油酸激活Src基因誘導Hela細胞增殖、遷移和侵襲的研究*

秦 虹，張曉玉，羅 旋，曾 晗，陳壓西，楊 萍△

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腫瘤中心 401336；2.重慶醫(yī)科大學脂糖代謝性疾病重慶市重點實驗室脂質(zhì)研究中心 400016)

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，呈現(xiàn)年輕化的趨勢，極大地危害了女性生命健康。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展受多因素、多通路的調(diào)控。近年來研究表明，肥胖可能增加宮頸癌的潛在發(fā)病率[1]。膳食中脂肪攝入增加是導致肥胖狀態(tài)的重要因素之一，且膳食脂肪可能是解釋肥胖與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展關系的潛在因素之一[2-3]。

目前，以“地中海食物”油酸為代表的單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)作為重要的抗腫瘤免疫營養(yǎng)物質(zhì)已引起廣泛關注[4-5]。研究表明，MUFA不僅能通過影響腫瘤細胞蛋白質(zhì)及DNA合成、破壞腫瘤細胞生物膜結構，還能誘導腫瘤細胞自噬及凋亡等機制發(fā)揮抗癌作用[6]。但近年來也報道了一些相反證據(jù)，MUFA，特別是油酸，可以促進胃癌和乳腺癌細胞的增殖和遷移發(fā)揮促癌作用[7]。同時，病例對照研究結果表明，MUFA可能會增加患胰腺癌的風險[8]，提示油酸有促癌作用。影響宮頸癌預后最重要的因素是原位侵襲和遠處轉(zhuǎn)移，因此，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是宮頸癌防治的關鍵。Src基因是在人類中較早發(fā)現(xiàn)的有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的原癌基因。Src蛋白激酶作為一種不需要受體和膜相關信號轉(zhuǎn)導的酶類，對腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和細胞分化均有調(diào)控作用，其異常活化及通路紊亂與腫瘤的高轉(zhuǎn)移性和預后不良關系密切[9]。目前，Src蛋白激酶小分子抑制劑的抗癌作用研究已經(jīng)進入了大量的臨床試驗階段。本課題組前期研究結果發(fā)現(xiàn)，高油酸飲食喂養(yǎng)(含45%的橄欖油)能夠促進裸鼠Hela細胞皮下成瘤并增加腫瘤轉(zhuǎn)移率，并進一步應用生物信息學分析了可能參與該過程的一些核心基因及通路[10]。本研究旨在探討高油酸飲食對Hela細胞增殖、遷移和侵襲等惡性表型的影響，以及在油酸刺激下Src通路的激活情況，為研究宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的機制提供一定的依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞

人宮頸癌細胞株Hela，經(jīng)過鑒定并由脂糖代謝性疾病重慶市重點實驗室保存。

1.1.2試劑

胎牛血清購于阿根廷NTC公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國 Hyclone公司；油酸購于美國Sigma公司；牛血清清蛋白購于中國BBI生命科學公司；CCK-8試劑購于日本同仁公司；EdU細胞增殖試劑盒購于廣州銳博公司；結晶紫染料購于美國Genview公司；基質(zhì)膠購于美國B&D公司；兔抗人Src和p-Src抗體均購于美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)

將含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的高糖DMEM作為生長培養(yǎng)基，于含5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2天換液，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞實驗前12 h將生長培養(yǎng)基更換為含有0.2%牛血清清蛋白的培養(yǎng)基。

