樣品獲得的10株形態(tài)類似芽孢桿菌的細(xì)菌微生物，進(jìn)行生理生化試驗和底物降解試驗，結(jié)果如表1和表2所示，篩選出3株優(yōu)勢微生物，D1能降解多種糖類和蛋白質(zhì)，同時也能降解油脂和纖維素；D5能分解多種糖類、油脂、纖維素和明膠；D7也能分解多種糖類、油脂、纖維素和明膠，其中D1和D7兩株菌降解性能最佳，D5次之。

納米粒子3的合成。將5.000 g氣相納米二氧化硅(原生粒徑12 nm)與200 mL乙醇的懸濁液超聲處理12 min，然后轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中，氮氣保護(hù)下加入KH550(1.500 g，6.787 mmol)和水(3.00 mL)，混合物在90℃機械攪拌下回流反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束以后抽濾，以無水乙醇100 mL洗滌4次，濾餅真空干燥后得白色固體3。

表1 10株細(xì)菌的生化試驗結(jié)果Table 1 Biochemical test results of 10 strains of bacteria

表2 10株細(xì)菌的代謝底物降解結(jié)果Table 2 Degradation of metabolic substrates from 10 strains of bacteria

2.3 16s rRNA測序鑒定菌株

圖3（b）顯示，3株菌最適的pH存在明顯差異，3株菌對酸性環(huán)境較敏感，酶活較低，其中D1菌株pH為6.5時有顯著差異（P＜0.05）且酶活性最高；D5菌株pH為7.5時有顯著差異（P＜0.05）酶活性相對最高。D7菌株pH為7.0時有顯著差異（P＜0.05）酶活性相對最高。3株菌適應(yīng)的pH值存在明顯差異，3株菌對酸性環(huán)境較敏感，酶活較低。

圖2 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Figure 2 Dendrogram of phylogeny of bacteria

表3 3株細(xì)菌序列比對結(jié)果Table 3 Sequence comparison results of three strains of bacteria

2.4 復(fù)合菌劑優(yōu)勢菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

測定D1、D5和D7 3株菌在不同培養(yǎng)條件下酶活變化。如圖3（a）所示，在環(huán)境溫度為41 ℃時，3株菌酶活差異顯著（P＜0.05），其中D7菌株纖維素酶活性最高。

如表3、圖2所示，3株細(xì)菌16s rRNA序列BLAST比對，D1與Bacillus amyloliquefaciens相似度達(dá)到98.66%，D5與Bacillus thuringiensis相似度99.76%，D7與Bacillus licheniformis相似度98.29%。D1，D5和D7均為親緣接近的芽孢桿菌屬。

圖3（c）和圖3（d）顯示，以CMC-Na作為碳源時，D1和D5相較D7菌株有顯著差異（P＜0.05）；以葡萄糖作為碳源時，D5和D7菌株產(chǎn)酶差異顯著（P＜0.05）；以淀粉為碳源時，3株菌酶活較低；以麥芽糖作為碳源時，D1菌株產(chǎn)酶和其余3個碳源產(chǎn)酶有顯著差異（P＜0.05），且酶活性相對最高。

增值稅留抵稅額一般是指企業(yè)的進(jìn)項稅抵扣銷項稅之后，由于不能抵扣完全而遺留下來的稅額。留抵稅額在企業(yè)普遍存在，形成的原因主要有三個，其一是企業(yè)銷售收入并沒有實現(xiàn)抵扣完全，有采購材料的遺留；其二是科技型企業(yè)因為研發(fā)技術(shù)及其他原因?qū)е落N項稅額不能完全抵扣進(jìn)項稅額；其三是二者稅率的不一致引起了留抵稅額的產(chǎn)生。

圖3（e）所示，以酵母提取物作為氮源時，3株細(xì)菌生長情況較好，存活率都高于100%。圖3（f）所示，D1、D5和D7菌株以酵母提取物為氮源時酶活性最高，差異顯著（P＜0.05）。

具有良好的抗壓性能，這是保障路面可以承受重物反復(fù)碾壓的先決條件，公路上的車流量大，載重較重，在實際的使用過程中，路面承受巨大的壓力，嚴(yán)重影響密實度，機構(gòu)會產(chǎn)生縫隙，會導(dǎo)致路面出現(xiàn)不同程度的沉降，所以在進(jìn)行瀝青材料配比是都應(yīng)該保持其具有良好的抗壓性能，使路面在使用中不會產(chǎn)生剪切破壞或彎曲疲勞破壞的現(xiàn)象。

