超微血流成像技術(shù)對(duì)兔腹主動(dòng)脈斑塊易損性的研究*

王子龍,楊莉紅,楊寒凝,陸永萍△

(1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.云南省第二人民醫(yī)院，昆明 650021)

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管系統(tǒng)中最常見(jiàn)的疾病之一，易損斑塊對(duì)人體的危害性極大，且趨于年輕化。本研究擬用超微血流成像技術(shù)對(duì)兔腹主動(dòng)脈斑塊易損性進(jìn)行研究，以更好、更早地預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化所致的急性心腦血管疾病的發(fā)生，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性新西蘭大白兔60只，兔齡5周，體重(624±207)g。

1.2 方法

1.2.1腹主動(dòng)脈斑塊模型的制備

高脂喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)兔12周后行內(nèi)膜的球囊損傷術(shù)：經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射4%的戊巴比妥鈉(1 mL/kg)進(jìn)行全身麻醉，于股動(dòng)脈投影段切開(kāi)皮膚，分離后結(jié)扎遠(yuǎn)心端，見(jiàn)圖1。股動(dòng)脈近心端血流被提起的手術(shù)絲線阻斷；穿刺針以25°刺入股動(dòng)脈，放入導(dǎo)絲，退出穿刺針后沿導(dǎo)絲送入成人橈動(dòng)脈穿刺用鞘管，并在超聲引導(dǎo)下立即推入6F Fogarty球囊鞘管至腹腔干水平，注入空氣至2～4個(gè)大氣壓，回拉有阻力感即可，重復(fù)推拉5次以致腹主動(dòng)脈內(nèi)膜損傷。操作結(jié)束后用生理鹽水清洗并用青霉素粉涂抹創(chuàng)口預(yù)防感染。經(jīng)耳緣靜脈推注劑量250 mg/kg的牛血清清蛋白(GE，烏拉圭，SV30087.03)行免疫損傷，3 d，每天1次，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8周。

1.2.2超聲檢查

選用東芝公司Aplio 500超聲診斷儀,11-4L線陣探頭，頻率4～11 MHz。于20周末麻醉實(shí)驗(yàn)兔，在腹主動(dòng)脈投影位置橫縱切交叉掃描，觀察有無(wú)斑塊形成，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)斑塊后記錄斑塊相應(yīng)特征。

1.2.3超微血流成像檢查

找到目標(biāo)斑塊后，開(kāi)啟超微血流成像模式，選擇合適的深度和增益，觀察斑塊內(nèi)有無(wú)點(diǎn)、線狀超微血流聲像及個(gè)數(shù)，選擇血流最豐富區(qū)域，固定探頭，連續(xù)觀察不少于30 s，確認(rèn)血流信號(hào)無(wú)誤后，詳細(xì)記錄并存圖。根據(jù)血流強(qiáng)度分級(jí)，標(biāo)準(zhǔn)如下[1-2]，0級(jí)：斑塊內(nèi)無(wú)血流信號(hào)；1級(jí)：斑塊內(nèi)顯示1～3個(gè)點(diǎn)狀血流信號(hào)；2級(jí)：斑塊內(nèi)顯示3個(gè)以上點(diǎn)狀和(或)1～2處短線狀血流信號(hào)；3級(jí):斑塊內(nèi)顯示2處以上線狀且貫穿或大部貫穿的血流信號(hào)，或有血液流動(dòng)征。以上操作由1名中級(jí)醫(yī)師進(jìn)行，斑塊血流分級(jí)的統(tǒng)計(jì)分析匯總由2名高級(jí)醫(yī)師完成。選取超微血流顯像顯示血流信號(hào)最豐富的切面，運(yùn)用Adobe Photoshop CS5圖像分析軟件，計(jì)算整個(gè)斑塊及內(nèi)部的彩色血流信號(hào)面積，并計(jì)算彩色像素密度(MCD)[3]，即血流信號(hào)面積與斑塊總面積之比(此斑塊的MCD為圖2B與2C的像素之和與2A像素比值)，見(jiàn)圖2。根據(jù)MCD的數(shù)值來(lái)計(jì)算超微血流增強(qiáng)評(píng)分值，如MCD為1%，則超微血流增強(qiáng)評(píng)分值為1分，MCD為2%，則超微血流增強(qiáng)評(píng)分值為2分，以此類推，MCD為100%，則超微血流增強(qiáng)評(píng)分值為100分。

