烏蘞莓不同提取物軟膏對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療作用及其機(jī)制研究

朱凌云 許倩倩 包貝華 曹亮亮 趙學(xué)龍 張 麗 焦 放

（1.南京市第二醫(yī)院，江蘇南京 210003；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210023；3.南京市中醫(yī)院，江蘇南京 210022）

痛風(fēng)是一種以尿酸水平升高為特征的代謝性風(fēng)濕病，全球患病率約10%，已成為我國第二大類代謝疾病。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis，GA）是由于單鈉尿酸鹽（monosodium urate，MSU）結(jié)晶沉積關(guān)節(jié)組織周圍致炎，是痛風(fēng)的關(guān)鍵病理過程之一[1-2]。痛風(fēng)屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“歷節(jié)病”范疇，中藥多靶點(diǎn)的特性在降尿酸、抗炎和改善關(guān)節(jié)功能方面有較好的作用，在控制病情發(fā)展、減少復(fù)發(fā)、降低不良反應(yīng)率等方面有著獨(dú)特優(yōu)勢[3-4]。向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入尿酸鈉晶體造成急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（AGA）病變模型，其病理表現(xiàn)與臨床極為相似，已廣泛用于實(shí)驗(yàn)研究[5-8]。

烏蘞莓為葡萄科烏蘞莓屬植物烏蘞莓Cayratia japonica（Thunb.）Gagnep.的全草，具有清熱利濕、解毒消腫之功效，主治熱毒癰腫、疔瘡、丹毒、風(fēng)濕痹痛、黃疸等。烏蘞莓膏是南京市中醫(yī)院的醫(yī)院制劑，已應(yīng)用于臨床30余年，對肛周膿腫、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和腰痛等癥均有良好的療效[9]。但目前其制備工藝僅為打粉入藥，工藝較粗糙，有待優(yōu)化，也缺少對其治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎作用的深入研究報(bào)道。

本研究通過制備大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，并給予烏蘞莓不同提取物軟膏進(jìn)行干預(yù)，通過測定核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎性體軸的炎癥因子——腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平，比較烏蘞莓不同提取物軟膏對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用，并初步探索其作用機(jī)制，為后續(xù)烏蘞莓軟膏的改良提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物清潔級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量160～180 g，由浙江省動物實(shí)驗(yàn)中心提供，動物許可證號：SCXK（浙）2014-0001。本實(shí)驗(yàn)符合國家及南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心規(guī)定的倫理學(xué)要求。

1.2 藥物與試劑烏蘞莓軟膏，實(shí)驗(yàn)室自制，原料烏蘞莓飲片（批號：20181201）購自安徽亳州；尿酸鈉（批號：BCBH7155V），購自上海源葉生物科技有限公司；黃凡士林（批號：20180801），購自南昌白云藥業(yè)有限公司；扶他林軟膏（批號：20180707），購自北京諾華制藥有限公司。TNF-α ELISA試劑 盒（規(guī) 格：96T，批 號：20190105004，品 牌：MALLBIO）；IL-1β ELISA試 劑 盒（規(guī) 格：96T，批號，20190103003，品 牌：MALLBIO）；IL-6 ELISA試劑盒（規(guī)格：96T，批號：20190108009，品牌：MALLBIO）。

1.3 主要儀器多功能酶標(biāo)儀（Rayto RT-6100）；臺式高速離心機(jī)（規(guī)格型號：Micro CL21R）；KH-500B型超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；電 子 天 平（METTLER TOLEDO MS-105DU，d=0.01 mg）；超純水（Milli-Q超純水系統(tǒng)制備）；XFB-200型高速中藥粉碎機(jī)（吉首市中誠制藥機(jī)械廠）；DZF-6050減壓干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DHG-9246A電熱恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 烏蘞莓不同提取物軟膏制備烏蘞莓打粉軟膏：烏蘞莓飲片直接粉碎，過六號篩，按高劑量（相當(dāng)于生藥濃度0.60 g/g），加入凡士林研磨均勻。烏蘞莓水提物低、中、高劑量軟膏：最粗粉加10倍量的水回流提取2次，每次2 h，合并濾液后濃縮得稠浸膏，按低、中、高劑量（相當(dāng)于生藥濃度分別為0.15、0.30、0.60 g/g），分別加入凡士林研磨均勻。烏蘞莓醇提物低、中、高劑量軟膏：最粗粉加10倍量的95%乙醇溶液回流提取2次，每次2 h，合并濾液后濃縮得稠浸膏，按低、中、高劑量（相當(dāng)于生藥濃度分別為0.15、0.30、0.60 g/g），分別加入凡士林研磨均勻。烏蘞莓先醇提后水提物軟膏：最粗粉加10倍量的95%乙醇溶液回流提取2次，每次2 h，合并濾液，濾渣加10倍量的水回流提取2次，每次2 h，合并濾液，最終將醇提和水提的濾液合并濃縮得稠浸膏，按高劑量（相當(dāng)于生藥濃度0.60 g/g），加入凡士林研磨均勻。

