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    柚皮素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用*

    2021-10-13 03:43:00李家富程曉洪
    重慶醫(yī)學(xué) 2021年18期
    關(guān)鍵詞:柚皮素氧化應(yīng)激試劑盒

    王 歡,李家富,蘭 卓,徐 楠,程曉洪,馮 健

    (西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科,四川瀘州 646000)

    冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是心血管疾病引發(fā)死亡的主要原因之一[1],隨著再灌注技術(shù)應(yīng)用于臨床后,其相關(guān)的死亡率明顯下降,但缺血心肌恢復(fù)灌注時(shí),其組織損傷反而進(jìn)行性加重,從而產(chǎn)生一種為心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷的現(xiàn)象。即使如此,冠狀動(dòng)脈的盡早開放仍是急性心肌梗死的主要治療手段,因此改善I/R尤為重要。已有大量研究證明氧化應(yīng)激在I/R中扮演著重要的角色[2],而磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路是保護(hù)I/R分子機(jī)制中的經(jīng)典信號(hào)通路,可通過(guò)上調(diào)核因子E相關(guān)因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)增加內(nèi)源性抗氧化作用[3]。柚皮素又名4,5,7-三羥基黃烷酮,屬二氫黃酮類化合物,大量存在于柑橘類水果中,既往心血管研究中發(fā)現(xiàn)其有減輕糖尿病心肌損傷[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]作用。除此之外,國(guó)內(nèi)外研究中均發(fā)現(xiàn)柚皮素預(yù)處理對(duì)I/R有明顯保護(hù)作用,其作用機(jī)制與抗氧化應(yīng)激相關(guān)[6-7],但對(duì)其抗氧化應(yīng)激分子機(jī)制的研究較少,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠心臟I/R模型,探討柚皮素對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用及是否通過(guò)作用于PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)通道達(dá)到抗氧化應(yīng)激作用,為柚皮素的臨床應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    健康成年雄性SD大鼠32只,超級(jí)清潔級(jí),重量180~200 g,購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(鄂)2020-0018。適宜條件下飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房。

    1.1.2試劑與儀器

    柚皮素及PI3K/AKT通道抑制劑LY294002購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒、肌酸激酶(creatine kinase,CK)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;AKT、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;Nrf2、醌氧化還原酶1[NAD(P)H:Quinone oxidoreductase 1,NQO1]抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)抗體購(gòu)自武漢三鷹公司;電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自武漢阿斯本生物技術(shù)公司。電泳儀(北京市六一儀器廠);掃描儀(日本Canon公司);超凈工作臺(tái)(中國(guó)蘇凈安泰公司);酶標(biāo)儀(中國(guó)DIatek公司);臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器);PCR儀(杭州博日科技公司);熒光定量PCR儀(美國(guó)Life technologies公司)。

    1.2 方法

    1.2.1動(dòng)物分組

    采用隨機(jī)數(shù)字表法將32只大鼠分為假手術(shù)組(SHAM組)、I/R組、柚皮素組、柚皮素+LY294002(NL組),每組8只。柚皮素組及NL組腹腔注射100 mg/kg柚皮素,每天1次,連續(xù)7 d,NL組在結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前30 min腹腔注射0.3 mg/kg LY294002,SHAM組及I/R組腹腔注射對(duì)應(yīng)劑量的生理鹽水。

    1.2.2模型建立

    參照文獻(xiàn)[8],將大鼠饑餓處理12 h后,予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,固定并氣管插管呼吸機(jī)正壓通氣、連接心電圖。在胸骨左緣第4肋間打開胸腔并暴露心臟,于左心耳根部下方2 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(SHAM組不結(jié)扎),結(jié)扎30 min,再灌注120 min。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后,心肌組織蒼白、發(fā)紺,心電圖顯示ST段抬高,再灌注后缺血區(qū)心肌紅潤(rùn),心電圖ST段下移1/2以上,表示造模成功。

    1.2.3大鼠心肌酶測(cè)定

    I/R結(jié)束后,收集各組大鼠靜脈血,離心后的上清液按照LDH、CK ELISA試劑盒說(shuō)明,采用酶標(biāo)儀檢測(cè)LDH、CK水平。

