宏基因組二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)腦脊液在結(jié)核性腦膜炎診斷中的應(yīng)用價(jià)值的Meta分析

陳文 姚利 陳康 戴希勇

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis,TBM)是結(jié)核分枝桿菌感染引起的顱內(nèi)非化膿性炎癥性疾病，是常見(jiàn)的肺外結(jié)核病之一，其發(fā)病數(shù)約占結(jié)核病的1%[1]。雖然TBM發(fā)病率相對(duì)較低，但其是最嚴(yán)重的結(jié)核病，超過(guò)50%的患者最終導(dǎo)致死亡或者遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[2]。研究表明，早期診斷及治療是影響TBM預(yù)后的重要因素[1]。然而，TBM早期表現(xiàn)不典型，易與化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎、真菌性腦膜炎等混淆，目前尚無(wú)理想的早期診斷TBM的輔助檢查，導(dǎo)致發(fā)病的早期診斷困難[3-4]。腦脊液中檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌是其確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法周期長(zhǎng)，陽(yáng)性率低，無(wú)法滿足臨床需求[5]。宏基因組二代測(cè)序技術(shù)(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)是一種新興的檢測(cè)病原體的方法，該技術(shù)已被應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病的診斷[6]，但其在TBM的診斷價(jià)值尚不明確。mNGS技術(shù)應(yīng)用于腦脊液檢測(cè)診斷TBM的研究也逐漸增多，但單個(gè)研究樣本量不大，且報(bào)道的敏感度差異較大，診斷價(jià)值仍存爭(zhēng)議。因此，筆者檢索目前國(guó)內(nèi)外應(yīng)用mNGS檢測(cè)腦脊液診斷TBM的相關(guān)文獻(xiàn)，采用Meta分析方法評(píng)價(jià)mNGS技術(shù)應(yīng)用于腦脊液檢測(cè)在TBM診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

資料和方法

一、 檢索策略

計(jì)算機(jī)檢索PubMed、Embase、Cochrane Library、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索時(shí)間均為建庫(kù)至2021年4月30日，語(yǔ)種為英文或中文。選取國(guó)內(nèi)外發(fā)表的通過(guò)mNGS技術(shù)應(yīng)用于腦脊液檢測(cè)診斷TBM的文獻(xiàn)，并對(duì)納入文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)進(jìn)行擴(kuò)大檢索。英文檢索詞為“metagenomic next-generation sequencing”“mNGS”“next-generation sequencing”“tuberculous meningitis”“tuberculosis meningitis”“tuberculosis”，中文檢索詞為“宏基因組二代測(cè)序”“二代測(cè)序”“結(jié)核”“結(jié)核性腦膜炎”。以PubMed為例，其具體檢索策略為：#1 metagenomic next-generation sequencing，#2 mNGS，#3 next-generation sequencing，#4 tuberculous meningitis，#5 tuberculosis meningitis，#6 tuberculosis，#1OR#2OR#3AND#4OR#5OR#6。

二、文獻(xiàn)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1．納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) 研究類型：采用mNGS技術(shù)應(yīng)用于腦脊液檢測(cè)診斷TBM的研究，且能直接或間接推算出診斷實(shí)驗(yàn)的四格表數(shù)據(jù)，即真陽(yáng)性值(TP)、假陽(yáng)性值(FP)、假陰性值(FN)、真陰性值(TN)。(2)研究對(duì)象為經(jīng)臨床確診的TBM患者，有明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)照組均包含臨床需要與TBM相鑒別的疾病，包括化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎、真菌性腦膜炎等其他腦膜炎患者。(3)TBM例數(shù)>10例。(4)研究對(duì)象年齡不限。(5)英文和中文文獻(xiàn)。

2．排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)各數(shù)據(jù)庫(kù)里重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)。(2)碩士論文、病案報(bào)道、會(huì)議論文及綜述。

三、文獻(xiàn)的篩選和資料提取

由2名研究者先分別獨(dú)立對(duì)初檢文獻(xiàn)和摘要獨(dú)立閱讀，再根據(jù)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)對(duì)檢索出的文獻(xiàn)獨(dú)立進(jìn)行篩選，對(duì)可能納入分析的文章閱讀全文，并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和相關(guān)資料提取。