1.2.2油酸和Src激酶抑制劑SU6656配制

稱取油酸鈉(相對分子質(zhì)量為304.45)粉末50 mg于1.5 mL EP管中,隨后加入1 080 μL 0.1 mmol/L NaOH溶液，置于90 ℃以上水浴鍋中加熱溶解其間需不斷搖晃，5～10 min待完全溶解后將溶液移入15 mL離心管中,并向其中加入5%牛血清清蛋白使最終體積為10.8 mL，此為油酸儲存液(終濃度為15 mmol/L)，使用時用0.2%牛血清清蛋白稀釋，獲得0、5、10 μmol/L的工作液。SU6656配制時溶于二甲基亞砜(DMSO)，將其配制成濃度為1 mmol/L的溶液，使用時用0.2%牛血清清蛋白稀釋，獲得0.5 μmol/L的工作液。機制探討實驗使用油酸及SU6656處理，共分為4組，其中NC組不使用油酸及SU6656處理，油酸組用10 μmol/L油酸處理，SU6656組用0.5 μmol/L SU6656處理,油酸+SU6656組使用10 μmol/L油酸聯(lián)合0.5 μmol/L SU6656處理。

1.2.3CCK-8實驗

將對數(shù)生長期Hela細胞消化、收集、制備單細胞懸液，5 000個/孔的密度接種到96孔板中，每組設5個復孔。CCK-8實驗于接種后6、24、48和72 h時間點進行檢測。細胞貼壁后換成含有不同濃度油酸(0、5、10 μmol/L)的工作液處理，其中NC組不使用油酸處理，油酸組使用5、10 μmol/L油酸處理。檢測時每孔添加CCK-8液10 μL并于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h。

1.2.4EdU細胞增殖實驗

將對數(shù)生長期Hela細胞以5 000個/孔的密度接種到96孔板中，每組設5個復孔。EdU實驗時，細胞于96孔板孵育24 h后加入EdU培養(yǎng)基(EdU濃度為50 μmol/L)孵育，然后使用多聚甲醛固定，甘氨酸中和后用滲透劑[含0.5%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(PBS)]于搖床孵育、清洗2次。隨后加入1×Apollo染色反應液染色，依次用PBS、甲醇再清洗。后用試劑盒中Hoechst33342反應液進行細胞核染色。最后熒光顯微鏡計數(shù)并分析。

1.2.5平板克隆集落生成實驗

對數(shù)期Hela細胞以每孔5 000個種于6孔板，用2 mL完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，5 d后予以油酸(10 μmol/L)處理，10 d后于顯微鏡下觀察集落形態(tài)，使用4%多聚甲醛固定細胞，用0.1%結晶紫染色，觀察集落生長情況。

1.2.6Transwell遷移實驗

取對數(shù)生長期細胞，PBS洗滌2次，用含不同濃度油酸的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為2×105/mL，將100 μL細胞懸液加入8 μm的Transwell小室上室內(nèi)，下室加入600 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，孵箱常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，PBS清洗后，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，然后于0.1%結晶紫中染色30 min，PBS清洗2次，以棉簽小心擦除濾膜內(nèi)面的細胞，用倒置顯微鏡在200倍進行拍照，用ImageJ軟件計算穿膜細胞數(shù)。

1.2.7Transwell侵襲實驗

將Matrigel用無血清高糖培養(yǎng)基按1∶3的比例稀釋，取40 μL Matrigel于Transwell小室的上室中，均勻鋪滿小室底部的聚碳酯膜上，并置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h待膠凝固。Transwell小室上室內(nèi)加入細胞懸液100 μL(40 000個/孔)，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，將24孔板置于孵箱培養(yǎng)72 h后，取出Transwell小室，PBS清洗，4%多聚甲醛固定30 min，然后用0.1%結晶紫染色30 min，PBS清洗2次，以棉簽小心擦除濾膜內(nèi)面的細胞，用倒置顯微鏡在200倍進行拍照，用ImageJ軟件計算穿膜細胞數(shù)。

1.2.8Western blot實驗

用RIPA分別提取NC組和油酸處理組(10 μmol/L處理48 h)細胞的總蛋白，使用BCA試劑盒檢測各種蛋白濃度后，確定上樣量。于8%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行等量總蛋白電泳，電轉(zhuǎn)移于聚偏氟乙烯(PVDF)膜后，在37 ℃條件下，3%牛血清清蛋白封閉1 h，隨后分別加入1∶1 000稀釋的Src和p-Src一抗，4 ℃搖床孵育過夜。次日用TBS-T清洗3次，每次15 min，接著加入1∶8 000稀釋的兔抗二抗，室溫搖床中孵育1 h，TBS-T清洗3次，每次15 min，隨后用電化學發(fā)光(ECL)方法檢測p-Src蛋白表達情況，用ImageJ軟件定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 油酸促進Hela細胞的增殖

