芪仙通絡(luò)方及其拆方對(duì)腦梗死大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)發(fā)生及p38MAPK活化的影響

周勝?gòu)?qiáng)，李博，王琦，周春吉，劉芳，鄧奕輝

1.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410006；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；4.南華大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 衡陽(yáng) 421001

腦梗死又稱(chēng)缺血性卒中、中風(fēng)，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率及高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康的重大疾病之一[1]。對(duì)腦梗死后遺留的肢體癱瘓、麻木、失語(yǔ)等神經(jīng)功能缺損后遺癥，西醫(yī)目前仍然缺乏安全、有效的治療措施[2]。長(zhǎng)期臨床實(shí)踐和觀察表明，中醫(yī)治療可顯著改善腦梗死后遺癥，降低其致殘率，提高患者生活質(zhì)量，有望為腦梗死治療開(kāi)辟新途徑[3]。

芪仙通絡(luò)方系國(guó)醫(yī)大師劉祖貽教授基于其創(chuàng)新理論“氣陽(yáng)主用”研制而成的中風(fēng)效驗(yàn)方，在補(bǔ)腎活血基礎(chǔ)上加以益氣溫陽(yáng)，經(jīng)多年臨床實(shí)踐證實(shí)，針對(duì)中風(fēng)后神經(jīng)功能缺損，其療效顯著優(yōu)于單純補(bǔ)腎活血法。課題組前期通過(guò)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，芪仙通絡(luò)方能促進(jìn)腦梗死患者恢復(fù)及后遺癥期腎虛血瘀證患者神經(jīng)功能，提高其日?；顒?dòng)能力，且未見(jiàn)任何不良反應(yīng)發(fā)生[4]。實(shí)驗(yàn)研究亦表明，本方能顯著促進(jìn)腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，上調(diào)缺血腦區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）表達(dá)，抑制膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，促進(jìn)海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞再生，但未對(duì)室管膜下區(qū)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生水平及分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討[5]。因此，本研究旨在通過(guò)拆方研究，比較芪仙通絡(luò)方及其拆方對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能、缺血側(cè)室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移與神經(jīng)元定向分化及p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）活化的影響，探討芪仙通絡(luò)方補(bǔ)腎活血、益氣溫陽(yáng)組方配伍的臨床意義及促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的可能作用機(jī)理，從而佐證“氣陽(yáng)主用”創(chuàng)新理論的臨床指導(dǎo)價(jià)值，以期為腦梗死后遺癥的防治提供新的思路與方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠80 只，體質(zhì)量（240±30）g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南省中醫(yī)藥研究院SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度（24±0.5）℃，濕度50%，晝夜光照節(jié)律，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 藥物及制備

芪仙通絡(luò)方（黃芪30 g，淫羊藿15 g，丹參30 g，枸杞子30 g，制何首烏15 g，葛根30 g，水蛭9 g，山楂15 g）、補(bǔ)腎活血拆方（枸杞子30 g，制何首烏15 g，丹參30 g，葛根30 g，水蛭9 g，山楂15 g）、益氣溫陽(yáng)拆方（黃芪30 g，淫羊藿15 g），飲片購(gòu)自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，經(jīng)藥劑科田其學(xué)主任藥師鑒定，符合2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。芪仙通絡(luò)方水煎后濃縮成原藥材濃度為1.566 g/mL，補(bǔ)腎活血拆方水煎濃縮成原藥材濃度為1.161 g/mL，益氣溫陽(yáng)拆方水煎濃縮成原藥材濃度為0.405 g/mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩０啄憠A鈉膠囊，齊魯制藥有限公司，0.1 g/粒，批號(hào)8A0284E20，生理鹽水溶解后稀釋成濃度為0.005 4 g/mL。5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU），美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)B5002，用DMSO和生理鹽水稀釋成濃度為20 mg/mL（DMSO 終濃度為1 mmol/L）。

1.3 主要試劑與儀器

p-p38MAPK（Tyr323）抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)bs-23251R；巢蛋白（Nestin）、雙腎上腺皮質(zhì)激素（DCX）、神經(jīng)元核抗原（NeuN）、BrdU 抗體，武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)分別為GB12137、GB11317、GB11138、GB12051；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG、CY3標(biāo)記驢抗小鼠IgG、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG，武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)分別為GB22301、GB22303、GB21401、GB23301；DAPI，武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)G1012；免疫組化試劑盒，武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)G1215。硅膠包被線栓（廣州佳靈生物技術(shù)有限公司，規(guī)格3600AAA），組織脫水機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)JJ-12J），石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)JB-P5），石蠟切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)RM2016），組織攤片機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)KD-P），微波爐（格蘭仕微波爐電器有限公司，型號(hào)P70D20TL-P4），正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康，型號(hào)NIKON ECLIPSE E100），熒光顯微鏡（日本尼康，型號(hào)NIKON ECLIPSE TI-SR）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與評(píng)價(jià)