四、文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)及數(shù)據(jù)提取

由2名研究員根據(jù)診斷準(zhǔn)確性研究質(zhì)量評(píng)價(jià)工具(quality assessment of diagnostic accuracy studies,QUADAS)的14條[7]對(duì)入選文獻(xiàn)獨(dú)立進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，并以“是”“否”“不清楚”3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分別評(píng)價(jià)每個(gè)條目，分別計(jì)1、-1和0分，總分14分。提取資料包括作者、發(fā)表年限、研究對(duì)象、樣本量、診斷標(biāo)準(zhǔn)、四格表數(shù)據(jù)TP、FP、FN、TN等。如遇分歧則通過(guò)討論協(xié)商解決或向?qū)＜易稍兘鉀Q。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用MetaDiSc 1.4軟件進(jìn)行Meta分析,提取各獨(dú)立研究的診斷性實(shí)驗(yàn)四格表數(shù)據(jù)，繪制敏感度與特異度的森林圖，根據(jù)P值和I2值評(píng)估異質(zhì)性；P>0.05,無(wú)異質(zhì)性；P≤0.05,存在異質(zhì)性；I2≤25%為異質(zhì)性較小；25%50% 為高度異質(zhì)性則采用隨機(jī)效應(yīng)模型(random effect model，REM，有異質(zhì)性)，分析計(jì)算納入研究的敏感度、特異度、陽(yáng)性似然比(positive likelihood ratio，PLR)、陰性似然比(negative likehood ratio，NLR)、診斷比值比(diagnostic odd ratio，DOR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)。繪制匯總受試者工作特征(summary receiver operating characteristics，SROC)曲線，并計(jì)算曲線下面積(area under the curve，AUC)。

結(jié) 果

一、文獻(xiàn)檢索結(jié)果

檢索到文獻(xiàn)628篇，剔除重復(fù)文獻(xiàn)后得到初始文獻(xiàn)181篇，瀏覽文題及摘要后排除不相關(guān)、綜述類和病例報(bào)告文獻(xiàn)169篇，納入12篇文獻(xiàn)；通過(guò)進(jìn)一步閱讀全文，排除無(wú)法提取四格表數(shù)據(jù)及重復(fù)利用發(fā)表的文獻(xiàn)5篇，最終7篇[8-14]符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)進(jìn)入Meta分析。

二、納入研究的基本特征與質(zhì)量評(píng)價(jià)

7篇文獻(xiàn)均為英文文獻(xiàn)；研究組231例，對(duì)照組246例；研究中均包含了易混淆的病例并給出了詳細(xì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，納入研究的病例均經(jīng)過(guò)病原學(xué)或臨床抗結(jié)核治療有效確診為TBM。納入文獻(xiàn)的QUADAS評(píng)分均≥10分，表明納入研究質(zhì)量較高。納入研究的基本臨床特征與QUADAS評(píng)分參見(jiàn)表1。

表1 納入7篇文獻(xiàn)的相關(guān)信息

三、mNGS技術(shù)應(yīng)用于腦脊液檢測(cè)對(duì)TBM的診斷價(jià)值

1.異質(zhì)性檢驗(yàn)：Spearman相關(guān)系數(shù)=0.645，P=0.117，表明不存在閾值效應(yīng)。異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，各研究結(jié)果間的敏感度(χ2=52.96，P=0.000，I2=88.7%)、特異度(χ2=2.83，P=0.830，I2=0.0%)、PLR(Cochran-Q=0.89，P=0.990，I2=0.0%)、NLR(Cochran-Q=35.51，P=0.000，I2=83.1%)、DOR(Cochran-Q=3.10，P=0.796，I2=0.0%)，敏感度、NLR異質(zhì)性較大采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析，特異度、PLR、DOR異質(zhì)性較小采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行合并。

2.診斷價(jià)值參數(shù)匯總分析：Meta分析結(jié)果顯示，mNGS技術(shù)應(yīng)用于腦脊液檢測(cè)診斷TBM的敏感度和特異度分別為62.0%(95%CI: 55.0%～68.0%)和97.0%(95%CI: 94.0%～99.0%)(圖1，2)；匯總PLR和匯總NLR分別為10.57(95%CI:4.84～23.11)和0.41(95%CI:0.27～0.60)；匯總DOR為21.39(95%CI:10.18～44.95)(圖3～5)。

圖1 mNGS檢測(cè)腦脊液診斷TBM的敏感度

圖2 mNGS檢測(cè)腦脊液測(cè)診斷TBM的特異度

圖3 mNGS檢測(cè)腦脊液診斷TBM的匯總陽(yáng)性似然比(PLR)

圖4 mNGS檢測(cè)腦脊液診斷TBM的匯總陰性似然比(NLR)

圖5 mNGS檢測(cè)腦脊液診斷TBM的診斷OR值

3. SROC分析：繪制mNGS技術(shù)應(yīng)用于腦脊液檢測(cè)對(duì)TBM診斷價(jià)值的SROC，結(jié)果顯示AUC為0.956，Q*指數(shù)為0.898(圖6)。

注 AUC：曲線下面積；Q*：統(tǒng)計(jì)量指數(shù)圖6 mNGS檢測(cè)腦脊液診斷TBM的匯總受試者工作特征(SROC)曲線

4.亞組分析：不同研究類型的亞組分析見(jiàn)表2。分為前瞻性研究組(3個(gè)研究)和回顧性研究組(4個(gè)研究)。Meta分析結(jié)果顯示，前瞻性研究組的匯總敏感度、匯總特異度和匯總DOR分別為41.0%(31.0%～52.0%)、97.0%(93.0%～99.0%)、16.54(7.03～38.92)，AUC為0.998，回顧性研究組的匯總敏感度、匯總特異度和匯總DOR分別為76.0%(68.0%～83.0%)、100.0%(88.0%～100.0%)、35.52(7.70～163.85)，AUC為0.945。