A：股動(dòng)脈分離操作；B：已分離出的股動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端黑色絲線為阻斷血流做準(zhǔn)備(黃色箭頭)。

A：斑塊總面積；B、C：2個(gè)血流信號(hào)面積。

1.2.4病理檢查

處死實(shí)驗(yàn)兔，分離并切開(kāi)腹主動(dòng)脈，找出與超聲圖像對(duì)應(yīng)的斑塊，用4%的甲醛溶液固定,行石蠟包埋，以5 μm厚度切取最大切面切片，行抗CD34抗體免疫組織化學(xué)染色。病理分型：依據(jù)文獻(xiàn)[4-5]方法將斑塊分為Ⅰ～Ⅵ共6種類型，Ⅰ型：巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞的沉積；Ⅱ型：脂質(zhì)在斑塊內(nèi)積聚到顯現(xiàn)脂肪點(diǎn)或條紋的點(diǎn)；Ⅲ型：細(xì)胞外脂質(zhì)沉積；Ⅳ型：細(xì)胞外脂質(zhì)變得致密并且更廣泛地形成脂質(zhì)核；Ⅴ型：纖維結(jié)締組織形成部分斑塊(有或沒(méi)有脂質(zhì)核)，在脂質(zhì)核心周圍，毛細(xì)血管增生和炎性反應(yīng)增加，包括淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，出現(xiàn)微血腫；Ⅵ型：破裂的斑塊，特征在于斑塊內(nèi)的出血和原位血栓形成，可導(dǎo)致栓塞或血管閉塞，暫不納入研究。Ⅰ～Ⅲ型被認(rèn)為是穩(wěn)定斑塊，即穩(wěn)定組；Ⅳ～Ⅵ型被認(rèn)為是易損斑塊，即易損組。微血管密度為200倍顯微鏡視野下每個(gè)視野內(nèi)CD34免疫組織化學(xué)檢測(cè)呈陽(yáng)性的血管數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兔腹主動(dòng)脈斑塊生長(zhǎng)情況及斑塊病理類型

存活的52只實(shí)驗(yàn)兔共檢出61個(gè)斑塊，其中Ⅰ型15個(gè)，Ⅱ型18個(gè)，Ⅲ型11個(gè)，Ⅳ型9個(gè)，Ⅴ型8個(gè)。

2.2 超微血流成像技術(shù)對(duì)各個(gè)病理分型斑塊的評(píng)價(jià)

2.2.161個(gè)兔腹主動(dòng)脈斑塊的超微血流成像結(jié)果

61個(gè)斑塊中，超微血流顯像顯示41個(gè)有不同強(qiáng)度血流信號(hào)，20個(gè)無(wú)血流信號(hào)。易損斑塊血流信號(hào)明顯，可見(jiàn)多個(gè)點(diǎn)狀甚至線狀血流信號(hào)；穩(wěn)定斑塊血流信號(hào)不明顯，無(wú)血流信號(hào)或僅可見(jiàn)1～2個(gè)點(diǎn)狀血流信號(hào)。超微血流成像技術(shù)檢測(cè)不同病理分型的斑塊，結(jié)果顯示病理分型與超微血流強(qiáng)度之間呈正相關(guān)(rs=0.735，P<0.05)，見(jiàn)表1、圖3。

表1 超微血流成像技術(shù)對(duì)不同病理分型斑塊的評(píng)價(jià)結(jié)果(n)

雙向等級(jí)資料，應(yīng)用秩相關(guān)檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)rs=0.735。

A：Ⅴ型斑塊的長(zhǎng)線狀血流信號(hào)；B：Ⅰ型斑塊的無(wú)明顯血流信號(hào)。

2.2.2兔腹主動(dòng)脈斑塊超微血流增強(qiáng)評(píng)分值與斑塊內(nèi)微血管數(shù)的比較

與穩(wěn)定組比較，易損組超微血流增強(qiáng)評(píng)分值更高，微血管數(shù)更多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。超微血流增強(qiáng)評(píng)分值與斑塊內(nèi)微血管數(shù)存在正相關(guān)性(rs=0.751，P<0.05)，見(jiàn)圖4、5。

