微生物源殺蟲蛋白的多樣性分析

宋 佳，閆 雪，夏麗媛，孫為偉，孫 博，范 寰，王文杰，趙 晨?

（1. 國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037；2. 新希望六和股份有限公司/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料及畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610023；3. 天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381）

殺蟲蛋白，是一類具有殺蟲效果的蛋白質(zhì)類物質(zhì)。首次確定殺蟲蛋白是在1953 年，Hannay 等通過研究發(fā)現(xiàn)，促使蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）發(fā)揮殺蟲作用的物質(zhì)主要是其產(chǎn)生的伴胞晶體，且證實(shí)這種伴胞晶體的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)，由此殺蟲蛋白走進(jìn)公眾視野。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，1981 年，Schnepf 和Whiteley成功分離得到第一個(gè)來(lái)自于Bt 的殺蟲蛋白基因cry，開創(chuàng)了殺蟲蛋白在分子水平研究的新紀(jì)元。此后，越來(lái)越多的殺蟲蛋白基因被挖掘，植物、動(dòng)物、微生物中均被證實(shí)有殺蟲蛋白的存在，其中微生物源殺蟲蛋白種類最多，研究更深入[1]。本文對(duì)近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的微生物源殺蟲蛋白及其靶標(biāo)昆蟲和作用方式等信息進(jìn)行匯總（表1），為后續(xù)相關(guān)研究提供便利。

表1 殺蟲蛋白信息匯總表Table 1 Summary of insecticidal proteins

1 微生物源殺蟲蛋白

1.1 芽孢桿菌科（Bacillaceae）/類芽孢桿菌科（Paenibacillaceae）

芽孢桿菌，是一類能產(chǎn)生抗力內(nèi)生孢子的革蘭氏陽(yáng)性菌。目前，來(lái)源于芽孢桿菌屬的蘇云金芽孢桿菌是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣的微生物制劑，很多來(lái)源于Bt 的殺蟲蛋白基因也已經(jīng)被成功商業(yè)化應(yīng)用[2]。Bt 殺蟲蛋白分為殺蟲晶體蛋白（insecticidal crystal proteins，ICPs）、營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白（vegetative insecticidal proteins，VIPs）和分泌型殺蟲蛋白（secreted insecticidal protein，SIPs）。其中ICPs 是在釋放芽孢時(shí)形成的，分為Cry 和Cyt 兩類，對(duì)鱗翅目（Lepidoptera）、鞘翅目（Coleoptera）、雙翅目（Diptera）、膜翅目（Hymenoptera）、同翅目（Homoptera）、直翅目（Orthoptera）、線蟲（Nematode）及螨類（Mite）等都具有特異的殺蟲活性[3-7]。VIPs，SIPs 則是在Bt 生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的，對(duì)雙翅目、鱗翅目、鞘翅目這幾類昆蟲具有殺蟲特異性[8-9]。

除蘇云金芽孢桿菌外，球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）以其對(duì)蚊蟲幼蟲的高毒性而聞名，其產(chǎn)生的二元毒素Bin 毒素（TPP 蛋白），已被廣泛用作滅蚊劑[10]。來(lái)自蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）的天然sphingomyelinase C（SMC）蛋白及在大腸桿菌重組表達(dá)后都被發(fā)現(xiàn)可通過低劑量注射快速麻痹和殺死德國(guó)小蠊（Blattela germanica）[11]。David Bowen 等經(jīng)研究確定了三種來(lái)自類芽孢桿菌科的側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）的新蛋白 Cry75Aa1（Mpp75Aa1）、Cry75Aa2（Mpp75Aa2）和Cry75Aa3（Mpp75Aa3）具有對(duì)西方玉米根蟲（Diabrotica virgifera virgifera LeConte）的殺蟲活性[12]。（類）芽孢桿菌科是目前發(fā)現(xiàn)殺蟲蛋白種類最多，被業(yè)界認(rèn)為最具有殺蟲蛋白挖掘潛力的菌種。

1.2 昆蟲病原線蟲共生菌/ 腸桿菌科（Enterobacteriaceae）

昆蟲病原線蟲共生菌是一類與昆蟲病原線蟲（entomopathogenic nematodesm，EPNs）互惠共生的桿狀細(xì)菌，屬于腸桿菌科，主要包括致病桿菌屬（Xenorhabdus）和發(fā)光桿菌屬（Photorhabdus）。