CCK-8實驗顯示：與NC組比較，油酸組細胞增殖率增高，且10 μmol/L油酸組增殖率明顯高于5 μmol/L組(P<0.05)。平板克隆實驗顯示：與NC組比較，油酸組Hela細胞集落形成能力明顯增加(P<0.05)，且Hela細胞形成的單個集落更大。EdU細胞增殖實驗顯示：油酸組EdU細胞陽性率較NC組升高[(37±1)%vs.(29±1)%,P<0.05]，見圖1。

A：CCK-8實驗；B：平板克隆實驗；C：Edu細胞增殖實驗;a:P<0.05，與NC組比較；b:P<0.05，與5 μmol/L油酸組比較。

2.2 油酸促進Hela細胞的遷移和侵襲

Transwell遷移實驗和侵襲實驗顯示，與NC組比較，油酸組遷移和侵襲細胞數(shù)均明顯增多，且10 μmol/L油酸組多于5 μmol/L油酸組(P<0.05)，見圖2。

A：遷移實驗；B：侵襲實驗;a:P<0.05,與NC組比較；b:P<0.05，與5 μmol/L油酸組比較。

2.3 油酸能夠刺激Hela細胞原癌基因Src激活

與NC組比較，油酸組p-Src蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)，見圖3。

2.4 SU6656能抑制油酸對Hela細胞的促增殖作用

與油酸組比較，NC組、SU6656組和油酸+SU6656組增殖率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與NC組比較，SU6656組與油酸+SU6656組增殖率升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

2.5 SU6656能抑制油酸對Hela細胞的促遷移及侵襲作用

NC組、油酸組、SU6656組和油酸+SU665組遷移細胞數(shù)分別為(11.2±5.5)、(28.5±14.8)、(13.1±7.0)、(13.3±10.7)個，油酸組多于另外3組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。NC組、油酸組、SU6656組和油酸+SU6656組侵襲細胞數(shù)分別為(78.4±34.0)、(275.5±102.4)、(67.2±24.0)、(69.6±27.4)個，油酸組多于另外3組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5、6。

a:P<0.05,與NC組比較。

a:P<0.05,與油酸組比較。

a:P<0.05,與油酸組比較。

a:P<0.05,與油酸組比較。

3 討 論

宮頸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，雖然包括手術、放療、化療在內(nèi)的宮頸癌治療技術不斷改進，但晚期患者5年生存率仍低于50%[11]。宮頸癌的預后與癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關，侵襲和轉(zhuǎn)移是造成其死亡最重要的因素。但對于晚期和轉(zhuǎn)移的宮頸癌，治療效果不佳，因此，研究宮頸癌預防與治療方向也十分必要。

在癌細胞中，脂肪酸主要參與細胞膜的形成，細胞能量儲存和信號分子生成及轉(zhuǎn)導。此外，脂肪酸通過調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生的信號通路來影響癌癥的發(fā)展。油酸在橄欖油中含量高達80%，富含油酸的橄欖油被認為是傳統(tǒng)地中海飲食的關鍵營養(yǎng)成分，對心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生保護作用。另外，流行病學研究表明橄欖油可減少乳腺癌和結腸癌發(fā)病率，且油酸與肝癌發(fā)生風險呈負相關[12]。但也有油酸促進癌癥發(fā)生的證據(jù)，如油酸可增加葡萄糖的利用以促進膠質(zhì)母細胞的增殖，油酸與結腸腺瘤的發(fā)生呈正相關。硬脂酰輔酶a去飽和酶1(SCD1)可將飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為單不飽和脂肪酸，且SCD1已明確促進癌細胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移等過程，所以使得油酸對癌癥的影響尚存在爭議，而目前針對油酸對宮頸癌的研究較少。

