陰虛質(zhì)骨質(zhì)疏松癥患者血清中差異蛋白篩選研究

黃睿，謝興文，李鼎鵬，徐世紅，林德民，鐘建春

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000；4.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)老年人健康的主要疾病[1]。我國(guó)OP 總患病率約為13%，推測(cè)至2050 年患病人數(shù)可能上升至5.33 億[2]。骨質(zhì)疏松性骨折是OP 嚴(yán)重并發(fā)癥，尤其是髖部骨折，其病死率高，患者多在骨折后1 年內(nèi)死亡[3]。中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說(shuō)源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，主要表現(xiàn)在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理機(jī)能及心理狀態(tài)等方面。個(gè)體存在體質(zhì)差異，影響一些特定疾病罹患率[4]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注中醫(yī)體質(zhì)與OP 相關(guān)性。有研究對(duì)廣州某醫(yī)院OP患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)陰虛質(zhì)患者最多（28.7%）[5]。陰虛質(zhì)發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)較高[6]，對(duì)該體質(zhì)進(jìn)行研究具有較高臨床價(jià)值。

蛋白質(zhì)組學(xué)是研究蛋白質(zhì)位置、功能、生物學(xué)過(guò)程及其相互作用的一門(mén)科學(xué)，在功能水平上研究基因表達(dá)[7]，是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要工具，用于尋找疾病生物學(xué)標(biāo)志物，探究疾病發(fā)生機(jī)制。差異蛋白質(zhì)組學(xué)TMT 技術(shù)屬于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽技術(shù)的一種，較凝膠定量技術(shù)可以檢測(cè)更多類型的蛋白質(zhì)分子[8]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥研究領(lǐng)域。本研究采用TMT 技術(shù)篩選陰虛質(zhì)OP 患者血清中的差異蛋白，旨在篩選陰虛質(zhì)OP 潛在的血清生物蛋白標(biāo)志物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

受試者來(lái)自蘭州市五泉、西固福二路2 個(gè)社區(qū)，共3 000 人。于2019 年12 月對(duì)受試者進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，檢測(cè)骨密度并采集血清。將受試者血清貯存于甘肅省中醫(yī)院生物樣本庫(kù)-80 ℃冰箱內(nèi)，按腰椎（L2～L4）骨密度水平分為OP 患者和非OP 者。通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查收集基本資料并判定中醫(yī)體質(zhì)。OP 患者961 例，其中陰虛質(zhì)52 例（男性11 例、女性41 例）。采用隨機(jī)數(shù)字表法從陰虛質(zhì)OP 患者中選取32 例為陰虛質(zhì)OP組，包括男性7 例、女性25 例，年齡52～80 歲，平均年齡（66.10±7.60）歲。經(jīng)匹配年齡、性別后，選擇平和質(zhì)OP 組32 例，包括男性7 例、女性25 例，年齡52～81 歲，平均年齡（65.59±7.49）歲；平和質(zhì)非OP 組32 例，包括男性7 例、女性25 例，年齡46～75 歲，平均（61.00±8.00）歲。3 組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)甘肅省中醫(yī)院倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（2018-027-01）。

1.2 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

參照《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南（2017）》[9]，以雙能X 線吸收法（DXA）測(cè)量腰椎骨密度（L2～L4）。正常值：T 值≥-1；骨量減少：-2.5＜T 值＜-1；骨質(zhì)疏松：T 值≤-2.5。

1.3 中醫(yī)體質(zhì)判定

按照《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》量表[10]，每個(gè)問(wèn)題按1～5 分劃分為5 級(jí)評(píng)分，計(jì)算原始分和轉(zhuǎn)化分，判定體質(zhì)類型。平和質(zhì)轉(zhuǎn)化分≥60 分且其他偏頗體質(zhì)轉(zhuǎn)化分均＜30 分時(shí)判定為平和質(zhì)，陰虛質(zhì)轉(zhuǎn)化分≥40分且余體質(zhì)轉(zhuǎn)化分＜30 分時(shí)判定為單一陰虛質(zhì)。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)

①女性年齡≥45 歲，男性年齡≥50 歲；②陰虛質(zhì)OP 組：臨床診斷為原發(fā)性O(shè)P 且判定為單一陰虛質(zhì)；③平和質(zhì)OP 組：臨床診斷為原發(fā)性O(shè)P 且判定為平和質(zhì)；④平和質(zhì)非OP 組：臨床未診斷OP，判定為平和質(zhì)的健康受試者；⑤所有受試者均對(duì)本研究知情，并簽署知情同意書(shū)。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)

