雙組分植物精油/凹凸棒石雜化材料的制備及其抗菌活性*

鐘火清,閆盆吉,牟 斌,楊芳芳,惠愛平,王愛勤

(1.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 甘肅省黏土礦物應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,蘭州730000；2.中國科學(xué)院大學(xué) 材料科學(xué)與光電子工程中心，北京 100049；3.中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所 盱眙凹土應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，江蘇 盱眙 211700；4.河西學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 張掖 734000)

0 引 言

香芹酚(Carvacrol，CAR)是一種來源于百里香精油的酚類化合物，具有優(yōu)異的抗菌活性與抗氧化性能，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞沒有毒性，已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定為安全的食品添加劑[1-4]。但由于揮發(fā)性強(qiáng)和水溶性差等缺點(diǎn)，大幅降低了生物利用率、抗菌活性和抗氧化性能，制約了在相關(guān)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。為了改善CAR的環(huán)境穩(wěn)定性，目前常用的方法包括納米乳[5]、蛋白納米顆粒[6]和環(huán)糊精包覆[7]等，但存在成本較高和制備工藝較繁瑣等不足。

凹凸棒石(attapulgite,APT)是一種含水富鎂鋁硅酸鹽黏土礦物，集一維納米棒晶(棒晶長約0.5～5 μm，直徑約20～70 nm)、規(guī)整孔道(0.37 nm×0.64 nm)、結(jié)構(gòu)負(fù)電荷和硅羥基于一體，可用于構(gòu)筑各種納米功能復(fù)合材料[8-10]。Lei等[11]用APT負(fù)載姜精油，顯著改善了精油穩(wěn)定性。在前期研究中，我們采用機(jī)械力化學(xué)法以APT為載體制備了CAR/APT雜化抗菌材料[12]。研究表明，部分CAR分子進(jìn)入APT孔道，形成了穩(wěn)定的雜化體系，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度達(dá)到2.0 mg/mL，但與現(xiàn)有抗菌材料相比，抗菌活性還有待提升。

眾所周知，不同精油分子具有不同的結(jié)構(gòu)和理化性能，對(duì)細(xì)菌的作用方式也不盡相同。研究表明，基于不同精油分子之間的協(xié)同效應(yīng)，通過不同精油分子的組合，可以明顯增強(qiáng)精油分子的抗菌效果[13-16]。例如，傘花烴單獨(dú)使用時(shí)沒有表現(xiàn)出明顯的抗菌活性，但與CAR協(xié)同后顯著提升了抗菌活性[4,17]。為此，在系統(tǒng)開展CAR/APT雜化材料研究工作基礎(chǔ)上[12]，本研究利用不同精油活性成分的協(xié)同抗菌效應(yīng)，通過機(jī)械力化學(xué)法構(gòu)筑了6種雙組分植物精油/APT雜化抗菌材料(圖1)，涉及的不同植物精油包括百里香酚(THY)[5]、香芹酮(CAV)[18]、薄荷醇(MEN)[19]、傘花烴(CYM)[17]、檸檬烯(LIM)[4]和萜品烯(TER)[4]。系統(tǒng)研究了雜化材料的結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性及其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性，為發(fā)展新型抗菌材料奠定了應(yīng)用基礎(chǔ)。

圖1 (a)CAR、THY、CAV、MEN、CYM、LIM和TER植物精油分子的結(jié)構(gòu)圖和(b)APT、CAR/APT及雙組分植物精油/APT雜化材料的數(shù)碼照片F(xiàn)ig 1 Molecular structure of CAR,THY,CAV,MEN,CYM,LIM and TER,and digital photograph of APT,CAR/APT and bi-component EOs/APT hybrid materials

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材 料

APT來自江蘇玖川納米材料有限公司，XRF測(cè)定化學(xué)組成為CaO (1.24%)、Al2O3(8.03%)、Na2O (1.51%)、MgO (12.65%)、SiO2(59.18%)、K2O (0.95%)和Fe2O3(5.07%)。CAR (99%)和THY(99%)購買自上海麥克林生化科技有限公司，MEN (98%)、CAV (98%)、CYM (97%)和LIM (97%)購買自阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司，TER (98%)購買自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。金黃色葡萄球菌(S.aureus,ATCC25912)和大腸桿菌(E.coli,ATCC25922)由蘭州大學(xué)第二醫(yī)院提供，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)購買自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 雙組分植物精油/APT雜化抗菌材料的制備