2.2 造模與分組、給藥88只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d，隨機(jī)取8只為空白組，剩余80只為造模組。稱取0.5 g尿酸鈉結(jié)晶加入50 mL無菌生理鹽水中，加溫?cái)嚢柚瞥?0 mg/mL尿酸鈉懸濁液，4 ℃保存，用前搖勻。造模組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，向右側(cè)后肢踝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.5 mL尿酸鈉混懸液?？瞻捉M注射等體積生理鹽水。

造模12 h后所有造模組大鼠步態(tài)、關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)以及關(guān)節(jié)腫脹率均顯著高于空白組，說明造模成功。將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥物組、烏蘞莓打粉組、烏蘞莓先醇提后水提組和烏蘞莓水提低、中、高劑量組，以及烏蘞莓醇提低、中、高劑量組，每組8只。各治療組于造模后12 h開始涂抹給藥，藥物均勻抹于腫脹處，用紗布包裹后包扎好，分別于首次用藥后每隔12 h換藥，連續(xù)給藥5次?？瞻捉M不涂抹，模型組涂抹等量凡士林。涂抹量：每次涂抹一小茶匙，約0.5 g，折合給藥劑量，烏蘞莓水提和醇提低、中、高劑量分別為0.375、0.75、1.5 g/kg，烏蘞莓打粉組、先醇提再水提組的給藥劑量為1.5 g/kg，陽性藥物組予雙氯芬酸二乙胺乳膠劑（扶他林軟膏），給藥劑量為6.682 g/kg。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹率造模前用記號筆在各組大鼠右側(cè)后肢踝關(guān)節(jié)上方約1 cm處劃線，以備檢測周長。造模前與造模后12、24、36、48、60 h分別用軟卷尺于劃線處測量各組大鼠右側(cè)后肢踝關(guān)節(jié)周長，計(jì)算腫脹率。計(jì)算公式：腫脹率（%）=（致炎后踝關(guān)節(jié)周長－致炎前踝關(guān)節(jié)周長）/致炎前踝關(guān)節(jié)周長×100%。

2.3.2 評價(jià)步態(tài)與關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)[10]根據(jù)Coderre的步態(tài)分級評定標(biāo)準(zhǔn)，于造模后24 h觀察各組大鼠步態(tài)。步態(tài)指數(shù)：0分，正常步態(tài)，4足均勻著地；1分：輕微跛行，右膝關(guān)節(jié)略有彎曲；2分：跛行，右下肢只接觸地面；3分：嚴(yán)重跛行，右下肢離開地面，三足步態(tài)。于造模后24 h觀察各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度，評價(jià)關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)。0分：正常；1分：關(guān)節(jié)皮膚出現(xiàn)紅斑、輕度腫脹；2分：關(guān)節(jié)皮膚紅腫且僅關(guān)節(jié)部位紅腫；3分：關(guān)節(jié)以外亦見紅腫。

2.3.3 測定血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量給藥5次后，各組大鼠麻醉，腹主動脈取血，靜置0.5 h，離心取上層血清，按照ELISA試劑盒說明書嚴(yán)格操作，進(jìn)行檢測。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)均以（±s）表示，步態(tài)、大鼠炎癥指數(shù)等資料采用秩和檢驗(yàn)，組間比較采用ANOVA方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)各時期關(guān)節(jié)腫脹率比較造模后12 h，模型組與各給藥組關(guān)節(jié)腫脹度均顯著高于空白組（P＜0.05，P＜0.01），說明模型制備成功。隨著給藥次數(shù)的增加，各給藥組的關(guān)節(jié)腫脹率均呈下降趨勢，其中烏蘞莓水提高劑量組在各個時間點(diǎn)的腫脹率均為最低，于造模后36、48 h明顯低于同時期模型組（P＜0.05，P＜0.01）。其余各組組間比較均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮可能與樣本數(shù)較小及測量誤差有關(guān)。詳見表1。

