• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    柚皮素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用*

    2021-10-13 03:43:00李家富程曉洪
    重慶醫(yī)學(xué) 2021年18期
    關(guān)鍵詞:柚皮素氧化應(yīng)激試劑盒

    王 歡,李家富,蘭 卓,徐 楠,程曉洪,馮 健

    (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科,四川瀘州 646000)

    冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是心血管疾病引發(fā)死亡的主要原因之一[1],隨著再灌注技術(shù)應(yīng)用于臨床后,其相關(guān)的死亡率明顯下降,但缺血心肌恢復(fù)灌注時(shí),其組織損傷反而進(jìn)行性加重,從而產(chǎn)生一種為心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷的現(xiàn)象。即使如此,冠狀動(dòng)脈的盡早開放仍是急性心肌梗死的主要治療手段,因此改善I/R尤為重要。已有大量研究證明氧化應(yīng)激在I/R中扮演著重要的角色[2],而磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路是保護(hù)I/R分子機(jī)制中的經(jīng)典信號(hào)通路,可通過(guò)上調(diào)核因子E相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)增加內(nèi)源性抗氧化作用[3]。柚皮素又名4,5,7-三羥基黃烷酮,屬二氫黃酮類化合物,大量存在于柑橘類水果中,既往心血管研究中發(fā)現(xiàn)其有減輕糖尿病心肌損傷[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]作用。除此之外,國(guó)內(nèi)外研究中均發(fā)現(xiàn)柚皮素預(yù)處理對(duì)I/R有明顯保護(hù)作用,其作用機(jī)制與抗氧化應(yīng)激相關(guān)[6-7],但對(duì)其抗氧化應(yīng)激分子機(jī)制的研究較少,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠心臟I/R模型,探討柚皮素對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用及是否通過(guò)作用于PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)通道達(dá)到抗氧化應(yīng)激作用,為柚皮素的臨床應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康成年雄性SD大鼠32只,超級(jí)清潔級(jí),重量180~200 g,購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(鄂)2020-0018。適宜條件下飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房。

    1.1.2試劑與儀器

    柚皮素及PI3K/AKT通道抑制劑LY294002購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒、肌酸激酶(creatine kinase,CK)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;AKT、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;Nrf2、醌氧化還原酶1[NAD(P)H:Quinone oxidoreductase 1,NQO1]抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)抗體購(gòu)自武漢三鷹公司;電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自武漢阿斯本生物技術(shù)公司。電泳儀(北京市六一儀器廠);掃描儀(日本Canon公司);超凈工作臺(tái)(中國(guó)蘇凈安泰公司);酶標(biāo)儀(中國(guó)DIatek公司);臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器);PCR儀(杭州博日科技公司);熒光定量PCR儀(美國(guó)Life technologies公司)。

    1.2 方法

    1.2.1動(dòng)物分組

    采用隨機(jī)數(shù)字表法將32只大鼠分為假手術(shù)組(SHAM組)、I/R組、柚皮素組、柚皮素+LY294002(NL組),每組8只。柚皮素組及NL組腹腔注射100 mg/kg柚皮素,每天1次,連續(xù)7 d,NL組在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前30 min腹腔注射0.3 mg/kg LY294002,SHAM組及I/R組腹腔注射對(duì)應(yīng)劑量的生理鹽水。

    1.2.2模型建立

    參照文獻(xiàn)[8],將大鼠饑餓處理12 h后,予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,固定并氣管插管呼吸機(jī)正壓通氣、連接心電圖。在胸骨左緣第4肋間打開胸腔并暴露心臟,于左心耳根部下方2 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(SHAM組不結(jié)扎),結(jié)扎30 min,再灌注120 min。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后,心肌組織蒼白、發(fā)紺,心電圖顯示ST段抬高,再灌注后缺血區(qū)心肌紅潤(rùn),心電圖ST段下移1/2以上,表示造模成功。