參照課題組前期研究方法[5]，采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型。造模前12 h 大鼠禁食不禁水，10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉；將大鼠仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)，取頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈；結(jié)扎頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈上端近分叉處（約4 mm）用注射器針頭刺一小孔，將直徑為0.28 mm 的線栓插入頸內(nèi)動(dòng)脈，插入深度由分叉處計(jì)約18 mm，固定線栓，依次關(guān)閉切口。假手術(shù)組僅切開(kāi)皮膚，暴露頸總、頸外、頸內(nèi)動(dòng)脈，不予線栓，其余步驟與手術(shù)組相同。大鼠清醒后，采用Longa 評(píng)分法[6]評(píng)定神經(jīng)功能，評(píng)分越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。選取1～3 分大鼠納入實(shí)驗(yàn)，死亡大鼠予以隨機(jī)替補(bǔ)。

2.2 分組及給藥

將30 只成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、芪仙通絡(luò)方組（全方組）、補(bǔ)腎活血拆方組（拆方1組）、益氣溫陽(yáng)拆方組（拆方2 組）和胞磷膽堿組，每組6 只，另設(shè)假手術(shù)組6 只。于MCAO 術(shù)后第3日開(kāi)始灌胃干預(yù)，給藥劑量根據(jù)人與大鼠體表面積換算，芪仙通絡(luò)方組15.66 g/kg，拆方1 組11.61 g/kg，拆方2 組4.05 g/kg，胞磷膽堿組0.054 g/kg，給藥體積均為2.5 mL，假手術(shù)組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，每日1 次；同時(shí)標(biāo)記BrdU 增殖細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[7]，大鼠按50 mg/kg腹腔注射BrdU溶液（20 mg/mL），連續(xù)12 d。

2.3 取材

大鼠末次灌胃4 h 后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，打開(kāi)胸腔暴露心臟，剪開(kāi)右心耳，同時(shí)夾閉腹主動(dòng)脈，將注射器針頭經(jīng)心尖插入主動(dòng)脈端并固定，生理鹽水灌流，待心臟無(wú)血液流出及前爪、肺部顏色變白后，4%多聚甲醛100 mL 灌注，開(kāi)顱取腦，去除小腦、腦干及嗅球后，將大腦置于4%多聚甲醛中固定，4 ℃冰箱保存，用于免疫熒光和免疫組化檢測(cè)。

2.4 神經(jīng)功能評(píng)分測(cè)定

于造模后第3、7、14 日采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分[6]評(píng)定大鼠神經(jīng)功能，對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡能力進(jìn)行全面評(píng)價(jià)，總分18 分，分值越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

2.5 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移及神經(jīng)元定向分化水平

采用免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，分別觀察內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移及神經(jīng)元定向分化水平。將BrdU 標(biāo)記的腦組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，4 μm 連續(xù)冠狀切片；60 ℃烤片2 h，常規(guī)脫蠟至水；EDTA（pH＝8.0）抗原修復(fù)23 min，2 mol/L 鹽酸37 ℃孵育30 min，0.1 mol/L 硼酸漂洗10 min，3%BSA 室溫封閉30 min；分別加入BrdU 一抗（1∶100）、Nestin 一抗（1∶100）、DCX 一抗（1∶100）、NeuN 一抗（1∶100），4 ℃孵育過(guò)夜；室溫復(fù)溫30 min，PBS 洗5 min×3 次，分別滴加FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（1∶50）、FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶50）、CY3 標(biāo)記驢抗小鼠IgG（1∶50），室溫避光孵育1 h；PBS 洗5 min×3 次，滴加DAPI 染色液復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光孵育10 min；PBS 洗5 min×3 次，加入抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)缺血側(cè)室管膜下區(qū)視野拍照采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計(jì)算單位面積內(nèi)Nestin、DCX、NeuN 與BrdU 雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值進(jìn)行定量分析。

2.6 免疫組化檢測(cè)p-p38MAPK 蛋白表達(dá)