①因內(nèi)分泌代謝疾病、腫瘤、肝腎疾病、風(fēng)濕免疫性疾病等導(dǎo)致的繼發(fā)性O(shè)P；②伴重癥心腦血管疾病及神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病；③伴惡性骨腫瘤、骨結(jié)核、骨髓炎等其他骨科疾?。虎芩闹凹怪袃?nèi)固定或心臟安裝起搏器；⑤近2 年接受過(guò)抗骨質(zhì)疏松治療，使用過(guò)影響骨代謝的藥物及接受過(guò)雌激素治療；⑥不配合研究，資料不全。

1.6 血清樣本處理

血清樣本解凍，4 ℃、2 500 r/min 離心10 min，取上清液分裝于Eppendorf 管，每組8 例做一混樣，陰虛質(zhì)OP 組、平和質(zhì)OP 組、平和質(zhì)非OP 組各4 個(gè)樣本。

1.7 蛋白質(zhì)提取

取凍存血清，各組每個(gè)樣本血清取10 μL，分別混合均勻，運(yùn)用SDT 裂解法，在待測(cè)血清樣本中加入適量4%SDT 裂解液，沸水中水浴15 min。使用-20 ℃低溫高速離心機(jī)14 000 r/min 離心15 min 取上清液。分裝樣品，-20 ℃保存。鑒定每個(gè)樣本中蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳并定量各蛋白的濃度及總量。

1.8 輔助濾劑樣品制備裂解

樣品取150 μg 蛋白質(zhì)溶液，分別加入DTT 至終濃度為100 mmol/L，于沸水浴后冷卻至室溫。加入200 μL UA buffer 混勻并離心，棄濾液，重復(fù)該步驟1次。加入100 μL IAA buffer，振蕩避光反應(yīng)后離心。加入100 μL UA buffer 再次離心，重復(fù)2 次。加入NH4HCO3溶液離心，重復(fù)2 次。加入40 μL Trypsin buffer，振蕩后37 ℃放置16～18 h。換新收集管，離心15 min；再加入NH4HCO3溶液，離心15 min，收集濾液。采用C18Cartridge 對(duì)肽段進(jìn)行脫鹽，肽段凍干后加入甲酸溶液復(fù)溶，肽段定量（OD280）。

1.9 TMT 標(biāo)記

用三乙基碳酸氫銨復(fù)溶樣品，將TMT 試劑分別注入各樣品中，常溫放置1 h，分別注入5%氨水終止反應(yīng)，室溫靜置10 min。在樣品中加入10%三氟乙酸，pH值保持2.0 以下，可使樣品與柱結(jié)合更充分。經(jīng)脫鹽、洗脫后，將0.1%甲酸溶液加入凍干后肽段中，備用。

1.10 質(zhì)譜分析及鑒定

每份樣品采用納升流速Easy nLC 系統(tǒng)進(jìn)行分離。緩沖液A 液為0.1%甲酸水溶液，B 液為0.1%甲酸乙腈水溶液。色譜柱以100%A 液平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到分析柱分離。樣品經(jīng)色譜分離后用Q Exactive plus 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長(zhǎng)120 min，檢測(cè)方式為正離子，母離子掃描范圍350～1 800 m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率為70 000，AGC target 為3×106，一級(jí)Maximum IT 為50 ms。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按以下流程采集：每次全掃描后采集10 個(gè)碎片圖譜（MS2 scan），MS2 Activation Type 為HCD，Isolation window 為1.6 m/z，二級(jí)質(zhì)譜分辨率為35 000，Microscans 為1，二級(jí)Maximum IT 為120 ms，Normalized Collision Energy 為30 eV。

1.11 分析方法

1.11.1 蛋白質(zhì)定量分析

采用高分辨質(zhì)譜儀 Q Exactive plus（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行TMT 定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。Q Exactive plus 是Orbitrap 類型質(zhì)譜儀，使用快速HCD模式（higher energy collisional dissociation）獲得MS2圖譜，使用Proteome Discoverer 2.1（Thermo Fisher Scientific）[11]將Q Exactive plus 產(chǎn)生的原始圖譜文件進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過(guò)軟件內(nèi)置工具提交至MASCOT2.6 服務(wù)器進(jìn)行檢索。再通過(guò)Proteome Discoverer 2.1 將MASCOT 服務(wù)器上形成的查庫(kù)文件傳回軟件，根據(jù)FDR＜0.01 標(biāo)準(zhǔn)篩選數(shù)據(jù)。