    1.2.3大鼠心肌酶測(cè)定

    I/R結(jié)束后,收集各組大鼠靜脈血,離心后的上清液按照LDH、CK ELISA試劑盒說(shuō)明,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)LDH、CK水平。

    1.2.4心肌組織病理學(xué)觀察

    將各組大鼠的心肌組織用4%多聚甲醛固定24 h后,進(jìn)行脫水、包埋、切片、脫蠟、蘇木素-伊紅(HE)染色,然后封片,在顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化。

    1.2.5TUNEL熒光染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況

    選各組石蠟切片脫蠟、孵育、破膜、孵育、脫色,取適量TUNEL試劑盒內(nèi)試劑按說(shuō)明書中比例覆蓋組織,并進(jìn)行孵育、洗片,最后滴加抗熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察。

    1.2.6心肌組織SOD、MDA水平檢測(cè)

    將各組心臟組織采用酶分解法分離,然后分別采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性,采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA水平,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

    1.2.7化學(xué)熒光法檢測(cè)心肌組織ROS水平

    取各組大鼠心肌組織,稱取重量,加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS),冰浴條件下勻漿,然后離心,收取上清液,留部分上清液進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),部分加入配置好的DCFH-DA和PBS混合液,然后使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

    1.2.8Western blot檢測(cè)心肌組織AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1水平

    取各組大鼠心臟組織依次經(jīng)過(guò)提取總蛋白溶液、測(cè)定樣品蛋白濃度、分離和濃縮制膠、上樣、電泳轉(zhuǎn)膜處理后,加入按比例稀釋好的一抗AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1、GAPDH 4 ℃過(guò)夜,用TBST洗3次,加入稀釋液稀釋好的二抗,室溫孵育、搖床,加入新鮮配制的ECL混合溶液,暗室中曝光。將膠片進(jìn)行掃描存檔,AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的吸光度值。

    1.2.9逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)Nrf2、HO-1基因的轉(zhuǎn)錄水平

    取心臟組織,充分研磨,勻漿液中加入三氯甲烷,充分混勻,冰上靜置5 min,混合液離心,吸取上清液加入等體積4 ℃預(yù)冷的異丙醇,顛倒混勻,—20 ℃靜置15 min,再次離心,留置沉淀,加入4 ℃預(yù)冷的75%乙醇混勻,清洗RNA沉淀,再次離心,倒掉液體,乙醇充分揮發(fā)后加入RNase-Free水,充分溶解RNA。在冰上配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,GAPDH上游引物序列5′-GCC AAG GTC ATC CAT GAC AAC-3′,下游引物序列5′-GTG GAT GCA GGG ATG ATG TTC-3′;Nrf2上游引物序列5′-CAA CTG GAT GAA GAG ACC GGA G-3′,下游引物序列5′-TAT GCT GCT TAA ATC AGT CAT GGC-3′;HO-1上游引物序列5′-GTG ACA GAA GAG GCT AAG ACC G-3′,下游引物序列5′-GGC CAA CAC TGC ATT TAC ATG G-3′,合成第一鏈cDNA,并在PCR儀上進(jìn)行RT-PCR。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠血清中LDH、CK的水平

    與SHAM組比較,I/R組及NL組血清中LDH、CK活性水平明顯升高(P<0.05);與I/R組比較,柚皮素組及NL組LDH、CK活性水平明顯降低(P<0.05);與柚皮素組比較,NL組LDH、CK活性水平明顯升高(P<0.05),見表1。

    表1 各組大鼠血清中LDH、CK的水平

    2.2 各組大鼠心肌組織病理結(jié)果

    心肌組織HE染色顯示,SHAM組心肌纖維分布均勻,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清楚,無(wú)炎性細(xì)胞。與SHAM組比較,I/R組心肌纖維排列紊亂,心肌細(xì)胞腫脹、破裂、溶解,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與I/R組比較,柚皮素組心肌纖維排列稍整齊,心肌細(xì)胞破壞明顯減少,炎性細(xì)胞明顯減少。與柚皮素組比較,NL組心肌組織肌纖維排列紊亂較明顯,心肌細(xì)胞破壞增加,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更明顯,見圖1。