Src激酶是原癌基因c-Src的主要產(chǎn)物，為非受體酪氨酸蛋白激酶，目前發(fā)現(xiàn)的家族成員有11個，Src是目前研究最多的成員之一[13]。Src由SH4結構域、特定片段、SH3結構域、SH2結構域、連接段、SH1結構域(蛋白酪氨酸激酶結構域)和羧基端調(diào)節(jié)尾端組成。Src在細胞增殖、分化、運動和定位等細胞進程中都發(fā)揮重要作用。研究表明，Src通路激活參與了結腸癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺等惡性腫瘤的進展[14]。Src激酶可參與多個信號通路，Src通路活化將激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途徑或與其他信號通路之間的聯(lián)系，對癌細胞的增殖、黏附及侵襲惡性表型有調(diào)控作用，其高表達或表達紊亂與某些腫瘤的高轉(zhuǎn)移性和預后不良密切相關。有研究報道在結腸癌中，腫瘤組織與癌旁組織比較，結腸癌組織的Src失調(diào)主要涉及蛋白質(zhì)過表達和通路過度激活[15]。在乳腺癌進展過程中，Src激活是表皮生長因子受體(EGFR)信號下游的關鍵事件，刺激周圍組織的遷移和侵襲。實驗研究證明抑制 Src激酶的活性或降低其表達可抑制多種癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時對腫瘤細胞耐藥發(fā)揮積極作用。事實上，抑制Src激酶阻礙了一些腫瘤誘導表型的開關，包括刺激癌癥相關成纖維細胞(CAFs)、血管生成和免疫浸潤[15]。PP2為Src激酶抑制劑之一，其可于體外實驗抑制膀胱癌細胞的遷移、侵襲等能力，且有濃度依賴性[16]，另外，有研究證明Src通路激活降低了卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性，同時這種抗性可以通過藥理學抑制Src來逆轉(zhuǎn)[17]。目前，全國多中心已開始進行大量藥物臨床試驗來評估實體瘤中的小分子Src家族抑制劑的抗癌作用[18]。SU6656是一種小分子吲哚酮，可特異性抑制Src激酶。由于其對Src的高度特異性，SU6656已成為Src相關信號轉(zhuǎn)導研究的重要工具。YANG等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中，Src激酶活性與遷移、侵襲相關蛋白[如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族蛋白]活性有正相關性，用SU6656干預可實現(xiàn)體外逆轉(zhuǎn)胃癌細胞的惡性表型。

迄今為止，大多數(shù)證據(jù)表明Src在侵襲性表型的維持中起主導作用，而不是在細胞周期進程中起主導作用。有研究提示油酸可通過ERK1/2的磷酸化激活并形成AP-1-DNA復合物促進乳腺癌細胞的增殖，而ERK1/2的激活和AP-1-DNA復合物的形成依賴于Src家族激酶的活性。目前關于Src及SU6656對宮頸癌的作用研究報道較少。因此，本研究通過Src激酶抑制劑SU6656干預Hela細胞，檢測其侵襲和遷移能力的變化，以期為尋找抗腫瘤治療的新靶點提供理論依據(jù)。

本研究結果顯示，油酸對Hela細胞的增殖、遷移、侵襲能力有促進作用，且隨濃度的增加效果越明顯。通過蛋白水平檢測，油酸可于體外刺激Src原癌基因表達，促進該通路激活。運用Src特異性抑制劑SU6656后，油酸對Hela細胞的促癌作用逆轉(zhuǎn)。綜上所述，Src激酶抑制劑在一定濃度油酸刺激下對Hela細胞的增殖、遷移和侵襲能力有抑制作用，但 SU6656抑制腫瘤侵襲和遷移能力的機制尚不清楚。因此，進一步探討SU6656抑癌的分子機制將會對宮頸癌防治提供一定理論依據(jù)。