表1 各組大鼠各時期踝關(guān)節(jié)腫脹率比較（±s）

表1 各組大鼠各時期踝關(guān)節(jié)腫脹率比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動物數(shù)/只 關(guān)節(jié)腫脹率/%造模后12 h 造模后24 h 造模后36 h 造模后48 h 造模后60 h空白組 8 0 0 0 0 0模型組 8 15.46±9.36* 16.83±10.01 10.91±4.00 9.54±3.02 7.28±3.10陽性藥物組 8 18.57±5.69** 12.59±5.12 9.32±3.77 7.86±4.18 4.98±2.81烏蘞莓打粉組 8 20.82±8.52** 16.69±6.24 11.24±5.04 10.81±5.52 7.20±6.95烏蘞莓水提低劑量組 8 21.03±7.77** 16.24±7.24 9.57±7.23 8.25±7.46 5.96±5.45烏蘞莓水提中劑量組 8 20.11±11.61**13.03±9.73 9.84±8.23 8.45±7.71 5.69±6.61烏蘞莓水提高劑量組 8 16.06±5.50* 9.15±7.09 5.97±3.75# 4.58±2.48## 3.69±3.21烏蘞莓醇提低劑量組 8 15.83±11.12*14.49±7.08 9.06±6.00 7.26±4.10 4.55±3.94烏蘞莓醇提中劑量組 8 21.71±8.34** 16.73±6.32 9.93±5.09 9.50±5.20 6.42±4.61烏蘞莓醇提高劑量組 8 19.31±8.34** 16.19±7.18 8.40±5.44 7.81±5.24 6.26±5.04烏蘞莓先醇提后水提組 8 18.75±7.01** 14.64±5.71 10.45±4.84 8.63±4.35 6.35±4.39

3.2 各組大鼠造模24 h后步態(tài)、關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)比較與空白組比較，模型組大鼠步態(tài)較差、關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重，步態(tài)、關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明造模成功。與模型組比較，各給藥組大鼠步態(tài)、關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)均有所降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠造模后24 h步態(tài)、關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)比較（±s） 單位：分

表2 各組大鼠造模后24 h步態(tài)、關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)比較（±s） 單位：分

注：與空白組比較，**P＜0.01。

組別 動物數(shù)/只 步態(tài)指數(shù) 關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)空白組 8 0.00 0.00模型組 8 2.00±0.67** 1.38±0.66**陽性藥物組 8 1.83±0.64 1.33±0.44烏蘞莓打粉組 8 1.88±0.57 1.25±0.67烏蘞莓水提低劑量組 8 1.63±0.66 1.25±0.62烏蘞莓水提中劑量組 8 1.63±0.94 1.38±0.46烏蘞莓水提高劑量組 8 1.00±0.94 0.75±0.62烏蘞莓醇提低劑量組 8 1.25±0.78 1.13±0.74烏蘞莓醇提中劑量組 8 1.63±0.81 1.25±0.62烏蘞莓醇提高劑量組 8 1.40±0.45 1.00±0.00烏蘞莓先醇提后水提組 8 1.50±0.82 1.00±0.67

3.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較見圖1。與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。與陽性藥物組比較，烏蘞莓不同提取物組IL-1β含量均顯著下降（P＜0.01），烏蘞莓打粉組、先醇提后水提組、醇提各劑量組和水提中、高劑量組IL-6含量均顯著下降（P＜0.01），烏蘞莓先醇提后水提組以及水提和醇提中、高劑量組TNF-α含量均顯著下降（P＜0.01）。與打粉組比較，烏蘞莓醇提高劑量組和先醇提后水提組IL-1β含量均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），烏蘞莓先醇提后水提組、水提高劑量組、醇提高劑量組IL-6含量均顯著下降（P＜0.01），烏蘞莓先醇提后水提組、水提高劑量組和醇提中、高劑量組TNF-α含量均顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。上述指標(biāo)烏蘞莓水提和醇提低、中、高劑量組均呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)，劑量越高，炎性因子含量越低，越向空白組水平回歸。對于上述炎性因子的改善作用，烏蘞莓醇提高劑量組效果最優(yōu)。