1998 年， Bowen 等首次在發(fā)光桿菌（Photorhabdus luminescens）W14 發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)與蘇云金芽孢桿菌殺蟲晶體蛋白顯現(xiàn)出類似殺蟲活性和致病特征的Tcs 殺蟲蛋白復(fù)合體，復(fù)合體由TcA（280 kDa）、TcB（170 kDa）、TcC（110 kDa）三種類型的功能蛋白組成[13]，在喂食或注射的條件下對(duì)鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、雙翅目等多種害蟲均具有毒殺作用[14-16]。而后，類似Tcs 復(fù)合體的蛋白也在其它昆蟲病原線蟲共生菌中被發(fā)現(xiàn)，如來(lái)自致病桿菌屬細(xì)菌的Xpt（Xenorhabdus protein toxin）蛋白，來(lái)自嗜蟲沙雷氏菌（Serratia entomophila）的Sep（Sentomophila pathogenicity）蛋白。2019 年，Mai Morishita 等從腸桿菌科細(xì)菌Enterobacter sp.532 菌株中分離到一種對(duì)家蠶具有致病性的蛋白itcA，因經(jīng)鑒定是Tcs 復(fù)合體A組分的同源物，其VRP1 結(jié)構(gòu)域是保守的，且在itcA 下游區(qū)域，還發(fā)現(xiàn)了Tcs 復(fù)合體B 和C 成分基因的同源物[17]。由此看來(lái)，Tc 蛋白在腸桿菌科中具有廣譜性。

除TcS 外，發(fā)光桿菌中普遍存在的致軟毒素Mcf（makes caterpillars floppy）能夠促使煙草天蛾等蛾類幼蟲的血細(xì)胞和中腸上皮細(xì)胞凋亡，同時(shí)破壞腸道，使昆蟲滲透失調(diào)，最后癱軟死亡[18]。將Mcf 的C 端截短，保留N 端促細(xì)胞凋亡的BH3結(jié)構(gòu)域，仍能對(duì)甜菜夜蛾幼蟲表現(xiàn)出喂食毒性和血腔毒性[19]，可見BH3 結(jié)構(gòu)域是Mcf 發(fā)揮殺蟲作用的重要功能區(qū)。發(fā)光桿菌中還有一種常見的二元?dú)⑾x蛋白 pirA/pirB（Photorhabdus Insect-Related，Pr）蛋白具有較強(qiáng)的昆蟲口服和血腔毒性，孫建宇通過實(shí)驗(yàn)確定PirA2B2 蛋白對(duì)致倦庫(kù)蚊（Culex quinquefasciatus）和白紋伊蚊（Aedes albopictus）有口服殺蟲活性，對(duì)大蠟螟（Galleria mellonella）和斜紋夜蛾（Spodopteralitura Fabricius）5 齡幼蟲、黃粉蟲（Tenebrio molitor）、德國(guó)小蠊（Blattella germanica）具有一定的血腔殺蟲活性，但當(dāng)pirA2 和pirB2 基因單獨(dú)表達(dá)時(shí)，對(duì)大蠟螟和斜紋夜蛾5 齡幼蟲則不表現(xiàn)血腔活性[20]。Txp40（Toxin from Xenorhabdus and Photorhabdus，40kDa）是一種普遍存在于昆蟲病原線蟲共生菌致病桿菌屬和發(fā)光桿菌屬中的殺蟲蛋白，在對(duì)棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的毒性研究中，Prakash Y 等分析Txp40 可能與棉鈴蟲中腸受體蛋白鈣粘蛋白、ATP 結(jié)合盒、氨基肽酶N1 和堿性磷酸酶相互作用，從而產(chǎn)生毒性[21]。

昆蟲病原線蟲共生菌因其含有的殺蟲蛋白種類之多，殺蟲圖譜之廣，已被廣泛認(rèn)可為可替代Bt，用于新的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物研究的潛力菌種。