1.11.2 主成分分析

主成分分析（PCA）用于觀察各組樣本的自然聚集、離散及離群點(diǎn)，提取篩選到的各組樣本差異蛋白對(duì)應(yīng)的表達(dá)值，采用Excel2016 整合數(shù)據(jù)，并運(yùn)用R4.0.2 軟件將數(shù)據(jù)投射至二維空間，每個(gè)樣本用二維空間的一個(gè)點(diǎn)表示，相同組分樣本形成的點(diǎn)彼此靠近。

1.11.3 生物信息學(xué)分析

采用上述方法篩選出的蛋白，比較陰虛質(zhì)OP 組、平和質(zhì)OP 組和平和質(zhì)非OP 組表達(dá)水平。當(dāng)差異表達(dá)差異倍數(shù)＞1.2（上調(diào)）或＜0.83（下調(diào)），且P＜0.05，則視為差異表達(dá)的蛋白。將篩選到的陰虛質(zhì)OP組與平和質(zhì)非OP 組的差異蛋白與陰虛質(zhì)OP 組與平和質(zhì)OP 組、平和質(zhì)OP 組與平和質(zhì)非OP 組所鑒定的蛋白進(jìn)行對(duì)比，判斷其是否為陰虛質(zhì)及OP 共同作用下的特異性差異蛋白。對(duì)陰虛質(zhì)OP 組與平和質(zhì)非OP 組的特異性差異蛋白，通過(guò)UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)和Blast2GO[12]和InterProScan[13]進(jìn)行基因功能注釋。對(duì)其生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能進(jìn)行分析，利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行通路注釋。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)定量和鑒定結(jié)果

經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，陰虛質(zhì)OP 組、平和質(zhì)非OP 組和平和質(zhì)OP 組樣本抽提效率高，樣本中蛋白質(zhì)含量豐富，各組樣本蛋白質(zhì)定量結(jié)果見(jiàn)表1。蛋白質(zhì)相對(duì)分子量主要分布在10～90 kD（見(jiàn)圖1），蛋白質(zhì)主要等電分布點(diǎn)在5～10（見(jiàn)圖2）；肽段序列長(zhǎng)度分布見(jiàn)圖3；肽段序列覆蓋度顯示，鑒定到的蛋白質(zhì)覆蓋率比例較高（見(jiàn)圖4）；蛋白質(zhì)豐度比分布顯示，3 組樣品定量結(jié)果中大部分蛋白質(zhì)豐度比值接近1（見(jiàn)圖5）。

圖1 鑒定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量分布

圖2 鑒定蛋白質(zhì)等電分布點(diǎn)

圖3 肽段序列長(zhǎng)度分布

圖4 蛋白質(zhì)序列覆蓋度分布

圖5 蛋白質(zhì)豐度比分布

表1 各組樣本蛋白質(zhì)定量結(jié)果

2.2 血清差異表達(dá)蛋白篩選結(jié)果

根據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果，陰虛質(zhì)OP 組與平和質(zhì)非OP組共鑒定了734 種蛋白，其中差異表達(dá)蛋白5 種。陰虛質(zhì)OP 組較平和質(zhì)非OP 組上調(diào)蛋白5 種，包括RAB7A、PON1 及3 種炎癥免疫反應(yīng)相關(guān)蛋白，無(wú)蛋白顯著下調(diào)（見(jiàn)表2）。

表2 陰虛質(zhì)OP 組與平和質(zhì)非OP 組差異蛋白

將5 種差異蛋白與陰虛質(zhì)OP 組與平和質(zhì)OP 組、平和質(zhì)OP 組與平和質(zhì)非OP 組鑒定到的蛋白進(jìn)行對(duì)比。陰虛質(zhì)OP 組與平和質(zhì)OP 組鑒定到其中的4 種（IGLV3-21、IGHV-α-2、RAB7A、PON1），4 種蛋白陰虛質(zhì)OP 組與平和質(zhì)OP 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），蛋白IGHV1-69-2 在陰虛質(zhì)OP 組與平和質(zhì)OP 組比較中未被鑒定及定量（見(jiàn)表3）。