    圖1 各組大鼠心肌組織病理結(jié)果(HE染色,×400)

    2.3 各組大鼠心肌組織凋亡情況

    正常心肌細(xì)胞核染色為藍(lán)色,凋亡細(xì)胞核染色為綠色熒光,與SHAM組比較,I/R組凋亡細(xì)胞明顯增加,凋亡率明顯升高(P<0.05)。與I/R組比較,柚皮素組凋亡細(xì)胞明顯減少,凋亡率明顯降低(P<0.05)。與柚皮素組比較,NL組凋亡細(xì)胞明顯增加,凋亡率明顯升高(P<0.05),見圖2、3。

    圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL染色(×400)

    a:P<0.05,與SHAM組比較;b:P<0.05,與I/R組比較;c:P<0.05,與柚皮素組比較。

    2.4 各組大鼠心肌組織SOD活性水平、MDA及ROS水平比較

    與SHAM組比較,I/R組及NL組SOD活性降低,MDA、ROS水平升高(P<0.05)。與I/R組比較,柚皮素組及NL組SOD活性升高,MDA、ROS水平降低(P<0.05)。與柚皮素組比較,NL組SOD活性降低,MDA、ROS水平升高(P<0.05),見表2。

    表2 各組大鼠心肌組織SOD活性水平、MDA及ROS水平比較

    續(xù)表2 各組大鼠心肌組織SOD活性水平、MDA及ROS水平比較

    2.5 各組大鼠心肌組織AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)水平比較

    各組AKT表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與SHAM組比較,I/R組心肌組織p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1水平升高,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與I/R組比較,柚皮素組及NL組p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1水平明顯升高(P<0.05);與柚皮素組比較,NL組p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),見圖4、5。

    a:P<0.05,與SHAM組比較;b:P<0.05,與I/R組比較;c:P<0.05,與柚皮素組比較。

    a:P<0.05,與SHAM組比較;b:P<0.05,與I/R組比較;c:P<0.05,與柚皮素組比較。

    2.6 各組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1 mRNA水平比較

    與SHAM組比較,I/R組心肌組織Nrf2、HO-1 mRNA水平升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與I/R組比較,柚皮素組及NL組Nrf2、HO-1 mRNA水平明顯升高(P<0.05);與柚皮素組比較,NL組Nrf2、HO-1 mRNA水平明顯降低(P<0.05),見圖6。

    a:P<0.05,與SHAM組比較;b:P<0.05,與I/R組比較;c:P<0.05,與柚皮素組比較。

    3 討 論

    盡管從基礎(chǔ)和臨床進(jìn)行了廣泛研究,心肌I/R損傷的機(jī)制仍然不完全清楚。目前主要有氧化應(yīng)激損傷、鈣離子超載、心肌能量代謝障礙、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞凋亡和線粒體損傷等幾種學(xué)說(shuō)。氧化應(yīng)激損傷作為大部分疾病的主要病理變化過(guò)程,亦在I/R中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)以飲食或藥用植物為基礎(chǔ)的天然化合物在疾病中的應(yīng)用已成為醫(yī)學(xué)研究中的趨勢(shì)。柚皮素作為一種新型天然化合產(chǎn)物,在肝癌[9]、二氧化鈦引起的關(guān)節(jié)炎[10]、預(yù)防脂肪肝[11]、糖尿病心肌病[4]等研究中均表現(xiàn)出明顯抗氧化作用。