表2 兩組超微血流增強(qiáng)評(píng)分值與斑塊內(nèi)微血管數(shù)比較

續(xù)表2 兩組超微血流增強(qiáng)評(píng)分值與斑塊內(nèi)微血管數(shù)比較

2.3 超微血流成像技術(shù)檢測(cè)斑塊的ROC曲線

將超微血流成像技術(shù)對(duì)斑塊的評(píng)分值繪制受試者工作特征(ROC)曲線，結(jié)果顯示曲線下面積為0.962，靈敏度為82.3%，特異度為95.4%，診斷易損斑塊的最佳分值界點(diǎn)為11.5分，見(jiàn)圖6。

A：Ⅰ型斑塊，其內(nèi)微血管數(shù)較少(黃色箭頭)；B：Ⅴ型斑塊，其內(nèi)可見(jiàn)較多的微血管(黃色箭頭)。

圖5 斑塊超微血流增強(qiáng)評(píng)分值與斑塊內(nèi)微血管數(shù)相關(guān)性

圖6 超微血流成像技術(shù)檢測(cè)斑塊的ROC曲線

3 討 論

動(dòng)脈粥樣斑塊的形成大多數(shù)與心腦血管疾病密切相關(guān)，斑塊的易損性直接影響了臨床的治療方案和有效性，而斑塊內(nèi)新生血管是斑塊易損性的標(biāo)志[6-8]，故掌握斑塊內(nèi)新生血管情況對(duì)預(yù)測(cè)和預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生有著十分重要的意義。目前能夠檢測(cè)斑塊內(nèi)新生血管的技術(shù)除了超聲造影，還有CT血管造影、磁共振血管成像等，但由于費(fèi)用昂貴，可重復(fù)性差，部分為有創(chuàng)檢查，且禁忌證多，難以在臨床全面推廣。

超微血流成像技術(shù)應(yīng)用了自適應(yīng)圖像處理的基本原理，將圖像逐像素處理，以分析血流及組織圖像的信息，對(duì)微血流和組織微小運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的頻譜信號(hào)的混雜分布區(qū)域的差異進(jìn)行濾波處理[9]。通過(guò)自適應(yīng)算法能提取微小血管中的低速血流信號(hào)，分辨率較普通彩色多普勒超聲高，無(wú)需注射造影劑即可過(guò)濾干擾信號(hào),從而達(dá)到類似造影的極低流速微小血管顯像效果[10-11]。何廣敏等[3]研究表明，MCD對(duì)血流的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度均高于超微血流分級(jí)，是一種可靠的定量診斷方法。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，斑塊內(nèi)微血管數(shù)與超微血流增強(qiáng)評(píng)分值、病理分型均呈正相關(guān)，說(shuō)明血流增強(qiáng)評(píng)分值越高的斑塊微血管數(shù)越多，血供越豐富，對(duì)應(yīng)的病理分型越高，斑塊越不穩(wěn)定，與薛莉等[12]研究結(jié)論有較高的一致性，即易損斑塊的發(fā)生、發(fā)展與斑塊內(nèi)微血管數(shù)的形成密不可分。

超微血流成像技術(shù)檢測(cè)頸動(dòng)脈斑塊的新生血管與超聲造影有良好的一致性[13-15]。研究表明，超微血流成像技術(shù)與超聲造影檢查評(píng)價(jià)斑塊內(nèi)血流情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)[16]。ROC曲線結(jié)果顯示，超微血流成像技術(shù)靈敏度與特異度均較高，同時(shí)還具備誤診率低、簡(jiǎn)單易行、可重復(fù)性好、檢查費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了超聲造影檢查的不足。魏小雨等[17]證明了超微血流成像技術(shù)是頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)新生血管低速血流安全有效的檢測(cè)方法，對(duì)斑塊穩(wěn)定性的評(píng)估具有重要意義，相對(duì)超聲造影檢查，某種程度上可以取而代之。

本研究的局限性為樣本量較小，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍不能完全代表人群的結(jié)果。此外，超微血流成像技術(shù)的應(yīng)用處于初級(jí)階段，對(duì)超聲診斷醫(yī)師及超聲設(shè)備的要求較高，容易出現(xiàn)誤差等。

綜上所述，超微血流成像技術(shù)可以在二維超聲的基礎(chǔ)上對(duì)不同病理分型的斑塊內(nèi)新生血管做出精確判斷，有望在臨床中推廣應(yīng)用，為臨床預(yù)防和診治動(dòng)脈粥樣硬化所致心腦血管疾病提供了強(qiáng)有力的影像學(xué)依據(jù)。