表3 陰虛質(zhì)OP 組與平和質(zhì)OP 組差異蛋白表達(dá)比較

平和質(zhì)OP 與平和質(zhì)非OP 組鑒定出5 種差異蛋白中的4 種（IGLV3-21、IGHV-α-2、RAB7A、PON1），4 種蛋白平和質(zhì)OP 組與非OP 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），蛋白IGHV1-69-2 在平和質(zhì)OP 組與非OP 組的比較中未被鑒定及定量（見(jiàn)表4）。

表4 平和質(zhì)OP 組與非OP 組差異蛋白表達(dá)比較

2.3 主成分分析結(jié)果

PCA 結(jié)果顯示，平面圖上陰虛質(zhì)OP 組主成分與平和質(zhì)非OP 組、平和質(zhì)OP 組聚類的區(qū)域區(qū)分度明顯（見(jiàn)圖6）。

圖6 差異蛋白各組樣本PCA 圖

2.4 陰虛質(zhì)骨質(zhì)疏松癥患者差異蛋白功能及通路注釋分析

對(duì)鑒定和定量到的陰虛質(zhì)OP 組的5 種差異蛋白行功能注釋和富集分析：按細(xì)胞組分歸為11 類，這些蛋白都是細(xì)胞成分和蛋白質(zhì)復(fù)合體，4 個(gè)蛋白胞外區(qū)組分，各有2 個(gè)是細(xì)胞膜成分和細(xì)胞器成分，1 個(gè)是突觸成分，1 個(gè)是超分子化合物，5 個(gè)蛋白都分布于細(xì)胞膜、胞外區(qū)，3 個(gè)分布于細(xì)胞器，1 個(gè)位于細(xì)胞連接；按分子功能劃分，5 個(gè)蛋白都有結(jié)合功能及催化功能；生物過(guò)程方面，存在差異的5 個(gè)蛋白都參與了代謝過(guò)程、免疫過(guò)程、生物調(diào)節(jié)過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)，4 個(gè)蛋白參與細(xì)胞定位，3 個(gè)蛋白參與多組織生物過(guò)程，2 個(gè)蛋白參與了多細(xì)胞生物過(guò)程和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的組成和發(fā)生過(guò)程，各有1 個(gè)蛋白參與轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和解毒過(guò)程（見(jiàn)圖7）。

圖7 陰虛質(zhì)OP 組差異蛋白GO 富集分析

對(duì)主要富集的蛋白功能進(jìn)行逐一分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞組分主要富集在自噬體膜、溶酶體膜外成分、黑素體膜、反轉(zhuǎn)錄復(fù)合物、IgA 免疫球蛋白復(fù)合物，分子功能主要富集在抗原結(jié)合、催化芳二烷基磷酸酶、催化二氫香豆素水解酶、依賴GTP 的蛋白結(jié)合、芳基酯酶的催化，參與的生物過(guò)程主要富集在Fc-epsilon receptor信號(hào)通路、蛋白質(zhì)靶向溶酶體、表皮生長(zhǎng)因子分解代謝、內(nèi)體向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)、初級(jí)內(nèi)體向次級(jí)內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程（見(jiàn)圖8）。對(duì)鑒定到的差異蛋白進(jìn)行KEGG 通路注釋分析，發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要富集于自噬通路及動(dòng)物線粒體自噬信號(hào)通路。主要富集的自噬通路注釋見(jiàn)圖9。