    LDH、CK為反映心肌損傷的常見指標(biāo),ROS、MDA為氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)的重要產(chǎn)物,而SOD則為對(duì)抗氧化損傷的活性物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠心肌I/R模型,檢測(cè)上述指標(biāo),觀察柚皮素對(duì)心肌I/R的抗氧化保護(hù)效應(yīng)。結(jié)果顯示I/R后心肌損傷明顯加重,氧化物質(zhì)水平增加,抗氧化物質(zhì)活性水平降低,而柚皮素預(yù)處理后明顯減輕了上述變化。提示心肌I/R時(shí)存在氧化應(yīng)激損傷,而柚皮素在一定程度上可減輕這種損傷。

    在柚皮素保護(hù)心肌I/R損傷抗氧化分子機(jī)制研究中,YU等[7]發(fā)現(xiàn)柚皮素可通過(guò)環(huán)鳥苷酸/蛋白激酶GIα(cyclic unanosine monophosphate /protein kinase GIα,cGMP/PKGIα)信號(hào)傳導(dǎo)減少氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)應(yīng)激,從而預(yù)防I/R損傷。MENG等[6]發(fā)現(xiàn)柚皮素具有抗I/R損傷的心臟保護(hù)作用,可以通過(guò)激活細(xì)胞和線粒體膜中的三磷酸腺苷敏感鉀通道增強(qiáng)心肌的抗氧化能力來(lái)實(shí)現(xiàn)。但調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的經(jīng)典通路PI3K/AKT尚無(wú)報(bào)道。PI3K/AKT曾在不同組織表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用。而有趣的是,ZHAO等[12]發(fā)現(xiàn)柚皮素在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中通過(guò)抑制PI3K/AKT通道發(fā)揮氧化還原調(diào)節(jié)作用。ZHANG等[13]研究顯示柚皮素可通過(guò)激活PI3K/AKT通路對(duì)半乳糖誘導(dǎo)的小鼠衰老發(fā)揮抗氧化作用。PI3K/AKT通道在氧化還原穩(wěn)態(tài)中有著獨(dú)特的作用,既可以激活ROS的產(chǎn)生,又能促進(jìn)抗氧化物質(zhì)的釋放[14]。不同組織器官氧化還原平衡點(diǎn)及啟動(dòng)內(nèi)源性抗氧化能力不同,可能導(dǎo)致PI3K/AKT通道在氧化與抗氧化平衡中作用方向不同。

    本研究發(fā)現(xiàn)柚皮素預(yù)處理明顯增強(qiáng)了I/R后AKT的磷酸化,使用PI3K/AKT通道抑制劑LY294002后,心肌組織AKT的磷酸化被明顯抑制,柚皮素介導(dǎo)的心肌組織保護(hù)作用和抗氧化作用也被明顯抑制,說(shuō)明柚皮素可能通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT信號(hào)途徑減輕大鼠心肌氧化應(yīng)激損傷。

    眾所周知,PI3K/AKT下游有多條信號(hào)傳導(dǎo)通路,其中Nrf2/HO-1通路在機(jī)體抗氧化機(jī)制中有至關(guān)重要的作用[15],曾有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)沉默Nrf2、HO-1基因能明顯地抑制ROS的清除、增加細(xì)胞的損傷[16]。YANG等[17]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷Ⅳ通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT途徑上調(diào)Nrf2/HO-1通路抑制缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌損傷。此外,SONG等[18]發(fā)現(xiàn)使用PI3K抑制劑LY294002及AKT抑制劑曲西立濱能明顯降低Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)并發(fā)揮抗氧化和心肌保護(hù)作用。Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子[19]。在生理情況下,Nrf2被kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(recombinant kelch like ECH associated protein 1,Keap1)結(jié)合并定位在細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),大量ROS產(chǎn)生,使Keap1磷酸化發(fā)生構(gòu)象變化釋放Nrf2,Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控SOD、HO-1、NQO1等抗氧化基因表達(dá)[20]。HO-1是一種重要的抗氧化應(yīng)激和組織保護(hù)酶,可分解血紅素產(chǎn)生具有抗氧化作用的一氧化碳和膽綠素,還可誘導(dǎo)多種抗氧化信號(hào)通路,從而明顯減少細(xì)胞損傷并保護(hù)器官功能[21]。作為一種多功能酶,NQO1可以還原輔酶Q10和α-生育酚,使其發(fā)揮抗氧化作用,還能直接還原超氧化物,在抗氧化機(jī)制中有一定作用[22]。本實(shí)驗(yàn)提示柚皮素預(yù)處理促進(jìn)了Nrf2的表達(dá),從而促進(jìn)下游HO-1、NQO1等抗氧化物質(zhì)表達(dá),而這種作用在使用LY294002后被明顯逆轉(zhuǎn),提示柚皮素可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)途徑而激活下游Nrf2/HO-1/NQO1通路。