    1.2.4心肌組織病理學(xué)觀察

    將各組大鼠的心肌組織用4%多聚甲醛固定24 h后,進(jìn)行脫水、包埋、切片、脫蠟、蘇木素-伊紅(HE)染色,然后封片,在顯微鏡下觀察心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化。

    1.2.5TUNEL熒光染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況

    選各組石蠟切片脫蠟、孵育、破膜、孵育、脫色,取適量TUNEL試劑盒內(nèi)試劑按說(shuō)明書中比例覆蓋組織,并進(jìn)行孵育、洗片,最后滴加抗熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察。

    1.2.6心肌組織SOD、MDA水平檢測(cè)

    將各組心臟組織采用酶分解法分離,然后分別采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性,采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA水平,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

    1.2.7化學(xué)熒光法檢測(cè)心肌組織ROS水平

    取各組大鼠心肌組織,稱取重量,加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS),冰浴條件下勻漿,然后離心,收取上清液,留部分上清液進(jìn)行蛋白定量檢測(cè),部分加入配置好的DCFH-DA和PBS混合液,然后使用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。

    1.2.8Western blot檢測(cè)心肌組織AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1水平

    取各組大鼠心臟組織依次經(jīng)過(guò)提取總蛋白溶液、測(cè)定樣品蛋白濃度、分離和濃縮制膠、上樣、電泳轉(zhuǎn)膜處理后,加入按比例稀釋好的一抗AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1、GAPDH 4 ℃過(guò)夜,用TBST洗3次,加入稀釋液稀釋好的二抗,室溫孵育、搖床,加入新鮮配制的ECL混合溶液,暗室中曝光。將膠片進(jìn)行掃描存檔,AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的吸光度值。

    1.2.9逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)Nrf2、HO-1基因的轉(zhuǎn)錄水平

    取心臟組織,充分研磨,勻漿液中加入三氯甲烷,充分混勻,冰上靜置5 min,混合液離心,吸取上清液加入等體積4 ℃預(yù)冷的異丙醇,顛倒混勻,—20 ℃靜置15 min,再次離心,留置沉淀,加入4 ℃預(yù)冷的75%乙醇混勻,清洗RNA沉淀,再次離心,倒掉液體,乙醇充分揮發(fā)后加入RNase-Free水,充分溶解RNA。在冰上配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,GAPDH上游引物序列5′-GCC AAG GTC ATC CAT GAC AAC-3′,下游引物序列5′-GTG GAT GCA GGG ATG ATG TTC-3′;Nrf2上游引物序列5′-CAA CTG GAT GAA GAG ACC GGA G-3′,下游引物序列5′-TAT GCT GCT TAA ATC AGT CAT GGC-3′;HO-1上游引物序列5′-GTG ACA GAA GAG GCT AAG ACC G-3′,下游引物序列5′-GGC CAA CAC TGC ATT TAC ATG G-3′,合成第一鏈cDNA,并在PCR儀上進(jìn)行RT-PCR。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠血清中LDH、CK的水平

    與SHAM組比較,I/R組及NL組血清中LDH、CK活性水平明顯升高(P<0.05);與I/R組比較,柚皮素組及NL組LDH、CK活性水平明顯降低(P<0.05);與柚皮素組比較,NL組LDH、CK活性水平明顯升高(P<0.05),見表1。

    表1 各組大鼠血清中LDH、CK的水平

    2.2 各組大鼠心肌組織病理結(jié)果

    心肌組織HE染色顯示,SHAM組心肌纖維分布均勻,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清楚,無(wú)炎性細(xì)胞。與SHAM組比較,I/R組心肌纖維排列紊亂,心肌細(xì)胞腫脹、破裂、溶解,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與I/R組比較,柚皮素組心肌纖維排列稍整齊,心肌細(xì)胞破壞明顯減少,炎性細(xì)胞明顯減少。與柚皮素組比較,NL組心肌組織肌纖維排列紊亂較明顯,心肌細(xì)胞破壞增加,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)更明顯,見圖1。

    圖1 各組大鼠心肌組織病理結(jié)果(HE染色,×400)

    2.3 各組大鼠心肌組織凋亡情況

    正常心肌細(xì)胞核染色為藍(lán)色,凋亡細(xì)胞核染色為綠色熒光,與SHAM組比較,I/R組凋亡細(xì)胞明顯增加,凋亡率明顯升高(P<0.05)。與I/R組比較,柚皮素組凋亡細(xì)胞明顯減少,凋亡率明顯降低(P<0.05)。與柚皮素組比較,NL組凋亡細(xì)胞明顯增加,凋亡率明顯升高(P<0.05),見圖2、3。

    圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞TUNEL染色(×400)

    a:P<0.05,與SHAM組比較;b:P<0.05,與I/R組比較;c:P<0.05,與柚皮素組比較。

    2.4 各組大鼠心肌組織SOD活性水平、MDA及ROS水平比較

    與SHAM組比較,I/R組及NL組SOD活性降低,MDA、ROS水平升高(P<0.05)。與I/R組比較,柚皮素組及NL組SOD活性升高,MDA、ROS水平降低(P<0.05)。與柚皮素組比較,NL組SOD活性降低,MDA、ROS水平升高(P<0.05),見表2。

    表2 各組大鼠心肌組織SOD活性水平、MDA及ROS水平比較

    續(xù)表2 各組大鼠心肌組織SOD活性水平、MDA及ROS水平比較

    2.5 各組大鼠心肌組織AKT、p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)水平比較

    各組AKT表達(dá)水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與SHAM組比較,I/R組心肌組織p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1水平升高,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與I/R組比較,柚皮素組及NL組p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1水平明顯升高(P<0.05);與柚皮素組比較,NL組p-AKT、Nrf2、HO-1、NQO1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05),見圖4、5。

    a:P<0.05,與SHAM組比較;b:P<0.05,與I/R組比較;c:P<0.05,與柚皮素組比較。

    a:P<0.05,與SHAM組比較;b:P<0.05,與I/R組比較;c:P<0.05,與柚皮素組比較。

    2.6 各組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1 mRNA水平比較

    與SHAM組比較,I/R組心肌組織Nrf2、HO-1 mRNA水平升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與I/R組比較,柚皮素組及NL組Nrf2、HO-1 mRNA水平明顯升高(P<0.05);與柚皮素組比較,NL組Nrf2、HO-1 mRNA水平明顯降低(P<0.05),見圖6。

    a:P<0.05,與SHAM組比較;b:P<0.05,與I/R組比較;c:P<0.05,與柚皮素組比較。

    3 討 論

    盡管從基礎(chǔ)和臨床進(jìn)行了廣泛研究,心肌I/R損傷的機(jī)制仍然不完全清楚。目前主要有氧化應(yīng)激損傷、鈣離子超載、心肌能量代謝障礙、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞凋亡和線粒體損傷等幾種學(xué)說(shuō)。氧化應(yīng)激損傷作為大部分疾病的主要病理變化過(guò)程,亦在I/R中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)以飲食或藥用植物為基礎(chǔ)的天然化合物在疾病中的應(yīng)用已成為醫(yī)學(xué)研究中的趨勢(shì)。柚皮素作為一種新型天然化合產(chǎn)物,在肝癌[9]、二氧化鈦引起的關(guān)節(jié)炎[10]、預(yù)防脂肪肝[11]、糖尿病心肌病[4]等研究中均表現(xiàn)出明顯抗氧化作用。

    LDH、CK為反映心肌損傷的常見指標(biāo),ROS、MDA為氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)的重要產(chǎn)物,而SOD則為對(duì)抗氧化損傷的活性物質(zhì),本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠心肌I/R模型,檢測(cè)上述指標(biāo),觀察柚皮素對(duì)心肌I/R的抗氧化保護(hù)效應(yīng)。結(jié)果顯示I/R后心肌損傷明顯加重,氧化物質(zhì)水平增加,抗氧化物質(zhì)活性水平降低,而柚皮素預(yù)處理后明顯減輕了上述變化。提示心肌I/R時(shí)存在氧化應(yīng)激損傷,而柚皮素在一定程度上可減輕這種損傷。