圖1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較（±s，n=8）

4 討論

隨著人們生活水平的提高，高尿酸血癥和痛風(fēng)的發(fā)病率日益增高，西藥治療效果明顯，但停藥容易復(fù)發(fā)，長期使用易引起各種不良反應(yīng)。中藥內(nèi)服外用治療痛風(fēng)，經(jīng)過大量的臨床實(shí)踐證明有效[11]。烏蘞莓軟膏治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床療效良好，但還需進(jìn)一步改良制備工藝，并深入研究其作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，給予烏蘞莓不同提取物軟膏治療，比較各組藥物對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的療效及對相關(guān)炎癥因子的影響，為后續(xù)烏蘞莓軟膏活性成分群篩選、優(yōu)化制備工藝提供參考。

尿酸鹽晶體作為誘發(fā)痛風(fēng)的關(guān)鍵物質(zhì)，在體內(nèi)高尿酸水平達(dá)到飽和程度后形成尿酸鹽沉積，進(jìn)而促發(fā)TNF-α、IL-1β等炎性因子的釋放，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)。外源注射尿酸鹽是建立痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎動物模型的經(jīng)典方法，注射尿酸鹽2~3 h后模型逐漸形成，24 h造模效果達(dá)到高峰，具有操作簡單、模型穩(wěn)定的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)復(fù)制大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，造模大鼠步態(tài)、關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)以及關(guān)節(jié)腫脹度均顯著高于空白組，說明造模成功。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，尿酸鈉致炎后24 h大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹率最高，此后即使不做干預(yù)，癥狀亦逐漸緩解，故于造模后24 h比較各組大鼠步態(tài)、炎癥指數(shù)，結(jié)果表明各治療組步態(tài)、炎癥指數(shù)均較模型組改善，但與模型組比較或兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，后續(xù)將做進(jìn)一步研究。隨著時間的增加，各治療組大鼠關(guān)節(jié)腫脹率均呈下降趨勢，其中烏蘞莓水提高劑量組在造模后36、48 h關(guān)節(jié)腫脹率明顯低于同時期模型組（P＜0.05，P＜0.01），其余各組組間比較均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮可能與樣本數(shù)較小及測量誤差有關(guān)。

大量研究表明，NLRP3炎性體活化與巨噬細(xì)胞吞噬尿酸鈉晶體密切相關(guān)，MSU結(jié)晶可通過多種途徑活化NLRP3炎性體，促進(jìn)IL-1β釋放，并與靶細(xì)胞如滑膜細(xì)胞上的IL-1受體結(jié)合，激活MyD88依賴的核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）通路，引起大量的TNF-α等促炎因子和趨化因子轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)痛風(fēng)炎癥反應(yīng)[12-16]。本研究結(jié)果表明，與空白組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量顯著升高，而與模型組比較，烏蘞莓不同提取物組上述血清炎癥因子含量均顯著降低，提示烏蘞莓軟膏治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用可能與抑制NLRP3炎癥信號通路活化有關(guān)，后續(xù)需進(jìn)一步驗(yàn)證。從本研究結(jié)果可以看出，干預(yù)后烏蘞莓醇提高劑量組和先醇提再水提組上述炎癥因子均明顯低于打粉組，水提高劑量組血清IL-6、TNF-α含量明顯低于打粉組，其中以醇提高劑量組對炎癥因子的改善作用最佳。在關(guān)節(jié)腫脹率的改善方面，烏蘞莓水提高劑量組效果最佳，而炎癥因子測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)醇提高劑量效果最佳，考慮到本模型主要是由炎癥引起，并且醇提物得率較水提物低，更利于后續(xù)制劑工藝優(yōu)化，故綜合考慮可選用烏蘞莓醇提物制備烏蘞莓軟膏。

前期對烏蘞莓成分的分析表明，其主要含有黃酮苷及苷元類成分，如木犀草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素等，且不同提取方式各成分種類及含量差異較大，醇提部分含黃酮苷元成分較多[17]。此外，有研究表明木犀草素可通過下調(diào)TLR/MyD88/NF-κB通路減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)[18]。故后續(xù)研究一方面可以進(jìn)一步優(yōu)化烏蘞莓總黃酮類成分提取精制工藝，另一方面可針對NLRP3炎癥信號通路進(jìn)行深入研究，從而闡明烏蘞莓黃酮類成分對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，在此基礎(chǔ)上可以優(yōu)化烏蘞莓軟膏的制備工藝，也可以開展新劑型研究，從而更好地應(yīng)用于臨床。