鐵皮石斛SEP3基因的生物信息學(xué)分析及敲除載體的構(gòu)建

黃 鑫，師凱輝，胡 凇，田英男，馮 壘，韓欣妤，孫 博，王義琴，王冬梅，何 玲, 朱永平，和鳳美

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明 650201)

MADS-box基因是一類序列特異的調(diào)節(jié)基因家族，在植物生長發(fā)育和信號傳導(dǎo)過程中起著重要的作用。SEP類基因作為參與調(diào)控植物生長發(fā)育功能的一類基因，也屬于MADS-box基因的一員。一開始，學(xué)者們對關(guān)于花器官形成的研究，總結(jié)出了經(jīng)典的ABC模型，換而言之，就是花器官的形成主要與A、B和C 3類功能基因相關(guān)，而隨著SEP類基因功能的揭示，ABC模型升級為ABCE模型，即每一輪花器官的發(fā)育都需要E類基因的參與，而E類基因中的SEP1/2/3是研究者在擬南芥中發(fā)現(xiàn)的，并且可以與ABCE 4類功能基因一起參與花器官的發(fā)育和調(diào)控。目前研究者研究了擬南芥（Arabidopsis thaliana）、桃（Amygdalus persica）、金釵石斛（Dendrobium nobile）、蘆筍（Asparagus officinalis）和綠竹（Dendrocalamopsis oldhami）等植物中SEP3基因的表達和相關(guān)功能[6-10]。

鐵皮石斛是蘭科石斛屬多年生草本植物，其不僅僅具有很高的藥用價值，同時還具有一定的觀賞價值，然而由于鐵皮石斛繁殖難、種植難、品種單一，野生資源因過度采挖而逐漸枯竭，市場品質(zhì)良莠不齊，加上育種目標(biāo)不明確、育種技術(shù)研究滯后等，導(dǎo)致鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢[11]。因此，對培育鐵皮石斛優(yōu)質(zhì)新品種具有重大意義。

目前對與鐵皮石斛的研究主要集中于其藥理分析、快繁體系等方面，而有關(guān)花型發(fā)育方面的研究幾乎沒有。本研究通過對鐵皮石斛SEP3基因的生物信息學(xué)分析及利用 CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建出鐵皮石斛的SEP3敲除載體并進行了遺傳轉(zhuǎn)化，以期為進一步研究SEP3基因在鐵皮石斛花朵發(fā)育中的功能及創(chuàng)造優(yōu)質(zhì)品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù) 鐵皮石斛DoSEP3基因序列來源于鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組NR注釋中的SEP3基因，根據(jù)FPKM（Fragments per kilobase per million）值選擇了表達量較高的序列，基因比對及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所需其他物種氨基酸序列來源于uniprot數(shù)據(jù)庫。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒 載體構(gòu)建所需的Cas9骨架載體Ubi-H及啟動子質(zhì)粒pYLsgRNA-OsU6a、pYLsgRNA-OsU6-b和pYLsgRNA-OsU6c由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉耀光教授惠贈，實驗所用的大腸桿菌為TOP10，農(nóng)桿菌為EHA105。

1.1.3 植物及試劑 實驗用于轉(zhuǎn)化的鐵皮石斛為種子萌發(fā)所得的鐵皮石斛原球莖。T5 Direct PCR Kit直接PCR擴增試劑盒購自擎科生物公司。

1.2 方法

1.2.1DoSEP3蛋白生物信息學(xué)分析 核苷酸翻譯使用DNAMAN軟件，采用Clustalx，MEGA6.0軟件進行氨基酸序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，利用ProtParam在線工具對其編碼蛋白進行預(yù)測和分析，利用SOPMA在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，利用Swiss-model在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)，利用TMHMM在線工具進行跨膜區(qū)域分析，利用PSORT Prediction在線工具預(yù)測亞細胞定位。