按1∶1比例將菌液分別與滅菌晾干的沸石粉、稻殼粉、麥殼粉和玉米芯粉載體混合，靜置晾干備用。取制備好的晾干菌劑樣品稀釋掛板后統(tǒng)計載體釋放菌落數(shù)目，重復(fù)3次。

圖3 （a）溫度影響產(chǎn)酶的結(jié)果；（b）pH值影響產(chǎn)酶的結(jié)果；（c）碳源對細(xì)菌生長的影響；（d）碳源對產(chǎn)酶的影響；（e）氮源對細(xì)菌生長的影響；（f）氮源對產(chǎn)酶的影響。Figure 3 (a) Effect of temperature onenzyme production; (b) Effect of pH value on enzyme production;(c)Effect of carbon sources on bacterial growth; (d) Effect of carbon source screening onenzymeproduction; (e) Influence of nitrogen source on bacterial growth; (f) Effect of nitrogen source screening onenzyme production

各菌株的最適培養(yǎng)條件不同。D1菌株pH為6.5，培養(yǎng)溫度41 ℃，碳源為麥芽糖，氮源為酵母提取物；D5菌株pH為7.5，培養(yǎng)溫度41 ℃，碳源為葡萄糖，氮源為酵母提取物；D7菌株pH為7.0，培養(yǎng)溫度41 ℃，碳源為葡萄糖，氮源為酵母提取物。

2.5 菌劑中不同儲存期活菌數(shù)的測定

不同載體菌劑儲存期內(nèi)活菌數(shù)如圖4所示，3株菌在玉米芯粉中存活率較高，在不同儲存期內(nèi)，菌劑的活菌數(shù)有一定差異。沸石粉作為載體效果較差，活菌數(shù)量較低，玉米芯粉和小麥殼粉保有較高活菌數(shù)。隨著儲存期的延長，玉米芯粉對D1、D5和D7菌株的保護(hù)性都較好，在儲存28 d后活菌數(shù)依然較高。

圖4 （a）D1菌株菌劑貯存的活菌數(shù)檢測（CFU）；（b）D5菌株菌劑貯存的活菌數(shù)檢測（CFU）；（c）D7菌株菌劑貯存的活菌數(shù)檢測（CFU）Figure 4 Detection of viable bacteria number in the storage of strain D1, D5 and D7（CFU）

3 討論與結(jié)論

堆肥過程是微生物種群生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生復(fù)雜變化的過程，借助高通量測序研究堆肥過程中微生物群落的演替規(guī)律，極大地便利了研究者對微生物菌群分類情況的研究。蔡涵冰等[12]發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌屬水平上，隨著堆肥的進(jìn)行，優(yōu)勢菌群從梭菌屬和芽孢桿菌演變?yōu)闂U狀桿菌屬、芽孢桿菌屬和擬桿菌屬，環(huán)境因子對細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)影響相關(guān)性排序均為pH＞銨態(tài)氮＞溫度＞TOC＞TN，其中pH對微生物群落組成影響最大。衛(wèi)亞紅等[13]分析家畜糞便好氧堆肥中微生物類群變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)堆肥過程中細(xì)菌是優(yōu)勢種群，對發(fā)酵升溫影響較大，芽孢桿菌是優(yōu)勢種屬。上述研究結(jié)果與本試驗高通量測序結(jié)果一致，均表明芽孢桿菌具有堆肥潛力。

通過對近十年白花前胡研究文獻(xiàn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)前期對白花前胡的研究領(lǐng)域較廣，主要學(xué)科包括中藥學(xué)、農(nóng)作物、生物學(xué)、藥學(xué)、農(nóng)藝學(xué)、化學(xué)、園藝、植物保護(hù)、腫瘤學(xué)、林業(yè)、一般化學(xué)工業(yè)、農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)科學(xué)等，在研究方向上重點集中在化學(xué)成分和藥理作用等方面，但有關(guān)白花前胡的種質(zhì)資源分析評價、優(yōu)良品種培育等方面的研究報道較少，對目前生產(chǎn)中普遍存在的早期抽薹現(xiàn)象關(guān)注度不夠。建議后期加強對白花前胡的種質(zhì)資源收集與評價、科學(xué)合理的留種技術(shù)研究、優(yōu)質(zhì)種子生產(chǎn)技術(shù)體系的建立等方面研究的關(guān)注與重視，解決制約生產(chǎn)發(fā)展的瓶頸技術(shù)問題，切實促進(jìn)白花前胡種植產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