分別將6種不同精油活性成分與CAR混合得到混合精油，在前期抗菌性能測(cè)試篩選下，CAR與不同植物精油的質(zhì)量比為4∶1。分別將1.5 g混合精油與5.0 g APT拌合均勻，密封后置于黑暗處放置24 h，然后采用研磨儀(CRINOER,MG100)在60 rpm轉(zhuǎn)速下研磨30 min。根據(jù)混合精油的活性成分的名稱，將制得樣品分別標(biāo)記為THY/CAR/APT、CAV/CAR/APT、MEN/CAR/APT、CYM/CAR/APT、LIM/CAR/APT和TER/CAR/APT。

1.3 表 征

傅立葉紅外光譜儀(FTIR)：Thermo Nicolet NEXUS TM spectrophotometer 6700型(美國)，樣品經(jīng)光譜純 KBr 壓片后在掃描波長400～4 000 cm-1范圍內(nèi)測(cè)試；熱重分析儀(TG)：STA449 C TG-DSC型(德國)，測(cè)試溫度為35～750 ℃，氮?dú)鈿夥?，升溫速率?0 ℃/min。

1.4 抗菌試驗(yàn)

參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)指導(dǎo)的瓊脂稀釋法[12]，通過測(cè)定材料對(duì)S.aureus和E.coli的最小抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)來評(píng)價(jià)雜化材料的抗菌性能。具體相關(guān)操作如下所述，取-80 ℃保存的標(biāo)準(zhǔn)菌種，接種至L-B肉湯中進(jìn)行復(fù)活，當(dāng)細(xì)菌傳代進(jìn)入對(duì)數(shù)期時(shí)，制備標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液，調(diào)整菌懸液至0.5 McFarland標(biāo)準(zhǔn)濁度，稀釋至107CFU/mL后備用；將20 mL高壓滅菌后的NA與紫外線滅菌后的樣品混合均勻，倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，冷卻后即得含有抗菌樣品的瓊脂平板。用移液槍取1 μL稀釋后的菌懸液，點(diǎn)種于瓊脂平板上3個(gè)不同的位置，干燥后將瓊脂平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況，能完全抑制細(xì)菌菌落生長的最低樣品濃度即為MIC。同時(shí)設(shè)置不加樣品的瓊脂平板為陽性對(duì)照。每個(gè)樣本每個(gè)濃度下重復(fù)兩次操作。

1.5 計(jì) 算

基于密度泛函理論(Density Functional Theory,DFT)通過Gaussian 09[20]計(jì)算軟件在B3LYP-(D3BJ)/6-31G(d)水平下優(yōu)化得到APT計(jì)算模型、吸附物以及吸附復(fù)合物的幾何結(jié)構(gòu)，為了得到更為精確的吉布斯自由能熱力學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)在M062X(D3)/def2-TZVP水平下進(jìn)行單點(diǎn)計(jì)算[21]，計(jì)算吉布斯自由能GBS2 =GBS1-EBS1+EBS2 (其中G是吉布斯自由能，E是電子能,BS1指B3LYP-(D3BJ)/6-31G(d)水平，BS2指M06-2X(D3)/def2-TZVP計(jì)算水平)?；诜肿又械脑恿孔永碚?quantum theory of atom in molecular ,QTAIM)，利用Mu1tiwfn3.7[22]波函數(shù)分析軟件及其獨(dú)立梯度模型(Independent Gradient Model,IGM)考察復(fù)合物中氫鍵相互作用。所有的可視化圖形都是利用GaussianView 6.0[23]和VMD1.0[24]可視化繪圖軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜化材料紅外光譜分析

圖2為APT、CAR/APT和雙組分植物精油/APT雜化材料的FTIR譜圖。在APT的紅外光譜圖中，3 548 cm-1處的吸收峰屬于孔道內(nèi)八面體邊緣鎂離子配位水的伸縮振動(dòng)，3 421和1 654 cm-1處的吸收峰分別屬于沸石水和表面吸附水伸縮振動(dòng)和反對(duì)稱伸縮振動(dòng)[25]。在CAR/APT雜化材料的紅外光譜圖中，2 962 cm-1處的吸收峰來源于精油分子中-CH2的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1 459和1 423 cm-1處的吸收峰來源于其分子結(jié)構(gòu)中苯環(huán)C=C的伸縮振動(dòng)[12]。這些特征吸收峰的出現(xiàn)，表明CAR成功負(fù)載到APT上。比較CAR/APT和雙組分植物精油/APT雜化材料的紅外譜圖，沒有明顯區(qū)別，這主要?dú)w因于植物精油分子較為相似的分子結(jié)構(gòu)。

圖2 APT、CAR/APT和雙組分植物精油/APT雜化材料的紅外光譜Fig 2 FTIR of APT,CAR/APT and bi-component EOs/APT hybrid materials