1.2.2 鐵皮石斛SEP3基因敲除載體構(gòu)建 使用在線軟件CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)進行靶點設(shè)計[12]，并依據(jù)設(shè)計的靶點設(shè)計了3個sgRNA表達盒引物（表1），作為載體構(gòu)建方法依據(jù)[13]。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.3 遺傳轉(zhuǎn)化鐵皮石斛原球莖及陽性原球莖的檢測 將構(gòu)建好的敲除載體熱激轉(zhuǎn)入EHA105農(nóng)桿菌，參照前人利用農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化鐵皮石斛的方法[17]，經(jīng)過抗性篩選后，切取小塊原球莖并利用特異性引物cas-f/cas-r(表1)進行直接PCR驗證獲得轉(zhuǎn)基因鐵皮石斛陽性原球莖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DoSEP3基因的核苷酸序列及其編碼蛋白氨基酸序列

鐵皮石斛DoSEP3基因CDS序列長度為354 bp，使用DNAMAN軟件預(yù)測，預(yù)測編碼117個氨基酸（圖1）。

圖1 鐵皮石斛DoSEP3基因的核苷酸序列及其編碼蛋白氨基酸序列Figure 1 Nucleotide sequence of Dendrobium officinale DoSEP3 gene and its encoded protein amino acid sequence

2.2 DoSEP3蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam分析結(jié)果顯示，其分子式為C 599 H 978 N178 O 160 S7。相對分子質(zhì)量為13 457.87 Da，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為60.53，而不穩(wěn)定系數(shù)小于40為穩(wěn)定蛋白，所以該蛋白為不穩(wěn)定蛋白，理論等電點為10.04，帶負電荷的殘基總數(shù)（Asp + Glu）為12，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg +Lys）為23，脂肪指數(shù)為 94.10，親水性的平均值為—0.121，屬于親水蛋白。

2.3 DoSEP3蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

利用SOPMA在線預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)（圖2），其中α-螺旋結(jié)構(gòu)占50.05%，延伸鏈占20.28%，β-轉(zhuǎn)角占11.89%，無規(guī)則卷曲占17.78%，其中大部分氨基酸處于α-螺旋結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)之上，利用Swiss-model預(yù)測其三級結(jié)構(gòu)模型（圖3），其GMQE值為0.22，QMEAN值為–1.05，零附近的QMEAN值表明模型結(jié)構(gòu)與相似大小的實驗結(jié)構(gòu)之間具有良好的一致性。分數(shù)為–4.0或以下表示模型的質(zhì)量較低[14]。

圖2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Figure 2 Predicted map of the protein secondary structure

圖3 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型Figure 3 Tertiary structure model of the protein

2.4 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建及多序列比對

利用Clustalx，MEGA6.0軟件構(gòu)建簡單系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），可以看出DoSEP3與同為蘭科石斛屬的金釵石斛的親緣關(guān)系最近。然后再取親緣關(guān)系較近的幾個物種進行氨基酸序列比對（圖5），藍色較多的部分占比較大，由此可以看出氨基酸序列的一致性和相似性較高。

圖4 DoSEP3蛋白與其他物種SEP3蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Figure 4 DoSEP3 evolutionary tree analysis protein systems in other species

圖5 DoSEP3與其他物種SEP3氨基酸序列比對Figure 5 DoSEP3 alignment of amino acid sequences with SEP3 from other species

2.5 DoSEP3亞細胞定位，跨膜區(qū)預(yù)測

利用TMHMM在線進行跨膜區(qū)域分析（圖6），可以看出該蛋白具有一個跨膜區(qū)，利用PSORT Prediction在線預(yù)測亞細胞定位，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核定位得分較高，說明該蛋白作用可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細胞核。