畜禽糞便富含分子結(jié)構(gòu)堅固的纖維素，自然條件下通常需要微生物分泌一系列的酶協(xié)同才能將之降解為可利用的糖類。篩纖維素降解能力強的菌株和制備微生物菌劑是加快堆肥效率的重要手段[14]。本試驗以畜禽糞便中大量存在的纖維素作為指標(biāo)，從雞糞堆肥中成功篩選出3株分解纖維素的優(yōu)勢菌株，D1解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、D5蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）和D7地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

優(yōu)化其產(chǎn)纖維素酶條件，使制備的菌劑具有加速堆肥的效果。環(huán)境溫度影響細(xì)菌蛋白質(zhì)和酶的合成與活性、RNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄，由此影響菌體的生理活動[15]。常溫環(huán)境中耐熱菌產(chǎn)纖維素酶的最適溫度45～65 ℃[16]，本試驗篩選出的3株菌培養(yǎng)最適溫度41 ℃左右，推測熱環(huán)境中篩選到的菌產(chǎn)生的酶蛋白耐熱性比較高。pH值會影響菌體的細(xì)胞原生質(zhì)膜的電荷，相對中性的環(huán)境更容易維持菌體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[17]。本試驗中菌株在pH值偏中性的環(huán)境中產(chǎn)酶較高一致。培養(yǎng)基所用碳源是影響細(xì)菌分泌蛋白的影響因子之一，優(yōu)質(zhì)的碳源能提供細(xì)菌生理生化反應(yīng)的骨架，還能提升細(xì)菌產(chǎn)酶的效率[18]。本試驗選用麥芽糖和葡萄糖作為碳源，碳源對菌株產(chǎn)酶影響顯著，進(jìn)一步論證了優(yōu)質(zhì)碳源對細(xì)菌的生長和產(chǎn)酶有積極的作用，能為菌體細(xì)胞架構(gòu)和營養(yǎng)生長提供更多碳素來源。氮源是微生物生長不可或缺的重要因素，可以為菌體的生長提供能量[19]，本試驗結(jié)果證明酵母提取物能對試驗細(xì)菌纖維素酶活性具有明顯的提升效果。

此外延長保存時間，降低保存條件是微生物堆肥技術(shù)創(chuàng)新和提高產(chǎn)量的關(guān)鍵[20]。玉米芯內(nèi)部的多孔結(jié)構(gòu)易于溶液滲透，菌液吸附性強。玉米芯表面官能團(tuán)可以與重金屬離子發(fā)生化學(xué)或物理吸附現(xiàn)象，這也有助于一定程度上減輕堆肥中普遍存在的有效態(tài)重金屬污染。同時有相關(guān)報道玉米芯粉作為培養(yǎng)基成分對芽孢桿菌有產(chǎn)酶活性的提升作用，比可溶性淀粉、麥芽糖和葡萄糖等添加物對菌株產(chǎn)酶效果更好[21]。

中國進(jìn)入新時代，中國酒業(yè)正在進(jìn)入承上啟下的變革時代。當(dāng)前人們?nèi)找嬖鲩L的美好生活需要更加廣泛和多元化，也要求白酒產(chǎn)業(yè)鏈上的每一個環(huán)節(jié)都要充分了解消費者的新需求、新變化，把握消費新趨勢，并對市場做出積極應(yīng)對。

本試驗通過比較幾種不同的菌劑載體，發(fā)現(xiàn)玉米芯粉作為菌劑載體具有良好的貯菌能力。接種外源優(yōu)勢微生物，優(yōu)化菌株的最佳培養(yǎng)條件和最佳載體，制備復(fù)合固化菌劑，更有利于加速堆肥進(jìn)程，縮短發(fā)酵周期和提高堆肥質(zhì)量，從而緩解畜禽排泄物造成的環(huán)境污染，為無害化處理養(yǎng)殖業(yè)糞便污染的實用性研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。