1.3 假單胞菌科（Pseudomonadaceae）

假單胞菌是幾乎無(wú)處不在的細(xì)菌，包括土壤、水和植物表面，是生防常用菌，具有殺蟲、降解有毒物質(zhì)等生物防治作用[22]。2016 年9 月，美國(guó)杜邦先鋒公司報(bào)道，從綠葉假單胞菌（Psuedomonaschlororaphis）中發(fā)現(xiàn)IPD072Aa 蛋白對(duì)西方玉米根蟲表現(xiàn)出殺蟲能力，轉(zhuǎn)ipd072Aa 基因的玉米可免受西方玉米根蟲的危害，且經(jīng)證實(shí)其重要農(nóng)藝性狀和營(yíng)養(yǎng)成分可視為與常規(guī)玉米基本一樣[23]。2021 年2 月9 日，澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局（Food Standards Australia New Zealand，F(xiàn)SANZ）發(fā)布批準(zhǔn)能同時(shí)表達(dá)DvSSJ1 雙鏈RNA 和IPD072Aa 蛋白的耐除草劑和抗蟲玉米品系DP23211 用于食品，這是非Bt 基因轉(zhuǎn)基因作物的一次成功應(yīng)用。2017 年6 月美國(guó)杜邦先鋒公司再次報(bào)道了從摩氏假單胞菌（Pseudomonas mosselii）中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)全新的殺蟲蛋白PIP47-Aa，不存在任何已知的結(jié)構(gòu)域和模體。該蛋白除了能夠殺死西方玉米根蟲外，還能夠殺死鞘翅目北方玉米根蟲（Diabrotica barberi）、南方玉米根蟲（Diabrotica undecimpunctata howardi）、南美葉甲（Diabrotica speciosa）、蘿卜菜跳甲（Phyllotreta cruciferae）及鱗翅目害蟲小菜蛾（Plutella xylostella）、大豆尺夜蛾（Pseudoplusia includens）等，同時(shí)對(duì)益蟲瓢蟲無(wú)毒性[24]。殺蟲譜更廣、對(duì)非靶標(biāo)昆蟲無(wú)害、與已知?dú)⑾x蛋白無(wú)交互抗性成為了PIP47-Aa 殺蟲蛋白的3 個(gè)突出優(yōu)勢(shì)。

此外，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的Fit 蛋白對(duì)煙草天蛾（Manduca sexta）和蠟螟具有毒殺活性[25]。嗜蟲假單胞菌（Pseudomonas entomophila）的Monalysin 蛋白與來(lái)自臺(tái)灣假單胞菌（Pseudomonas Taiwanensis）的TccC 殺蟲蛋白等均表現(xiàn)出對(duì)果蠅（Drosophila）幼蟲的毒性[26-27]。假單胞菌中殺蟲蛋白的發(fā)現(xiàn)，證明在其它細(xì)菌源甚至是革蘭氏陰性菌中尋找強(qiáng)力有效的殺蟲蛋白是具有可能性的。

1.4 真菌（Fungi）

真菌是最早被發(fā)現(xiàn)可以作為防治害蟲的微生物，當(dāng)前已知的以昆蟲為寄主的真菌超過750 種，涉及昆蟲超過200 種[28]。其中，白僵菌和綠僵菌是在蟲害防治中應(yīng)用最廣泛的蟲生真菌，其主要代謝產(chǎn)物為破壞素（destruxins，dtxs），是由一個(gè)α-羥基酸和五個(gè)氨基酸殘基組成的環(huán)六肽，可以抑制細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，從而幫助真菌在昆蟲中繁殖，達(dá)到毒殺目的[29]。王成樹課題組通過比較產(chǎn)破壞素的金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）和不產(chǎn)破壞素的蝗綠僵菌（Metarhizium acri）的基因組信息，同時(shí)對(duì)靶向基因進(jìn)行破壞確定了破壞素合成途徑主要是由dtxS1、dtxS2、dtxS3、dtxS4四個(gè)基因編碼調(diào)控，并經(jīng)驗(yàn)證，綠僵菌突變菌ΔdtxS1 確實(shí)由于NRP 合成酶的缺失不能產(chǎn)生破壞素，改變殺蟲活性[30]。該課題組還通過全基因組測(cè)序不同殺蟲真菌以發(fā)掘殺蟲毒力蛋白，分別證實(shí)缺失mast12、mpl1、mrVeA、mrVelB 等基因的綠僵菌突變體，會(huì)失去殺蟲能力[31-33]。此外，在球孢白僵菌（Beauveria bassiana）培養(yǎng)液中也分離純化出能夠通過注射蠟螟引起細(xì)胞毒性及昆蟲黑化反應(yīng)的殼聚糖酶類似蛋白BcIP（Beauveria chitosanase-like protein）和對(duì)東亞飛蝗(Locnsta migratoria)具有專化性的注射毒性的Bassiacridin蛋白[34-35]。

近年來(lái)，大型食用真菌的活性成分在生物源殺蟲劑方面的開發(fā)也逐步受到重視，如平菇（Pleurotus mushrooms）中的溶血素家族蛋白OlyA6（ostreolysin A6），PlyA2（pleurotolysin A2）和 EryA（erylysin A）會(huì)與蛋白伴侶 PlyB（pleurotolysin B）結(jié)合，協(xié)同作用于磷酸乙醇胺神經(jīng)酰胺（ceramide phosphoethanolamine，CPE）和跨膜孔的形成，蛋白與蛋白伴侶形成的復(fù)合物對(duì)西方玉米根蟲幼蟲、成蟲和科羅拉多馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）幼蟲表現(xiàn)出選擇性毒性。同時(shí)，由于它們是與受體相互作用，因此進(jìn)化出抗性的機(jī)會(huì)應(yīng)較小[36]。此外，真菌酶系豐富，分泌的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂酶等能夠降解害蟲體壁從而達(dá)到殺蟲效果，但這些酶的經(jīng)口毒性還有待研究[37]。

