抗-HCV篩查反應(yīng)性HCV核酸陰性獻(xiàn)血者的確證結(jié)果分析*

秦偉斐，楊丹蓉，段恒英，黃 霞

(重慶市血液中心 400015)

為保障血液安全，我國《血站技術(shù)操作規(guī)程(2019版)》對獻(xiàn)血者病毒感染標(biāo)志物篩查作了明確規(guī)定：丙型肝炎病毒(HCV)感染標(biāo)志物應(yīng)至少采用核酸和血清學(xué)試劑各進(jìn)行1次檢測。血液篩查應(yīng)盡可能選用高敏感性試劑，因試劑的特異性有所降低，會存在一定的生物學(xué)假陽性，低危險(xiǎn)無償獻(xiàn)血人群其假陽性比例更高[1]。假陽性結(jié)果會給獻(xiàn)血者帶來心理負(fù)擔(dān)，同時(shí)造成血液資源的浪費(fèi)。另一方面，核酸篩查HCV核酸陰性獻(xiàn)血者中也存在一定比例的假陰性，對血液安全構(gòu)成威脅。本研究通過對重慶地區(qū)122份抗-HCV篩查呈反應(yīng)性且HCV核酸陰性獻(xiàn)血者的確證結(jié)果進(jìn)行分析，探討現(xiàn)有篩查策略的安全性及開展獻(xiàn)血者歸隊(duì)的必要性，為獻(xiàn)血者篩查策略的選擇和獻(xiàn)血者歸隊(duì)提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1-12月本血液中心經(jīng)ELISA試劑檢測抗-HCV抗體反應(yīng)性、HCV核酸檢測陰性的122份無償獻(xiàn)血者標(biāo)本為研究對象。

1.2 方法

1.2.1試劑

ELISA試劑：抗-HCV(北京萬泰、美國強(qiáng)生)。HCV重組免疫印跡確證試劑：HCV BLOT 3.0(美國MP公司)。

1.2.2儀器

全自動(dòng)樣品處理儀(Xan-Tus)；全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)(Microlab FAME24/20)；PROCLEIX TIGRIS 核酸檢測系統(tǒng)(西班牙Grifols公司)；全自動(dòng)蛋白印跡儀ProfiBlot48(瑞士帝肯公司)。

1.2.3檢測流程

上述標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行ELISA和核酸檢測，對ELISA試劑反應(yīng)性且核酸檢測呈陰性的標(biāo)本進(jìn)行HCV確證試驗(yàn)。

1.2.4血清學(xué)ELISA檢測與結(jié)果判定

加樣器自動(dòng)加樣后，用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀對抗-HCV進(jìn)行雙試劑2次ELISA法檢測，依據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)和試劑說明書及工作手冊進(jìn)行結(jié)果判定。S/CO≥0.8判為有反應(yīng)性，其中S/CO≥0.8～<1.0設(shè)置為灰區(qū)。雙試劑S/CO≥0.8，直接判為陽性；單試劑有反應(yīng)性的標(biāo)本采用原試劑對標(biāo)本管進(jìn)行雙孔復(fù)試，任意一孔有反應(yīng)性則判為陽性。

1.2.5確證試驗(yàn)檢測與結(jié)果判斷

將需要進(jìn)行確證試驗(yàn)的標(biāo)本按HCV確證試劑HCV BLOT 3.0的操作說明書和全自動(dòng)蛋白印跡儀ProfiBlot 48的操作程序進(jìn)行操作，結(jié)果判斷依據(jù)按試劑說明進(jìn)行。其條帶強(qiáng)度的判讀和結(jié)果的解釋如下：未出現(xiàn)HCV抗體特異條帶強(qiáng)度+及以上判為陰性，至少出現(xiàn)2條強(qiáng)度+及以上或出現(xiàn)1條核抗原條帶++及以上判為陽性，僅出現(xiàn)1個(gè)HCV抗體特異條帶強(qiáng)度+及以上判為不確定。陽性預(yù)測值是指陽性檢測結(jié)果為真陽性的概率，即陽性預(yù)測值=真陽性/(真陽性+假陽性)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ELISA試劑檢測抗-HCV反應(yīng)性標(biāo)本的確證試驗(yàn)結(jié)果

ELISA試劑檢測抗-HCV呈反應(yīng)性標(biāo)本的確證試驗(yàn)結(jié)果中各陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.801，P<0.05)，見表1。