表2 不同研究類型mNGS檢測(cè)腦脊液診斷TBM的亞組分析

討 論

TBM是結(jié)核分枝桿菌侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)導(dǎo)致的一種結(jié)核病，是肺外結(jié)核病中最嚴(yán)重的類型，致死率、致殘率高，早期診斷與治療是提高治療效果、改善預(yù)后的關(guān)鍵。然而，由于TBM臨床表現(xiàn)多不典型，腦脊液里細(xì)菌負(fù)荷量低以及病理性診斷難以獲得，使得TBM早期診斷困難。腦脊液抗酸染色涂片或分枝桿菌培養(yǎng)是診斷TBM的金標(biāo)準(zhǔn)，而腦脊液抗酸染色涂片陽(yáng)性率低，腦脊液分枝桿菌培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)，通常需要2周以上，且陽(yáng)性率僅為20%～30%[15]，對(duì)早期診斷TBM意義不大。另外，TBM易與病毒性腦膜炎、真菌性腦膜炎等混淆，其病原學(xué)診斷困難。因此，快速、準(zhǔn)確的病原學(xué)診斷方法對(duì)于TBM的早期確診，降低其致死率、致殘率尤為重要。

近年來(lái)，出現(xiàn)了多種診斷結(jié)核病的新技術(shù)，分子診斷技術(shù)是重要的突破，其代表為GeneXpert MTB/RIF技術(shù)，是一種快速、有效的診斷技術(shù)，且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肺外結(jié)核的診斷。但是，其診斷TBM的敏感度并不高，且該方法只能檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA，無(wú)法檢測(cè)其他病原體從而間接鑒別診斷TBM[16]。mNGS是一種新興的高通量測(cè)序方法，可以快速對(duì)DNA或者RNA樣本的堿基進(jìn)行測(cè)序，不但能檢測(cè)已知病原體，而且能檢測(cè)未知病原體，目前報(bào)道已被用于細(xì)菌、真菌、病毒等多種感染性疾病的診斷[17-19]。最近的一項(xiàng)大樣本回顧性研究對(duì)比了mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)診斷感染性疾病的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示其敏感度、特異度均高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)檢測(cè)，尤其對(duì)于結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)[20]。目前，mNGS檢測(cè)腦脊液診斷TBM的研究較少，其診斷價(jià)值尚不明確。為了更加精確、早期診斷TBM，快速得出結(jié)果，本研究納入7項(xiàng)研究，通過(guò)合并診斷比值比、擬合ROC曲線來(lái)評(píng)價(jià)mNGS檢測(cè)腦脊液診斷TBM的診斷效能。Meta分析結(jié)果顯示mNGS檢測(cè)腦脊液診斷TBM的敏感度為62.0%(95%CI: 55.0%～68.0%)，特異度為97.0%(95%CI:94.0%～99.0%)，診斷比值比為21.39(95%CI:10.18～44.95)，將7項(xiàng)研究的敏感度和特異度擬合SROC曲線，得到實(shí)驗(yàn)總體效能指標(biāo)AUC=0.956、Q*指數(shù)為0.898，其敏感度高于研究報(bào)道的GeneXpert MTB/RIF Ultra及GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)腦脊液診斷TBM的敏感度(25.5%～47.2%)[16,21]，證實(shí)了mNGS應(yīng)用于腦脊液檢測(cè)對(duì)TBM具有較高的診斷價(jià)值，可作為快速診斷TBM的有效方法。但mNGS目前也存在不可避免的缺點(diǎn)，首先，mNGS檢測(cè)費(fèi)用相對(duì)較高，導(dǎo)致其使用受限。其次，mNGS尚不能檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌是否耐藥。再次，mNGS對(duì)RNA類型的病原體檢測(cè)方法尚未完全攻破，還需進(jìn)一步探索。

本研究尚存以下幾點(diǎn)不足。首先，目前有關(guān)mNGS檢測(cè)腦脊液診斷TBM的研究較少，總共僅納入7篇相關(guān)文獻(xiàn)，且大部分研究病例非連續(xù)納入，標(biāo)本的處理方法也不完全相同，可能造成偏倚；其次，前瞻性研究較少，根據(jù)研究類型不同進(jìn)行亞組分析結(jié)果顯示，前瞻性研究與回顧性研究匯總敏感度存在差異，可能是本研究差異性的來(lái)源之一。另外，有的回顧性文獻(xiàn)納入病例行mNGS檢查前已經(jīng)抗結(jié)核治療，有的文獻(xiàn)對(duì)是否抗結(jié)核治療交代不詳。檢測(cè)前抗結(jié)核治療可能影響其敏感度，導(dǎo)致納入文獻(xiàn)的異質(zhì)性大。最后，本文只納入了中文、英文文獻(xiàn)，可能造成語(yǔ)言偏倚。今后尚需更多前瞻性、大樣本、高質(zhì)量的臨床對(duì)照研究，更加科學(xué)、客觀地評(píng)價(jià)mNGS應(yīng)用于腦脊液檢測(cè)對(duì)TBM的診斷價(jià)值。