1.5 其他

除上述來(lái)源分類，還有其它來(lái)自細(xì)菌的殺蟲蛋白，如紫色桿菌（Chromobacterium piscinae）中發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性殺蟲蛋白GNIP1Aa（Mpf3Aa1）不僅對(duì)西方玉米根蟲表現(xiàn)出特異性的殺蟲活性，且經(jīng)過序列分析未發(fā)現(xiàn)與任何已知的殺蟲蛋白具有同源性，這表明該蛋白可能是以一種新的方式殺滅WCR，為今后殺蟲蛋白的應(yīng)用提供了更多的可能性[38]。

其實(shí)，隨著基因組測(cè)序項(xiàng)目的不斷增加，以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法的不斷改進(jìn)，人們發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌產(chǎn)生殺蟲蛋白的范圍越來(lái)越廣，蘇云金芽孢桿菌早已不再是殺蟲蛋白的唯一來(lái)源。2020 年，國(guó)際殺蟲蛋白命名委員會(huì)就以1998 年蘇云金芽孢桿菌蛋白命名規(guī)則為基礎(chǔ)[39]，根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域?qū)Φ鞍仔蛄兄匦逻M(jìn)行分組，并更新了命名方式。修訂后的命名信息可通過細(xì)菌殺蟲蛋白資源中心網(wǎng)站（BPPRC，https://www.bpprc.org/）進(jìn)行搜索，該資源中心網(wǎng)站上的信息顯示，截至2021 年5 月，細(xì)菌殺蟲蛋白有App、Cry、Cyt、Gpp、Mcf、Mpf、Mpp、Mtx、Pra、Prb、Spp、Tpp、Vip、Vpa、Vpb、Xpp 十六大類，共1 047種[40]。當(dāng)然，這個(gè)數(shù)據(jù)還會(huì)不斷被更新。

2 討論與展望

蟲害嚴(yán)重制約著農(nóng)林業(yè)的發(fā)展，據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)，農(nóng)藥的施用可減少因蟲害造成的經(jīng)濟(jì)損失約300 億元[41]，但化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期施用不僅使害蟲抗性提高，而且對(duì)環(huán)境造成污染，因此開發(fā)環(huán)境友好的新型生物農(nóng)藥已成為必然趨勢(shì)。殺蟲蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)的生物防治劑，同化學(xué)農(nóng)藥相比，具有安全性高、對(duì)環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，同其它生物農(nóng)藥如：昆蟲信息素、植物源殺蟲劑及微生物源菌劑相比，又具有來(lái)源廣泛、作用位點(diǎn)獨(dú)特、重組蛋白獲取成本低等特點(diǎn)，在蟲害防治上已逐漸成為新的技術(shù)儲(chǔ)備和其它農(nóng)藥的有力補(bǔ)充。但目前也存在亟待解決的問題，實(shí)際防治應(yīng)用中只以蘇云金芽孢桿菌為主，長(zhǎng)期大面積連續(xù)種植Bt 轉(zhuǎn)基因作物以及單一使用Bt 菌劑，缺乏多樣性，導(dǎo)致昆蟲抗性日益嚴(yán)重。所以，對(duì)微生物源除蘇云金芽孢桿菌外的細(xì)菌及殺蟲真菌，乃至植物源和動(dòng)物源的殺蟲蛋白基因的發(fā)掘?qū)⑹侵陵P(guān)重要的。

另一方面，由于蛋白類物質(zhì)較化合物類藥劑在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性上存在劣勢(shì)，在開放環(huán)境中的應(yīng)用受到限制，目前主要以轉(zhuǎn)基因作物的形式實(shí)現(xiàn)其蟲害防治功能。若能通過基因工程和蛋白質(zhì)工程的手段，提升殺蟲蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，便可為生物藥劑形式的應(yīng)用提供可能。這不僅可以緩解民眾對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的排斥心理，同時(shí)還能為將來(lái)與其它生物藥劑進(jìn)行復(fù)配，對(duì)害蟲進(jìn)行多靶點(diǎn)消滅打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，最終實(shí)現(xiàn)綜合防治。