加入精油分子不會(huì)影響凹凸棒石的結(jié)構(gòu)[26]，但機(jī)械力研磨可使精油分子與APT孔道沸石水和八面體邊緣的配位水發(fā)生相互作用[12]，從而引起APT位于3 548、3 421和1 654 cm-1處特征吸收峰發(fā)生偏移。因此，對(duì)比分析了負(fù)載植物精油前后這3個(gè)吸收峰位置的變化。如表1所示，對(duì)于CAR/APT，僅僅在3 548和3 421 cm-1處有2個(gè)波數(shù)的偏移，但形成雙組分植物精油/APT雜化材料后波數(shù)偏移相對(duì)較為明顯。在1 654 cm-1處的吸收峰均發(fā)生了紅移，并且除CAV/CAR/APT位移較小外，其它5個(gè)雜化材料的波數(shù)位移都大于6；對(duì)于3 421 cm-1處的吸收峰，除TER/CAR/APT發(fā)生4個(gè)波數(shù)的藍(lán)移外，其余均發(fā)生紅移現(xiàn)象，且CAV/CAR/APT、MEN/CAR/APT和LIM/CAR/APT的紅移現(xiàn)象都較為明顯。相比之下，位于3 548 cm-1處的吸收峰偏移較小，CYM/CAR/APT幾乎沒有發(fā)生位移，TER/CAR/APT發(fā)生4個(gè)波數(shù)紅移，其余都呈現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象。這表明雙組分精油體系與APT的相互作用強(qiáng)于CAR與APT之間的作用。

表1 雙組分植物精油/APT雜化材料在3 548、3 421和1 654 cm-1處的位移情況Table 1 Absorption peak shift of EOs/APT hybrid materials at 3 548/cm,3 421/cm and 1 654/cm

2.2 雜化材料熱性能分析

圖3給出了雙組分植物精油/APT雜化材料的TGA及DTG曲線。APT在200 ℃以下出現(xiàn)了兩個(gè)吸熱峰，分別在75和180 ℃附近[12]，其中75 ℃附近的失重峰歸因于表面吸附水的脫除，180 ℃附近的吸熱峰歸因于孔道內(nèi)沸石水的脫除[27-28]。前期研究結(jié)果表明，CAR/APT在200 ℃以下只在135 ℃出現(xiàn)了一個(gè)吸熱峰[12]，主要是雜化材料制備過程中研磨置換了APT的吸附水和沸石水。表2列出了雙組分精油與APT形成雜化材料后的吸熱峰溫度和失重率。由表中數(shù)據(jù)可見，混合MEN、THY、CAV和CYM后，相應(yīng)雜化材料的吸熱峰溫度分別升高至141、140、138和138 ℃；但混合LIM和TER后，相應(yīng)雜化材料的吸熱峰溫度分別降為125和133 ℃。同時(shí)，引入LIM和TER制得雜化材料的失重率也較低，說明加入THY、CAV、MEN和CYM可以協(xié)同提高雜化材料的穩(wěn)定性。

圖3 (a)THY/CAR/APT,(b)CAV/CAR/APT,(c)MEN/CAR/APT,(d)CYM/CAR/APT,(e)LIM/CAR/APT和(f)TER/CAR/APT雜化材料的TGA和DTG曲線Fig 3 TGA and DTG cures of bi-component EOs/APT hybrid materials:(a)THY/CAR/APT;(b)CAV/CAR/APT;(c)MEN/CAR/APT;(d)CYM/CAR/APT;(e)LIM/CAR/APT and (f)TER/CAR/APT

表2 CAR/APT和雙組分植物精油/APT雜化材料的吸熱峰溫度及失重率Table 2 Endothermic peak and mass loss of CAR/APT and bi-component EOs/APT hybrid materials

2.3 雜化材料穩(wěn)定機(jī)理

雜化材料的穩(wěn)定性與植物精油分子的結(jié)構(gòu)有明顯相關(guān)性。由圖1a各種植物精油分子的結(jié)構(gòu)圖可見，THY、CAV、MEN和CYM分子中有含氧官能團(tuán)或者苯環(huán)，而LIM和TER分子中既沒有含氧官能團(tuán)也沒有苯環(huán)。研究結(jié)果表明，CAR、THY、CAV和MEN分子中的含氧官能團(tuán)可與APT表面的Si-OH及孔道邊的Mg-OH2基團(tuán)形成較強(qiáng)的氫鍵，且不同的分子結(jié)構(gòu)與兩個(gè)基團(tuán)形成氫鍵的強(qiáng)度不同[26]，所以植物精油分子結(jié)構(gòu)中含有氧官能團(tuán)及苯環(huán)可提升雜化材料穩(wěn)定性。此外，植物精油分子也可能與CAR分子產(chǎn)生相互作用，如氫鍵和π-π作用，從而有助于提高雜化材料的穩(wěn)定性。因此，加入THY、CAV、MEN和CYM后穩(wěn)定性提高的原因可歸因于不同精油分子之間的相互作用，或者是與APT作用位點(diǎn)的差異。

