miR-126表達(dá)水平及其基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

王艷新 葉富躍 王 艷

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常見(jiàn)和最具侵襲性的原發(fā)性惡性腦腫瘤[1]，即使采用手術(shù)聯(lián)合術(shù)后放化療，預(yù)后仍很差。因此，探討其生物標(biāo)志物對(duì)其臨床診治具有實(shí)際的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)miR-126在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)[2]。本文探討miR-126表達(dá)水平及基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與GBM術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合原發(fā)性GBM（WHO分級(jí)Ⅳ級(jí)）診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；②臨床資料完整；③手術(shù)前后影像學(xué)資料完整，術(shù)前沒(méi)有接受放療或化療；④均接受顯微手術(shù)，術(shù)后常規(guī)綜合治療。排除合并其他惡性腫瘤或自身免疫性疾病、心力衰竭、慢性阻塞性肺病、肝功能不全、腎衰竭。

收集2016 年8 月到2020 年12 月手術(shù)切除的石蠟包埋的GBM 組織標(biāo)本86 例，其中男41 例，女45例；年齡25～83 歲，中位年齡51.0 歲；術(shù)前KPS 評(píng)分56～92 分，中位評(píng)分70.0 分。另選擇顱腦損傷內(nèi)減壓術(shù)中切除非腫瘤腦組織30例，其中男15例，女15例；年齡23～85歲；中位年齡52.0歲。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)miR-126 水平 使用QIAamp DNA/RNA FFPE組織提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN 公司）提取石蠟包埋組織基因組DNA/RNA[4]。將總RNA 樣本依照RevertAid FirstStrand cDNA 合成試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific 公司）和基因特異性環(huán)狀引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：將混合物在冰浴上孵育5 min，42 ℃60 min，70 ℃5 min。用ABI 7500 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems 公司）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（擴(kuò)增條件：94 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s，40次循環(huán)，反應(yīng)體積25 μl）。用2-ΔΔCt法以β-actin 為內(nèi)參計(jì)算miR-126 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。數(shù)據(jù)用RNU6 標(biāo)準(zhǔn)化。miR-126 正向引物5'-TGCCTCGTACCGTGAGTAC-3'，反 向 引 物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.3 miR-126 甲基化狀態(tài)檢測(cè)[4]①取1 μg 組織總DNA，使用EZ DNA 甲基化試劑盒-Gold（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）進(jìn)行亞硫酸處理。用Wizard DNA 純化樹(shù)脂對(duì)修飾后的DNA 樣本進(jìn)行純化。②取200 μg 修飾后DNA 樣本進(jìn)行甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）擴(kuò)增。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色觀察。用Sssl 甲基化酶處理基因組DNA 作為甲基化DNA的陽(yáng)性對(duì)照，用外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA作為非甲基化基因的陽(yáng)性對(duì)照。甲基化引物出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增視為甲基化，否則為非甲基化。miR-126-M正向引物5'-TTG GCG GTC GGG TTT GGT C-3'，反 向 引 物5'-TAA AAC CCC GCG ACG AAC G-3'。miR-126-U正向引物5'-TTG GTT TTT GGT GGT TGG GTT TGG TT-3'，反 向 引 物5'-CAA ACA AAA AAA CTA AAA CCC CAC AAC AAA CA-3'。③變性高效液相色譜法檢測(cè)：分別取8 μl miR-126-M 擴(kuò)增產(chǎn)物和miR-126-U 擴(kuò)增產(chǎn)物以分離方式置于DNASep 核酸分析柱（美國(guó)Transgenomic 公司）中，收集更多的片段。采用Navigator軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析（設(shè)置：碎片大小100～200 bp，分析溫度50 ℃，流速0.9 ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm）。

1.4 臨床和影像學(xué)隨訪(fǎng) 術(shù)中觀察肉眼全切除（Simpson 分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)），次全切除（Simpson 分級(jí)Ⅲ級(jí)）。隨訪(fǎng)至2021 年3 月，隨訪(fǎng)時(shí)間2～56 個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間24.0 個(gè)月。術(shù)后72 h 內(nèi)進(jìn)行增強(qiáng)MRI 掃描，出院后前1 年每間隔3 個(gè)月、術(shù)后1～3 年每間隔6 個(gè)月、術(shù)后3年后每間隔1年，或出現(xiàn)如癲癇、神經(jīng)功能障礙、顱內(nèi)高壓等癥狀時(shí)復(fù)查增強(qiáng)CT 或MRI，觀察腫瘤情況。自術(shù)后至復(fù)查增強(qiáng)CT 或MRI 掃描時(shí)觀察到新增強(qiáng)病灶的時(shí)間為復(fù)發(fā)時(shí)間。腫瘤復(fù)發(fā)包括原位復(fù)發(fā)、鄰近部位復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)隔部位復(fù)發(fā)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件處理；定量資料用表示，用t檢驗(yàn)；多因素Cox回歸分析復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素；生存曲線(xiàn)分析miR-126 甲基化與術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)間的關(guān)系；繪制受試者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲線(xiàn)分析miR-126 水平預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的效能；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GBM 組織miR-126 表達(dá)水平和甲基化狀態(tài) 與非腫瘤腦組織相比，GBM 組織miR-126 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），同時(shí)基因甲基化率明顯升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1和表1。

圖1 MSP-DHPLC法檢測(cè)miR-126基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)

表1 GBM組組織miR-126表達(dá)水平和甲基化水平狀態(tài)