采用免疫組化檢測(cè)大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)p-p38MAPK 蛋白表達(dá)。腦組織切片常規(guī)脫蠟至水，EDTA（pH＝9.0）抗原修復(fù)20 min；3%雙氧水室溫避光孵育25 min，滴加3%BSA，室溫封閉30 min；加入p-p38MAPK（Tyr323）抗體（1∶200），4 ℃孵育過(guò)夜；滴加HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶500），室溫孵育50 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，脫水后中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。以棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)缺血側(cè)室管膜下區(qū)視野拍照采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計(jì)算p-p38MAPK 蛋白表達(dá)的平均光密度（MOD），進(jìn)行相對(duì)定量分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 芪仙通絡(luò)方及其拆方對(duì)模型大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀明顯，各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組第7、14 日神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與拆方1 組、拆方2 組和胞磷膽堿組比較，全方組第7、14 日神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較（，分）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分比較（，分）

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與拆方 1 組比較，☆P＜0.05；與拆方2 組比較，▲P＜0.05；與胞磷膽堿 組比較，△P＜0.05

4.2 芪仙通絡(luò)方及其拆方對(duì)模型大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移及神經(jīng)元定向分化水平的影響

BrdU 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞核呈紅色熒光，Nestin、DCX、NeuN 陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞質(zhì)呈綠色熒光，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞核為紅色，胞質(zhì)為綠色，分別代表神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移及神經(jīng)元定向分化水平。假手術(shù)組大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)可見(jiàn)少量Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，其中NeuN/BrdU 雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最少；與假手術(shù)組比較，模型組Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均有所增加（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯增加（P＜0.01）；與拆方1 組、拆方2 組和胞磷膽堿組比較，全方組Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加最明顯（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

表2 各組大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)Nestin/BrdU、DCX/BrdU、NeuN/BrdU雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比較（，個(gè)/mm2）

表2 各組大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)Nestin/BrdU、DCX/BrdU、NeuN/BrdU雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)比較（，個(gè)/mm2）

注：與假手術(shù)組比較，#P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01；與拆方1 組比較，☆P＜0.05；與拆方2 組比較，▲P＜0.05；與胞磷膽堿組比較，△P＜0.05

圖1 各組大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)Nestin、DCX、NeuN、BrdU 陽(yáng)性表達(dá)（免疫熒光染色，×400）

4.3 芪仙通絡(luò)方及其拆方對(duì)模型大鼠室管膜下區(qū)p-p38MAPK 蛋白表達(dá)的影響

假手術(shù)組大鼠室管膜下區(qū)有少量p-p38MAPK 蛋白表達(dá)，模型組p-p38MAPK 蛋白表達(dá)升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組比較，各給藥組p-p38MAPK 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）；與拆方1組、拆方2 組和胞磷膽堿組比較，全方組p-p38MAPK蛋白表達(dá)升高最明顯（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)p-p38MAPK 蛋白表達(dá)比較（免疫組化染色，×400，，每組6 只）

4.4 神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移及神經(jīng)元定向分化細(xì)胞數(shù)與神經(jīng)功能評(píng)分和p-p38MAPK 表達(dá)的相關(guān)性分析

造模后第14 日，采用Pearson 相關(guān)分析法分析全方組與模型組大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移及神經(jīng)元定向分化細(xì)胞數(shù)與神經(jīng)功能評(píng)分和p-p38MAPK 蛋白表達(dá)的相關(guān)性。全方組大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)Nestin/BrdU、DCX/BrdU、NeuN/BrdU 雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與神經(jīng)功能評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.94，P＜0.01；r＝-0.91，P＜0.01；r＝-0.95，P＜0.01），與p-p38MAPK 蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r＝0.90，P＜0.01；r＝0.90，P＜0.01；r＝0.88，P＜0.01），見(jiàn)圖3。提示芪仙通絡(luò)方可能通過(guò)促進(jìn)p38MAPK 磷酸化上調(diào)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生水平，進(jìn)而恢復(fù)腦梗死大鼠受損神經(jīng)功能。

圖3 神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移及神經(jīng)元定向分化細(xì)胞數(shù)與神經(jīng)功能評(píng)分、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