圖8 陰虛質(zhì)OP 組差異表達(dá)蛋白GO 富集分析（前10 位）

圖9 陰虛質(zhì)OP 組差異表達(dá)蛋白主要富集的自噬通路注釋

3 討論

中醫(yī)體質(zhì)學(xué)說(shuō)重視個(gè)體差異，體質(zhì)影響疾病發(fā)生與預(yù)后[14-15]。近年來(lái)隨著蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，越來(lái)越多的研究開(kāi)始從微觀角度探究中醫(yī)病證本質(zhì)。針對(duì)陰虛質(zhì)OP 患者血清中差異蛋白的研究，可以探索陰虛質(zhì)OP 的發(fā)病機(jī)制，有助于開(kāi)發(fā)早期診斷試劑盒，并為陰虛質(zhì)OP 靶向藥物開(kāi)發(fā)提供靶點(diǎn)。本研究篩選出的差異蛋白有3 個(gè)屬于免疫球蛋白范疇，即IGHV1-69-2、IGLV3-21、IGHV-α-2。其中，IGHV1-69-2 和IGHV-α-2 屬于重鏈免疫球蛋白，由免疫球蛋白重鏈位點(diǎn)（IGH）編碼可變基因并經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、加工和翻譯而形成[16]，IGLV3-21 屬輕鏈免疫球蛋白，由B 淋巴細(xì)胞分化而來(lái)的漿細(xì)胞產(chǎn)生[17]。這些蛋白參與炎癥反應(yīng)、疾病急性期反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)[18]。董偉[19]研究發(fā)現(xiàn)，陰虛質(zhì)人群血清中白細(xì)胞介素（IL）-2、干擾素-γ 的表達(dá)水平較平和質(zhì)人群升高，提示陰虛質(zhì)人群存在免疫功能減弱情況，免疫功能下降使陰虛質(zhì)較平和質(zhì)人群更易發(fā)生感染，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。孫淑嫻[20]研究發(fā)現(xiàn)，陰虛質(zhì)人群免疫炎癥相關(guān)蛋白存在差異表達(dá)，表明陰虛人群免疫功能存在紊亂。研究顯示，骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)存在相互作用，因?yàn)楣趋老到y(tǒng)和免疫系統(tǒng)有共同起源，破骨細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均由造血干細(xì)胞分化而來(lái)[21]。2 個(gè)系統(tǒng)存在共同的細(xì)胞因子、受體和轉(zhuǎn)錄因子，免疫細(xì)胞接受傳導(dǎo)信息能對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。當(dāng)免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂時(shí)，骨重建受到影響，引發(fā)OP[22]。如活化的T 細(xì)胞能分泌Th17 細(xì)胞提高IL-17 水平，在骨破壞進(jìn)程中，IL-17 可通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1、腫瘤壞死因子合成更多的促炎性介質(zhì)，加速骨破壞[23]。本研究顯示，陰虛質(zhì)OP 組血清中存在3 個(gè)免疫球蛋白上調(diào)，提示陰虛質(zhì)OP 患者可能存在免疫功能紊亂，其發(fā)生OP 的原因可能是免疫系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致骨流失增加。

RAB 蛋白屬GTP 酶家族，主要參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。RAB7 是RAB 家族中的一種小G 蛋白，哺乳動(dòng)物有RAB7A 和RAB7B 亞型，二者在膜轉(zhuǎn)運(yùn)不同階段起作用。RAB7A 含有208 個(gè)氨基酸，主要位于晚期核內(nèi)體，調(diào)節(jié)早期核內(nèi)體向晚期核內(nèi)體及晚期內(nèi)體向溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)[24]。RAB7A 的功能與自噬密切相關(guān)。有研究認(rèn)為，自噬活動(dòng)亢進(jìn)是陰虛特征之一[25]。自噬水平平衡與中醫(yī)陰陽(yáng)自和及陰陽(yáng)平衡思想具有相似性。陰陽(yáng)自和指陰陽(yáng)具有自我調(diào)整平衡的能力，生理狀態(tài)下陰陽(yáng)二氣自我協(xié)調(diào)，病理狀態(tài)下二者自我平衡，形成動(dòng)態(tài)平衡。細(xì)胞自噬亦屬于微環(huán)境中的動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)外界環(huán)境變化時(shí)，細(xì)胞通過(guò)自噬對(duì)其作出反應(yīng)[26]。中醫(yī)理論中的陰陽(yáng)依據(jù)事物特性進(jìn)行劃分，自噬過(guò)程中清除的細(xì)胞內(nèi)廢舊代謝物質(zhì)屬陰，新合成的物質(zhì)及能力屬陽(yáng)[25]，當(dāng)陰陽(yáng)偏衰時(shí)，內(nèi)外界因素變化和刺激可能使陰陽(yáng)平衡被打破，隨之導(dǎo)致自噬紊亂。過(guò)度自噬使陰虛質(zhì)人群在代謝過(guò)程中清除細(xì)胞的功能亢進(jìn)，存在分解骨代謝產(chǎn)物過(guò)快情況，成骨細(xì)胞-破骨細(xì)胞平衡被打破，導(dǎo)致骨流失增加[27-28]。自噬在OP 發(fā)病過(guò)程中被認(rèn)為是骨細(xì)胞存活的重要機(jī)制之一。骨丟失進(jìn)程也可能與骨細(xì)胞自噬有關(guān)[29]。成骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)依靠自噬活動(dòng)來(lái)維持，還能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性，保持骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞性狀[30-31]。結(jié)合本研究中陰虛質(zhì)OP 患者血清中RAB7A 表達(dá)顯著高于平和質(zhì)非OP 者，且陰虛質(zhì)OP 組與平和質(zhì)OP 組、平和質(zhì)OP 組和平和質(zhì)非OP 組間RAB7A 的表達(dá)水平無(wú)顯著差異，推測(cè)RAB7A可能是陰虛質(zhì)OP 特異性的血清蛋白生物標(biāo)志物。