    綜上所述,柚皮素在一定程度上減輕了I/R引起的氧化損傷來(lái)發(fā)揮心肌保護(hù)作用,可能與調(diào)控PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。本研究初步探討了柚皮素在大鼠心肌I/R損傷中抗氧化應(yīng)激作用的分子機(jī)制,由于PI3K/AKT通路在調(diào)控凋亡、炎癥中亦有明顯作用,在本實(shí)驗(yàn)中還顯示,在柚皮素作用下,心肌凋亡率明顯下降及病理組織炎癥細(xì)胞明顯減少,但這是否與柚皮素抗炎、抗凋亡有關(guān),仍待進(jìn)一步探討。

    猜你喜歡
    柚皮素氧化應(yīng)激試劑盒
    柚皮素對(duì)胰脂肪酶抑制作用的研究
    基于炎癥-氧化應(yīng)激角度探討中藥對(duì)新型冠狀病毒肺炎的干預(yù)作用
    柚皮素脂質(zhì)體對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠脂質(zhì)代謝的影響及機(jī)制研究*
    柚皮素磷脂復(fù)合物的制備和表征
    中成藥(2018年7期)2018-08-04 06:04:18
    柚皮素-銅配合物的合成、表征及其抗氧化活性研究
    氧化應(yīng)激與糖尿病視網(wǎng)膜病變
    GlobalFiler~? PCR擴(kuò)增試劑盒驗(yàn)證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗(yàn)證
    氧化應(yīng)激與結(jié)直腸癌的關(guān)系
    牛結(jié)核病PCR診斷試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究
    一区在线观看完整版| 欧美成人午夜精品| 搡老岳熟女国产| 成人亚洲精品一区在线观看| 制服诱惑二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲国产精品999在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| 日韩高清综合在线| 午夜久久久在线观看| 久久草成人影院| 在线观看日韩欧美| 十八禁人妻一区二区| 在线观看日韩欧美| 久久久国产成人精品二区 | 新久久久久国产一级毛片| 久久久国产欧美日韩av| 国产高清视频在线播放一区| 免费不卡黄色视频| 性欧美人与动物交配| 在线av久久热| 99久久综合精品五月天人人| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产精品 欧美亚洲| 国产成人av激情在线播放| 极品人妻少妇av视频| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲三区欧美一区| 精品电影一区二区在线| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 另类亚洲欧美激情| 午夜福利一区二区在线看| 色在线成人网| 欧美久久黑人一区二区| 国产区一区二久久| 欧美黄色淫秽网站| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 99久久国产精品久久久| 老司机福利观看| 国产成人av激情在线播放| 免费日韩欧美在线观看| 欧美日韩av久久| av电影中文网址| 咕卡用的链子| 中文字幕高清在线视频| 国产片内射在线| 国产成人欧美| 久热爱精品视频在线9| av免费在线观看网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜视频精品福利| av中文乱码字幕在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久中文字幕一级| 两性夫妻黄色片| 中出人妻视频一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 黄色 视频免费看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲人成电影观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲精品国产色婷婷电影| netflix在线观看网站| 亚洲专区国产一区二区| 18禁观看日本| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 99re在线观看精品视频| 精品电影一区二区在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品九九99| 久久久久久久久久久久大奶| aaaaa片日本免费| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品国产乱子伦一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | av福利片在线| 日韩大尺度精品在线看网址 | 国产午夜精品久久久久久| 99香蕉大伊视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲av电影在线进入| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| netflix在线观看网站| 波多野结衣高清无吗| 黑丝袜美女国产一区| av片东京热男人的天堂| 欧美国产精品va在线观看不卡| 美女午夜性视频免费| 久久久久久久精品吃奶| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产乱人伦免费视频| 亚洲视频免费观看视频| 国产精品成人在线| 免费在线观看日本一区| 在线视频色国产色| 高清毛片免费观看视频网站 | 国产免费av片在线观看野外av| 又大又爽又粗| 成人精品一区二区免费| 男女下面进入的视频免费午夜 | 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产1区2区3区精品| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产亚洲精品久久久久久毛片| 一二三四社区在线视频社区8| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美国产精品va在线观看不卡| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产国语露脸激情在线看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产精品久久久av美女十八| 