表1 ELISA試劑檢測抗-HCV反應(yīng)性標(biāo)本的確證試驗(yàn)結(jié)果

2.2 確證試驗(yàn)條帶分布及組合情況

試劑1、2經(jīng)確證陽性標(biāo)本，條帶主要是核心區(qū)核抗原蛋白區(qū)帶，其次是非結(jié)構(gòu)NS4蛋白區(qū)帶，區(qū)帶反應(yīng)強(qiáng)度組合主要是核抗原蛋白區(qū)帶和核抗原+NS4，見表2。

表2 確證試驗(yàn)條帶分布及組合情況

2.3 不同區(qū)間S/Co呈陽性反應(yīng)的標(biāo)本與確證試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系

隨著S/Co增高，陽性預(yù)測值也增高。但試劑1、2經(jīng)確證試驗(yàn)確證的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.904，P>0.05)，見表3。

表3 不同區(qū)間S/Co呈陽性反應(yīng)的標(biāo)本與確證試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系

續(xù)表3 不同區(qū)間S/Co呈陽性反應(yīng)的標(biāo)本與確證試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系

3 討 論

HCV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷主要為檢測HCV抗體、抗原或HCV核酸。由于ELISA法具有操作簡單、靈敏度高、成本低、適用于批量檢測等優(yōu)點(diǎn)[2]，目前國內(nèi)血液篩查中均采用了該方法進(jìn)行抗-HCV抗體檢測，已有研究報(bào)道抗-HCV ELISA試劑靈敏度和特異度均超過99%[3]。但該方法在具有較高靈敏度的同時(shí)，也會產(chǎn)生一定的假陽性，國外報(bào)道假陽性率大于26%，有的甚至高達(dá)50%以上[4]。因此，美國疾病預(yù)防控制中心建議，抗-HCV ELISA反應(yīng)性的標(biāo)本需采用重組免疫印跡確證或核酸檢測結(jié)果陽性可報(bào)告確證結(jié)果[5]。近年來，國內(nèi)的采供血機(jī)構(gòu)對獻(xiàn)血者進(jìn)行了HCV核酸檢測的全覆蓋，發(fā)現(xiàn)無償獻(xiàn)血人群中存在一定比例的抗-HCV篩查反應(yīng)性而HCV核酸陰性的獻(xiàn)血者，對此類獻(xiàn)血者的處理及后續(xù)的歸隊(duì)策略引起了大多數(shù)研究者的關(guān)注。

本課題組采用重組免疫印跡對此類獻(xiàn)血者進(jìn)行HCV確證試驗(yàn)，結(jié)果顯示在122份標(biāo)本中，ELISA試劑1單反應(yīng)性的確證陽性率為0，ELISA試劑2單反應(yīng)性為25.93%，試劑1、2均反應(yīng)性為47.06%，總體確證的陽性率為31.15%，不確定率為34.43%，這表明ELISA試劑檢測抗-HCV反應(yīng)性對于篩查HCV感染仍具有重要意義，兩種ELISA試劑同時(shí)檢測能最大限度降低核酸檢測的漏檢率。另一方面，確證試驗(yàn)結(jié)果中假陽性率為34.43%，與KODANI等[6]和陳少彬等[7]報(bào)道的抗-HCV ELISA試劑假陽性率接近，表明現(xiàn)階段采用的兩種不同廠家的ELISA試劑檢測在彌補(bǔ)試劑差異和減少人為誤差的同時(shí)，也增加了HCV初篩結(jié)果的假陽性率。為進(jìn)一步提高輸血安全，目前國內(nèi)血站已進(jìn)行核酸檢測全覆蓋[8]。HCV核酸檢測不僅靈敏度高且特異度好，陽性說明血液中含有HCV病毒，也具有傳染HCV病毒風(fēng)險(xiǎn)。引進(jìn)核酸檢測也可明顯縮短HCV檢測的“窗口期”，降低經(jīng)輸血傳播HCV的概率[9]。但由本研究結(jié)果可知，部分ELISA陽性而核酸檢測陰性的標(biāo)本仍不能排除HCV感染的可能，因此，血清學(xué)和核酸檢測在血液篩查中互為補(bǔ)充、缺一不可。根據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程(2019版)》規(guī)定，HCV感染標(biāo)志物應(yīng)至少采用核酸和血清學(xué)試劑各進(jìn)行1次檢測的要求，至于要選擇“1遍ELISA”還是“2遍ELISA”的篩查策略，這就要求各血站應(yīng)根據(jù)自己的數(shù)據(jù)進(jìn)行成本效益的分析，結(jié)合技術(shù)水平和人力物力等條件來制訂不同的篩查策略，權(quán)衡篩查效果和成本的關(guān)系，做出最好的選擇來降低輸血風(fēng)險(xiǎn)[10]。