為了進(jìn)一步明晰加入THY、CAV、MEN和CYM分子后雜化材料穩(wěn)定性提高的原因，計(jì)算模擬了這幾種分子與CAR分子相互作用情況。計(jì)算以CAR/APT復(fù)合物為底物，由圖4可見，CAR 與其它植物精油分子之間存在氫鍵等弱相互作用力。CAR 與CAV、THY 和MEN之間主要存在O-H…O之間的氫鍵，這從IGM圖上可以清晰的表現(xiàn)出來，分子之間綠色片狀區(qū)域中的藍(lán)色部分表示氫鍵作用力，說明CAV/CAR、MEN/CAR 和THY/CAR 之間的弱相互作用力以氫鍵為主。通過吉布斯自由能數(shù)據(jù)可知(圖5)，該過程分別需要吸熱2.25、2.38和1.83 kcal/mol，但與TER、LIM和 CYM分子之間，雖然也有氫鍵作用力存在，但主要以范德華力為主，在熱力學(xué)上表現(xiàn)為吸熱更多，需要吸熱3.83、3.66和4.29 kcal/mol。對(duì)比前期對(duì)這些精油分子與APT相互作用的數(shù)據(jù)[26]，發(fā)現(xiàn)APT與精油分子之間的作用力遠(yuǎn)強(qiáng)于CAR與其它分子間的作用力，所以加入THY、CAV、MEN和CYM后雜化材料穩(wěn)定性提高的原因主要是精油分子與APT不同位點(diǎn)之間作用強(qiáng)度差異引起的。

圖4 精油分子復(fù)合結(jié)構(gòu)及IGM分析分子間氫鍵相互作用力,其中δginter =0.05 a.u.Fig 4 Structure of bi-component EOs molecules and intermolecular hydrogen bond (δginter =0.05 a.u.)

圖5 混合精油分子的吉布斯自由能Fig 5 Gibbs free energy of mixed EOs molecules

2.4 抗菌性能

CAR和THY都是具有良好抗菌效果的精油分子，研究結(jié)果表明，CAR/APT和THY/APT對(duì)E.coli和S.aureus的MIC都為2.0 mg/mL[12,26]，而其它精油分子單獨(dú)使用時(shí)抗菌效果較差[4]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，不同精油分子之間的協(xié)同作用可以提升單一精油分子的抗菌活性[13-16]。圖6給出了雙組分植物精油/APT雜化材料對(duì)E.coli和S.aureus的MIC值。從表中MIC值可見，與CAR/APT的MIC值相比，除MEN/CAR/APT外，其它雜化材料對(duì)E.coli的MIC都降低到了1.0 mg/mL；除LIM/CAR/APT外，其它雜化材料對(duì)S.aureus的MIC值都降低到了0.5 mg/mL。由此可知，其它精油成分的引入都明顯增強(qiáng)了CAR/APT的抗菌性能，表明這幾種精油分子能與CAR產(chǎn)生協(xié)同作用。對(duì)于協(xié)同作用機(jī)理，除了不同精油分子與細(xì)菌之間作用方式外，不同精油分子與APT的作用位點(diǎn)是一個(gè)重要因素。

圖6 雙組分植物精油/APT雜化材料對(duì)E. coli和S. aureus的MIC：(a)THY/CAR/APT,(b)CAV/CAR/APT,(c)MEN/CAR/APT,(d)CYM/CAR/APT,(e)LIM/CAR/APT 和(f)TER/CAR/APTFig 6 MIC values of bi-component EOs/APT hybrid materials against E. coli and S. aureus:(a)THY/CAR/APT;(b)CAV/CAR/APT;(c)MEN/CAR/APT;(d)CYM/CAR/APT;(e)LIM/CAR/APT and (f)TER/CAR/APT

3 結(jié) 論

(1)在APT上同時(shí)引入CAR和THY、CAV、MEN、CYM精油分子可以改善雜化材料的熱穩(wěn)定性。對(duì)于有含氧官能團(tuán)的THY、CAV和MEN，提高雜化材料熱穩(wěn)定性的原因是本身與APT能形成較強(qiáng)的氫鍵，而CYM與CAR分子之間存在π-π相互作用。

(2)引入不同植物精油分子也有助于提高雜化材料的抗菌活性，除MEN和LIM外，其它雙組分植物精油雜化材料對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為1.0 mg/mL和0.5 mg/mL?？咕钚缘奶嵘c精油分子間的協(xié)同效應(yīng)密切相關(guān)。