久久性视频一级片| 午夜福利影视在线免费观看| 国产一卡二卡三卡精品| 国产亚洲欧美98| 美女福利国产在线| av欧美777| 男人的好看免费观看在线视频 | 成在线人永久免费视频| 伦理电影免费视频| 午夜视频精品福利| 亚洲av熟女| 制服人妻中文乱码| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产成人精品久久二区二区91| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 久久性视频一级片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品国产av在线观看| 欧美乱妇无乱码| 一区二区三区国产精品乱码| 免费av毛片视频| 99香蕉大伊视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 黄片小视频在线播放| 亚洲人成电影免费在线| 精品福利观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 视频区图区小说| 免费日韩欧美在线观看| 国产一区二区激情短视频| 性欧美人与动物交配| av免费在线观看网站| 十八禁网站免费在线| 国产麻豆69| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 99热只有精品国产| 国产麻豆69| 老司机在亚洲福利影院| 午夜福利免费观看在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 97碰自拍视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 波多野结衣一区麻豆| 麻豆一二三区av精品| 亚洲第一av免费看| av福利片在线| 757午夜福利合集在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| 国产麻豆69| 亚洲欧美一区二区三区久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美黑人精品巨大| 欧美日本中文国产一区发布| 桃红色精品国产亚洲av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 69av精品久久久久久| 亚洲免费av在线视频| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲精品中文字幕在线视频| 黄片小视频在线播放| www.www免费av| 伦理电影免费视频| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久狼人影院| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日本一区二区免费在线视频| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 精品一品国产午夜福利视频| 午夜亚洲福利在线播放| 日本vs欧美在线观看视频| 一区二区三区国产精品乱码| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久中文看片网| a在线观看视频网站| 国产人伦9x9x在线观看| 少妇 在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 99国产综合亚洲精品| 制服诱惑二区| 久久热在线av| 亚洲中文字幕日韩| 国产一卡二卡三卡精品| 超色免费av| 天堂影院成人在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 免费av毛片视频| 99riav亚洲国产免费| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 欧美av亚洲av综合av国产av| 极品教师在线免费播放| 久久这里只有精品19| 免费在线观看日本一区| 超碰97精品在线观看| 免费在线观看完整版高清| 18美女黄网站色大片免费观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 又黄又爽又免费观看的视频| 天天影视国产精品| 丝袜美腿诱惑在线| 两人在一起打扑克的视频| 成人精品一区二区免费| 大型黄色视频在线免费观看| 成年人免费黄色播放视频| 十八禁人妻一区二区| 国产高清国产精品国产三级| 曰老女人黄片| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久99一区二区三区| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲av成人一区二区三| 99国产极品粉嫩在线观看| 露出奶头的视频| 无人区码免费观看不卡| 国产成人精品久久二区二区免费| 999久久久国产精品视频| 成在线人永久免费视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产免费男女视频| 新久久久久国产一级毛片| 久久中文字幕人妻熟女| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲中文日韩欧美视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久久久久久午夜电影 | 女同久久另类99精品国产91| 国产精品久久久人人做人人爽| a级毛片在线看网站| 成人影院久久| 久久香蕉精品热| 午夜福利,免费看| 久久久久国内视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 水蜜桃什么品种好| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲精华国产精华精| 久久久久精品国产欧美久久久| 在线观看免费视频日本深夜| 国产欧美日韩一区二区三| 十八禁人妻一区二区| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲国产欧美网| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲男人天堂网一区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 男男h啪啪无遮挡| 搡老岳熟女国产| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久久久久久中文| 天天影视国产精品| 99riav亚洲国产免费| 久久 成人 亚洲| 搡老岳熟女国产| 国产成人影院久久av| 一级毛片精品| 亚洲国产精品sss在线观看 | 91老司机精品| 乱人伦中国视频| 久久中文字幕一级| 国产精品 欧美亚洲| 动漫黄色视频在线观看| 露出奶头的视频| 操出白浆在线播放| 在线国产一区二区在线| 日韩成人在线观看一区二区三区| 交换朋友夫妻互换小说| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产精品一区二区三区四区久久 | 亚洲全国av大片| 久久人妻熟女aⅴ| av天堂久久9| 亚洲专区中文字幕在线| 麻豆久久精品国产亚洲av | 在线观看免费高清a一片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 免费看十八禁软件| 一级毛片精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久性视频一级片| 美国免费a级毛片| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 日韩精品青青久久久久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 91大片在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 母亲3免费完整高清在线观看| 脱女人内裤的视频| 免费少妇av软件| tocl精华| 日韩免费高清中文字幕av| 国产精品国产av在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 美女国产高潮福利片在线看| 国产一区二区三区综合在线观看| www国产在线视频色| 久久精品91蜜桃| 欧美激情高清一区二区三区| 久久影院123| 97碰自拍视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 超碰97精品在线观看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 搡老乐熟女国产| 日韩精品青青久久久久久| a级毛片在线看网站| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 色综合欧美亚洲国产小说| 丝袜在线中文字幕| 最近最新中文字幕大全免费视频| 日韩大尺度精品在线看网址 | 长腿黑丝高跟| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 悠悠久久av| 亚洲七黄色美女视频| 看免费av毛片| 亚洲自拍偷在线| 午夜精品在线福利| 热99国产精品久久久久久7| 国产成年人精品一区二区 | 国产不卡一卡二| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品福利观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产高清videossex| 新久久久久国产一级毛片| 大香蕉久久成人网| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久精品影院6| 欧美中文综合在线视频| 亚洲全国av大片| 久久久久国内视频| 欧美乱色亚洲激情| 老汉色av国产亚洲站长工具| 美女扒开内裤让男人捅视频| 老汉色∧v一级毛片| 欧美成人性av电影在线观看| 国产1区2区3区精品| 国产免费av片在线观看野外av| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲三区欧美一区| 国产亚洲精品久久久久5区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 一级a爱片免费观看的视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 深夜精品福利| 老司机福利观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲人成电影观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 美女高潮到喷水免费观看| svipshipincom国产片| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精品久久视频播放| 久久精品国产综合久久久| 亚洲成av片中文字幕在线观看| av网站在线播放免费| 久久久久亚洲av毛片大全| 中文欧美无线码| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 久久人妻福利社区极品人妻图片| xxx96com| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美最黄视频在线播放免费 | 一级,二级,三级黄色视频| 成人精品一区二区免费| 1024香蕉在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲精品在线美女| 狠狠狠狠99中文字幕| 男男h啪啪无遮挡| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲成国产人片在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 国产乱人伦免费视频| 久久中文字幕人妻熟女| 高清在线国产一区| 久久久国产欧美日韩av| 后天国语完整版免费观看| 亚洲一区中文字幕在线| 视频区欧美日本亚洲| 国产成人av激情在线播放| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 热99re8久久精品国产| 麻豆久久精品国产亚洲av | 国产99白浆流出| 久久久久九九精品影院| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 一本综合久久免费| 天天添夜夜摸| 久久中文字幕人妻熟女| av欧美777| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产精品亚洲一级av第二区| 美女大奶头视频| 天堂中文最新版在线下载| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久香蕉激情| 一边摸一边做爽爽视频免费| 91av网站免费观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| av有码第一页| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产欧美日韩一区二区三| 性少妇av在线| ponron亚洲| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 