確證試驗(yàn)結(jié)果顯示，確證檢測條帶數(shù)越多，確證的陽性率越高，說明初篩抗-HCV反應(yīng)性標(biāo)本的確證陽性率與確證檢測條帶數(shù)、條帶強(qiáng)度一致，結(jié)合確證試劑檢測條帶數(shù)、條帶強(qiáng)度對結(jié)果進(jìn)行判定可提高陽性預(yù)測值的準(zhǔn)確性[11]。此外，S/Co越高，陽性預(yù)測值也就越高。文獻(xiàn)報(bào)道Ortho HCV 3.0ELISA試劑在其檢測標(biāo)本S/Co≥3.8時(shí)，陽性預(yù)測值超過95%[12]，本研究結(jié)果顯示兩種ELISA試劑檢測結(jié)果陽性預(yù)測值低于張雪梅等[13]報(bào)道的98.02%和98.92%，這可能與本研究均為核酸檢測陰性標(biāo)本有關(guān)。研究結(jié)果顯示ELISA試劑1的S/Co≥5.0的確證陽性率僅為82.35%，這就需要進(jìn)一步確定試劑1最佳屏蔽閾值。ELISA試劑2的S/Co≥5.0的確證陽性率為100.00%，提示這部分獻(xiàn)血者可以直接屏蔽。所以，在制訂反應(yīng)性獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊(duì)時(shí)，可以根據(jù)不同抗-HCV ELISA試劑的S/Co作為預(yù)測HCV感染真陽性結(jié)果的參考閾值。本研究顯示2種ELISA試劑在灰區(qū)均有確證陽性，說明本實(shí)驗(yàn)室HCV這個(gè)項(xiàng)目設(shè)置灰區(qū)是有必要的，與王瑞等[14]報(bào)道的可以取消灰區(qū)設(shè)置不一致。這與實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、儀器設(shè)備性能、試劑廠家、操作程序等不同有關(guān)，因此，是否設(shè)置灰區(qū)及其設(shè)定值應(yīng)根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行驗(yàn)證。

按照目前的篩查策略，任意1次篩查結(jié)果為陽性的血液標(biāo)本均視為不合格血液，基本上沒有開展確證試驗(yàn)便使該獻(xiàn)血者被屏蔽，導(dǎo)致一定數(shù)量的健康獻(xiàn)血者被永遠(yuǎn)屏蔽，終身失去了獻(xiàn)血的資格，既減少了血源，又給獻(xiàn)血者造成嚴(yán)重心理負(fù)擔(dān)?！斗磻?yīng)性獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊(duì)指南》的出臺，對于解決這類問題提供了依據(jù)和路徑，作為血液安全的篩查者或研究者，需要思考的是采用何種檢測試劑、何種篩查策略能為獻(xiàn)血者屏蔽或歸隊(duì)提供科學(xué)依據(jù)[15]。根據(jù)《反應(yīng)性獻(xiàn)血者屏蔽與歸隊(duì)指南》，對核酸檢測陽性和抗-HCV ELISA雙試劑均呈反應(yīng)性的直接屏蔽，但對于ELISA試劑單反應(yīng)性的這部分獻(xiàn)血者，可根據(jù)不同試劑S/Co閾值來預(yù)測，S/Co大于或等于最佳閾值的直接屏蔽，S/Co小于最佳閾值的進(jìn)入歸隊(duì)流程，這樣能有效減少不必要的獻(xiàn)血者屏蔽。在確保血液安全的同時(shí)，有必要進(jìn)行隨訪，給獻(xiàn)血者提供相對準(zhǔn)確、可靠的檢測結(jié)果，增加對獻(xiàn)血者的關(guān)愛，提高獻(xiàn)血服務(wù)的質(zhì)量[16]。當(dāng)然，面對抗-HCV篩查反應(yīng)性但HCV核酸陰性獻(xiàn)血者，增加確證試驗(yàn)應(yīng)該是一條可行路徑，但又面臨技術(shù)、人員、成本、時(shí)間等多方面考量，需要綜合評判。

綜上所述，在獻(xiàn)血人群中同時(shí)采用2遍ELISA和核酸檢測，并在ELISA檢測中設(shè)灰區(qū)的篩查策略能最大限度降低輸血感染HCV的風(fēng)險(xiǎn)，保障血液安全。但假陽性將導(dǎo)致獻(xiàn)血者被屏蔽，開展HCV確證試驗(yàn)有助于指導(dǎo)獻(xiàn)血者歸隊(duì)，也可提高獻(xiàn)血服務(wù)的質(zhì)量。