    在柚皮素保護(hù)心肌I/R損傷抗氧化分子機(jī)制研究中,YU等[7]發(fā)現(xiàn)柚皮素可通過(guò)環(huán)鳥苷酸/蛋白激酶GIα(cyclic unanosine monophosphate /protein kinase GIα,cGMP/PKGIα)信號(hào)傳導(dǎo)減少氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)應(yīng)激,從而預(yù)防I/R損傷。MENG等[6]發(fā)現(xiàn)柚皮素具有抗I/R損傷的心臟保護(hù)作用,可以通過(guò)激活細(xì)胞和線粒體膜中的三磷酸腺苷敏感鉀通道增強(qiáng)心肌的抗氧化能力來(lái)實(shí)現(xiàn)。但調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的經(jīng)典通路PI3K/AKT尚無(wú)報(bào)道。PI3K/AKT曾在不同組織表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用。而有趣的是,ZHAO等[12]發(fā)現(xiàn)柚皮素在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷中通過(guò)抑制PI3K/AKT通道發(fā)揮氧化還原調(diào)節(jié)作用。ZHANG等[13]研究顯示柚皮素可通過(guò)激活PI3K/AKT通路對(duì)半乳糖誘導(dǎo)的小鼠衰老發(fā)揮抗氧化作用。PI3K/AKT通道在氧化還原穩(wěn)態(tài)中有著獨(dú)特的作用,既可以激活ROS的產(chǎn)生,又能促進(jìn)抗氧化物質(zhì)的釋放[14]。不同組織器官氧化還原平衡點(diǎn)及啟動(dòng)內(nèi)源性抗氧化能力不同,可能導(dǎo)致PI3K/AKT通道在氧化與抗氧化平衡中作用方向不同。

    本研究發(fā)現(xiàn)柚皮素預(yù)處理明顯增強(qiáng)了I/R后AKT的磷酸化,使用PI3K/AKT通道抑制劑LY294002后,心肌組織AKT的磷酸化被明顯抑制,柚皮素介導(dǎo)的心肌組織保護(hù)作用和抗氧化作用也被明顯抑制,說(shuō)明柚皮素可能通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT信號(hào)途徑減輕大鼠心肌氧化應(yīng)激損傷。

    眾所周知,PI3K/AKT下游有多條信號(hào)傳導(dǎo)通路,其中Nrf2/HO-1通路在機(jī)體抗氧化機(jī)制中有至關(guān)重要的作用[15],曾有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)沉默Nrf2、HO-1基因能明顯地抑制ROS的清除、增加細(xì)胞的損傷[16]。YANG等[17]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷Ⅳ通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT途徑上調(diào)Nrf2/HO-1通路抑制缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌損傷。此外,SONG等[18]發(fā)現(xiàn)使用PI3K抑制劑LY294002及AKT抑制劑曲西立濱能明顯降低Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)并發(fā)揮抗氧化和心肌保護(hù)作用。Nrf2是調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子[19]。在生理情況下,Nrf2被kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(recombinant kelch like ECH associated protein 1,Keap1)結(jié)合并定位在細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí),大量ROS產(chǎn)生,使Keap1磷酸化發(fā)生構(gòu)象變化釋放Nrf2,Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控SOD、HO-1、NQO1等抗氧化基因表達(dá)[20]。HO-1是一種重要的抗氧化應(yīng)激和組織保護(hù)酶,可分解血紅素產(chǎn)生具有抗氧化作用的一氧化碳和膽綠素,還可誘導(dǎo)多種抗氧化信號(hào)通路,從而明顯減少細(xì)胞損傷并保護(hù)器官功能[21]。作為一種多功能酶,NQO1可以還原輔酶Q10和α-生育酚,使其發(fā)揮抗氧化作用,還能直接還原超氧化物,在抗氧化機(jī)制中有一定作用[22]。本實(shí)驗(yàn)提示柚皮素預(yù)處理促進(jìn)了Nrf2的表達(dá),從而促進(jìn)下游HO-1、NQO1等抗氧化物質(zhì)表達(dá),而這種作用在使用LY294002后被明顯逆轉(zhuǎn),提示柚皮素可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)途徑而激活下游Nrf2/HO-1/NQO1通路。

    綜上所述,柚皮素在一定程度上減輕了I/R引起的氧化損傷來(lái)發(fā)揮心肌保護(hù)作用,可能與調(diào)控PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。本研究初步探討了柚皮素在大鼠心肌I/R損傷中抗氧化應(yīng)激作用的分子機(jī)制,由于PI3K/AKT通路在調(diào)控凋亡、炎癥中亦有明顯作用,在本實(shí)驗(yàn)中還顯示,在柚皮素作用下,心肌凋亡率明顯下降及病理組織炎癥細(xì)胞明顯減少,但這是否與柚皮素抗炎、抗凋亡有關(guān),仍待進(jìn)一步探討。

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