成人免费观看视频高清| 淫妇啪啪啪对白视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 老司机福利观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产99白浆流出| 又大又爽又粗| 9热在线视频观看99| 久久中文字幕人妻熟女| 丁香六月欧美| 1024香蕉在线观看| 多毛熟女@视频| 免费少妇av软件| 成人亚洲精品av一区二区 | 久久草成人影院| 日本 av在线| 午夜免费鲁丝| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一级黄色大片毛片| 女警被强在线播放| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲中文av在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 高清毛片免费观看视频网站 | 大香蕉久久成人网| 国产av在哪里看| 免费av中文字幕在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲一区二区三区不卡视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 嫩草影视91久久| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产91精品成人一区二区三区| 成人精品一区二区免费| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产乱人伦免费视频| 一区在线观看完整版| 精品久久久久久,| 亚洲精品国产色婷婷电影| 五月开心婷婷网| 午夜91福利影院| av超薄肉色丝袜交足视频| 成人av一区二区三区在线看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 99热只有精品国产| 亚洲专区字幕在线| 久久久久九九精品影院| 新久久久久国产一级毛片| www.熟女人妻精品国产| 90打野战视频偷拍视频| 黄色成人免费大全| 亚洲人成伊人成综合网2020| 免费av毛片视频| 在线国产一区二区在线| 中国美女看黄片| 男人舔女人的私密视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 中文欧美无线码| 村上凉子中文字幕在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 午夜亚洲福利在线播放| 国产99白浆流出| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美午夜高清在线| 午夜日韩欧美国产| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 99热只有精品国产| 高清欧美精品videossex| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲 国产 在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 69精品国产乱码久久久| 一区福利在线观看| 亚洲在线自拍视频| 免费观看人在逋| 妹子高潮喷水视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 99国产精品免费福利视频| 午夜福利影视在线免费观看| 成人手机av| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品久久久久久久久久免费视频 | 窝窝影院91人妻| 最近最新中文字幕大全免费视频| 12—13女人毛片做爰片一| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久香蕉国产精品| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产主播在线观看一区二区| 国产成人精品久久二区二区免费| www.www免费av| 村上凉子中文字幕在线| 日韩大尺度精品在线看网址 | 在线观看日韩欧美| 韩国精品一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 色在线成人网| svipshipincom国产片| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 精品高清国产在线一区| 国产黄色免费在线视频| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美乱码精品一区二区三区| 91国产中文字幕| 日本欧美视频一区| 免费观看精品视频网站| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲成人久久性| 日韩欧美在线二视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 色老头精品视频在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 黄色女人牲交| av电影中文网址| 久久久国产成人免费| 黄色女人牲交| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美色视频一区免费| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 91精品国产国语对白视频| 国产成人影院久久av| 自线自在国产av| 欧美大码av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 自线自在国产av| xxx96com| 精品福利永久在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 脱女人内裤的视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 黄色a级毛片大全视频| 夜夜爽天天搞| 色在线成人网| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 91大片在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 乱人伦中国视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲国产精品sss在线观看 | 91精品三级在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| www国产在线视频色| 久久久国产精品麻豆|