2.2 GBM組織miR-126表達(dá)水平和甲基化狀態(tài)的關(guān)系 甲基化組GBM 組織miR-126 表達(dá)水平（0.530±0.139）明顯低于未甲基化組（0.861±0.121；P＜0.05）。

2.3 GBM組織miR-126甲基化狀態(tài)和術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系 術(shù)后58 例（67.44%）復(fù)發(fā)。與未復(fù)發(fā)組相比，復(fù)發(fā)組GBM 組織miR-126 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05，表2），同時(shí)基因甲基化率明顯升高（P＜0.05，表2）。生存曲線(xiàn)分析顯示，miR-126 甲基化組中位復(fù)發(fā)時(shí)間（16.0個(gè)月）較非甲基化組（39.0個(gè)月）明顯縮短（P＜0.05，圖2）。

表2 miR-126水平和甲基化率與GBM復(fù)發(fā)的關(guān)系

圖2 生存曲線(xiàn)分析miR-126甲基化狀態(tài)與術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

2.4 GBM術(shù)后復(fù)發(fā)的影響因素 單因素和多因素Cox回歸分析顯示，GBM組織miR-126甲基化和IDH1基因突變是GBM 術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 本文86例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后復(fù)發(fā)危險(xiǎn)因素的Cox回歸分析結(jié)果

2.5 GBM組織miR-126表達(dá)水平預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的價(jià)值ROC 曲線(xiàn)分析顯示，GBM 組織miR-126 表達(dá)水平預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的曲線(xiàn)下面積為0.894（95% CI 0.837～0.950；P＜0.05），最佳截?cái)嘀禐?.830，靈敏度和特異度分別為90.0%和75.6%。見(jiàn)圖3。

圖3 ROC 曲線(xiàn)分析miR-126表達(dá)水平預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤術(shù)后復(fù)發(fā)的效果

3 討論

近年來(lái)，膠質(zhì)瘤的治療方法取得了一定的進(jìn)步，包括手術(shù)、放化療等，但是GBM病人3年內(nèi)病死率仍然超過(guò)90%，這與術(shù)后復(fù)發(fā)關(guān)系密切[5]。為了預(yù)測(cè)GBM的臨床病程，需要更清楚地了解引起術(shù)后復(fù)發(fā)的生物學(xué)因素。本文發(fā)現(xiàn)GBM 組織miR-126 表達(dá)水平明顯下調(diào)，這與miR-126 基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生超甲基化有關(guān)；而且miR-126甲基化是導(dǎo)致GBM術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

miRNA 是一種小的非編碼RNA，調(diào)控多種mRNA 轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后翻譯過(guò)程。miR-126 是一種可調(diào)節(jié)人巨核細(xì)胞生成的miRNA，并且在各種惡性腫瘤中普遍下調(diào)，因此，被認(rèn)為是一種潛在的腫瘤抑制因子。有報(bào)道稱(chēng)miR-126是內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤血管生成的重要參與者，是腫瘤發(fā)展的標(biāo)志性事件[6]。Chen 等[7]發(fā)現(xiàn)高度惡性膠質(zhì)瘤組織和U87MG 細(xì)胞miR-126 的表達(dá)普遍低于正常腦細(xì)胞；miR-126表達(dá)上調(diào)后，U87MG 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲活性則受到明顯抑制，凋亡率明顯增加；這與靶向抑制PTEN/PI3K/AKT 通路和MDM2-P53 途徑有關(guān)。Xu等[8]通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-126 mimics 后發(fā)現(xiàn)，U87 和U251細(xì)胞的遷移能力明顯降低。本文發(fā)現(xiàn)GBM 組織miR-126 表達(dá)水平較非腫瘤腦組織普遍降低，尤其是復(fù)發(fā)組降低水平更明顯。這提示miR-126有望成為GBM診斷、治療和預(yù)后的新型生物標(biāo)志物。

腫瘤細(xì)胞miRNA 的表達(dá)受到包括DNA 甲基化修飾在內(nèi)的表觀修飾等多種機(jī)制的調(diào)控，而GBM具有廣泛的遺傳和表觀遺傳學(xué)異質(zhì)性。表觀遺傳調(diào)控基因的突變已被確定為具有明顯臨床特征的神經(jīng)膠質(zhì)瘤亞型的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。Klughammer 等[9]報(bào)道原發(fā)性和復(fù)發(fā)性GBM 相匹配的DNA 甲基化的基因組圖譜，從而確定了DNA 甲基化和腫瘤復(fù)發(fā)、病人生存預(yù)后之間的聯(lián)系。表觀遺傳學(xué)的改變，如DNA啟動(dòng)子區(qū)CpG 島的甲基化狀態(tài)，被認(rèn)為是腫瘤早期和常見(jiàn)的事件，并在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本文發(fā)現(xiàn)與非腫瘤腦組織相比，GBM 組織miR-126 基因異常甲基化率升高，這是導(dǎo)致miR-126 表達(dá)水平降低的重要原因之一。Verhaak等[10]基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析GBM 基因序列突變譜，并確認(rèn)TP53、EGFR、IDH1、PIK3R1、BRAF V600E、PTEN 等相關(guān)突變，大多數(shù)GBM 存在這些基因或信號(hào)通路異常情況。這提示這些分子可能是GBM 發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子。本文結(jié)果顯示miR-126 基因甲基化和IDH1 基因突變是影響GBM 術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這提示miR-126基因甲基化和IDH1基因突變一樣，都是與GBM復(fù)發(fā)相關(guān)的一個(gè)重要表觀遺傳學(xué)事件。

綜上所述，GBM 組織miR-126 表達(dá)水平普遍降低，這與其基因啟動(dòng)子異常甲基化有關(guān)；miR-126基因高甲基化是GBM術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)預(yù)測(cè)病人預(yù)后有一定的作用。