對(duì)氧磷酶（PON）是一種由肝臟合成的水解酶，PON1 是其3 種亞型之一，具有強(qiáng)烈親酯性的高密度脂蛋白相關(guān)酯酶。PON1 的表達(dá)和活性主要受基因遺傳多態(tài)性影響，與氧化應(yīng)激相關(guān)多種疾病有關(guān)，包括冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病、糖尿病、腫瘤及黃斑變性等[32]。氧化應(yīng)激主要表現(xiàn)為人體內(nèi)氧化和抗氧化平衡被打破，該過(guò)程會(huì)產(chǎn)生大量氧自由基，導(dǎo)致?lián)p傷部位中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生慢性炎癥效應(yīng)[33]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，陰虛大鼠模型由于細(xì)胞免疫功能及抗感染功能被抑制而產(chǎn)生炎癥效應(yīng)[34]，臨床研究亦顯示陰虛患者體內(nèi)炎癥因子水平上升[35]，同樣表現(xiàn)為炎癥效應(yīng)，我們推測(cè)陰虛質(zhì)的產(chǎn)生可能與氧化應(yīng)激的致炎作用有關(guān)。氧化應(yīng)激對(duì)破骨細(xì)胞的分化及激活有促進(jìn)作用，提高骨吸收能力[36]，是OP 潛在的危險(xiǎn)因素。PON1 與骨代謝及OP 相關(guān)，其作用機(jī)制是PON1 的抗氧化能力可保護(hù)骨骼免受氧化應(yīng)激反應(yīng)。人體在新陳代謝過(guò)程中會(huì)持續(xù)產(chǎn)生自由基，如果抗氧化和氧化作用失去平衡，活性氧不能及時(shí)清除而發(fā)生累積。累積的活性氧損傷了成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨形成減少，骨破壞增加，從而引發(fā)OP[37]。本研究顯示，PON1 表達(dá)水平在陰虛質(zhì)OP 患者血清呈現(xiàn)高表達(dá)，陰虛質(zhì)與平和質(zhì)及OP 與非OP 間的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其可能是陰虛質(zhì)OP 患者血清中特有的差異蛋白。

本研究尚存在一定局限性：如篩選出陰虛質(zhì)OP 患者血清中的差異顯著的蛋白5 個(gè)，其中3 個(gè)是功能未知蛋白，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展，其功能會(huì)逐漸被認(rèn)知。生物信息學(xué)分析結(jié)果仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)闡明其具體機(jī)制。今后我們將對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行多中心、大樣本驗(yàn)證，以確定其是否為陰虛質(zhì)OP 可靠的血清蛋白生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，本研究通過(guò)TMT 技術(shù)篩選了陰虛質(zhì)OP 患者血清中的差異蛋白，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)蛋白表達(dá)存在顯著差異。其中RAB7A 與自噬密切相關(guān)，PON1 與氧化應(yīng)激反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)。體現(xiàn)出陰虛質(zhì)OP 的發(fā)生發(fā)展可能與自噬和氧化應(yīng)激反應(yīng)存在重要聯(lián)系，它們可能是陰虛質(zhì)OP 潛在的血清生物學(xué)標(biāo)志物。本研究結(jié)果可為OP 微觀診斷及藥物精準(zhǔn)干預(yù)提供新方法，也為陰虛質(zhì)OP 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制探索提供思路。