圖6 DoSEP3跨膜區(qū)域分析Figure 6 DoSEP3 transmembrane region analysis

2.6 DoSEP3基因敲除載體構(gòu)建

利用獲得第一輪PCR的產(chǎn)物（圖7），再用第一輪PCR產(chǎn)物進行第二輪PCR組裝，獲得預(yù)期大小的3個sgRNA表達盒(圖8)；采用金門克隆法將多個sgRNA表達盒串聯(lián)連接到骨架載體上，導(dǎo)入大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞，使用菌落PCR進行陽性菌落篩選（圖9）。隨后平板劃線，挑菌搖菌可參考之前生物信息學(xué)分析中的半衰期，提取質(zhì)粒，并用載體上的引物SP-L1和SP-R進行測序，測序結(jié)果表明構(gòu)建的靶位點sgRNA及啟動子均在載體上。由此說明SEP3基因的敲除載體構(gòu)建完成，可用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化研究。

圖7 第一輪PCR產(chǎn)物Figure 7 The first round PCR product

圖8 第二輪PCR產(chǎn)物Figure 8 The second round PCR product

圖9 大腸桿菌菌落PCR產(chǎn)物Figure 9 Escherichia coli colony PCR product

2.7 陽性鐵皮石斛原球莖的鑒定

選擇8顆經(jīng)過抗性篩選后的原球莖切取小塊后，使用載體上的特異性引物，利用直接PCR擴增試劑盒進行PCR陽性檢測(圖10)。編號1、3、4、5和6為陽性原球莖。

圖10 特異性引物PCR產(chǎn)物Figure 10 PCR product using specific primers

3 討論與結(jié)論

多年來，研究者們對于SEP類基因的研究主要集中于擬南芥、水稻等經(jīng)典植物上，而對于石斛蘭SEP類基因的研究報道較少。通過生物信息學(xué)分析，可以預(yù)測SEP類基因在植物生長發(fā)育過程中的作用原理，預(yù)測SEP類基因的進化機制，由此可以減輕試驗的工作量，也增強了試驗的目的性?；谙到y(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，可以通過已知基因功能的植物去推測同一分支不同植物相同基因的功能。已知SEP類基因在植物花器官的分化和發(fā)育中起著非常重要的作用。前人的研究也表明SEP3基因在花器官中的表達量遠大于其在莖、葉中的表達[15]。SEP3基因在金釵石斛春化過程中的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，可能與成花轉(zhuǎn)變有關(guān)蛋白的抑制和后續(xù)促進花器官生長有關(guān)[8]，SEP3可能通過與開花促進因子OC1發(fā)生相互作用而對成花轉(zhuǎn)變過程進行調(diào)控[16]。由此可以推測，SEP3基因也作用于鐵皮石斛的花器官發(fā)育過程，而SEP3基因作為MADS-box家族中參與花開調(diào)控基因的一員，對其展開研究有助于更好地了解其調(diào)控機理。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是最新的第3代基因編輯技術(shù)，已廣泛地運用于細菌和動物中。隨著技術(shù)的不斷成熟，關(guān)于該系統(tǒng)在植物中的驗證和應(yīng)用的報道很多，但在蘭科植物中的應(yīng)用較少，蘭科植物是被子植物第二大科，擁有達爾文花之稱，是研究物種進化的最好材料[17]。

本研究通過對鐵皮石斛SEP3基因的生物信息學(xué)分析，了解了DoSEP3蛋白的理化性質(zhì)，確定了該蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測質(zhì)量也較高，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹和氨基酸序列的比對，可以推測DoSEP3的作用與同為蘭科石斛屬的金釵石斛中SEP3基因作用相似，DoSEP3主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核，且具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域，推測可能通過細胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與花器官發(fā)育。利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建出了敲除載體并進行了遺傳轉(zhuǎn)化試驗，且成功將載體導(dǎo)入原球莖中，獲得了鐵皮石斛陽性原球莖，這為了解MADS-box家族中SEP類基因在花發(fā)育過程中的所起的作用奠定了基礎(chǔ)，為進一步研究SEP3基因在鐵皮石斛花器官發(fā)育中的功能及創(chuàng)造優(yōu)質(zhì)品種提供幫助。