5 討論

由于溶栓或機(jī)械取栓等血管再通療法嚴(yán)格的時(shí)間窗限制，大部分腦梗死患者會(huì)留下不同程度的肢體癱瘓、失語(yǔ)等神經(jīng)功能損傷后遺癥[8]。西醫(yī)采用康復(fù)鍛煉、干細(xì)胞或外泌體移植、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等方法治療，以促進(jìn)神經(jīng)重塑或替代病灶丟失的神經(jīng)元，但存在療效不理想及治療方法尚不成熟的問(wèn)題[9]。

中醫(yī)在促進(jìn)腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)方面具有一定優(yōu)勢(shì)[10]。國(guó)醫(yī)大師劉祖貽教授認(rèn)為，腎藏精，精生髓，腦髓化生源于腎精。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的神經(jīng)元胞體、突起、髓鞘、突觸等結(jié)構(gòu)均為中醫(yī)學(xué)“腦髓”的重要組成部分。腦梗死所致功能缺損應(yīng)歸因于“腦髓虧損”，而“髓”屬陰，促進(jìn)梗死后神經(jīng)再生過(guò)程即為促進(jìn)腎精化腦髓的過(guò)程，其中腎陽(yáng)的鼓舞、推動(dòng)作用非常重要，即《黃帝內(nèi)經(jīng)》所謂“陽(yáng)生陰長(zhǎng)”。因此，劉祖貽教授創(chuàng)新性地提出了“氣陽(yáng)主用”理論[11]。芪仙通絡(luò)方系在該理論指導(dǎo)下經(jīng)多年臨床實(shí)踐研制而成的中風(fēng)效驗(yàn)方。方中君藥黃芪大補(bǔ)元?dú)猓灰蜣阶艟廃S芪益氣溫陽(yáng)，溫補(bǔ)腎中陽(yáng)氣，配伍制何首烏、枸杞子補(bǔ)腎填精，達(dá)助陽(yáng)生陰之用，共為臣藥；佐以丹參等活血通絡(luò)之品。諸藥合用，共奏益氣溫陽(yáng)、補(bǔ)腎活血之功。目前醫(yī)家多采用單純補(bǔ)腎活血法、補(bǔ)腎益氣活血法或補(bǔ)腎活血基礎(chǔ)上加用附子、干姜等藥力峻猛的溫陽(yáng)藥治療腦梗死[12-15]，而少有在補(bǔ)腎活血基礎(chǔ)上加以柔和的益氣溫陽(yáng)藥，意在少火生氣者。本研究結(jié)果表明，芪仙通絡(luò)方及其拆方均可顯著降低腦梗死大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，促進(jìn)其神經(jīng)功能恢復(fù)，其中又以全方組作用最佳，說(shuō)明“氣陽(yáng)主用”創(chuàng)新理論及其指導(dǎo)下的補(bǔ)腎活血藥與益氣溫陽(yáng)藥配伍具有協(xié)同增效作用。

腦梗死后神經(jīng)功能缺損后遺癥產(chǎn)生的根本原因是神經(jīng)元減少[16]。目前普遍認(rèn)為，成年哺乳動(dòng)物室管膜下區(qū)、海馬齒狀回等部位存在神經(jīng)干細(xì)胞，但正常情況下處于休眠狀態(tài)[17]。而在特定條件如缺血、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等因素刺激下，內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生可以被誘導(dǎo)，室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞激活、增殖并向缺血紋狀體區(qū)域遷移，同時(shí)分化為神經(jīng)元并整合入神經(jīng)環(huán)路[18]。如不進(jìn)行干預(yù)，其分化為神經(jīng)元的概率十分有限[19]。因此，近年來(lái)通過(guò)提高內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生水平促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的治療方法越來(lái)越受到關(guān)注[20-21]。在神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化受細(xì)胞內(nèi)MAPK、Wnt、Notch、BMP 等信號(hào)通路及細(xì)胞外相鄰細(xì)胞、細(xì)胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)等的精準(zhǔn)調(diào)控[22]。其中作為MAPK 家族重要成員的p38MAPK 信號(hào)通路日益受到重視，該通路的關(guān)鍵元件p38MAPK 發(fā)生磷酸化是該通路激活的標(biāo)志。既往研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)p-p38MAPK 表達(dá)可顯著抑制體外培養(yǎng)的人海馬神經(jīng)干細(xì)胞增殖，抑制大鼠室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞遷移及向神經(jīng)元定向分化[23-25]。提示p38MAPK 在神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移及神經(jīng)元定向分化過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠腦缺血發(fā)生后，缺血側(cè)室管膜下區(qū) Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及NeuN/BrdU 雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組有所增加，同時(shí)p-p38MAPK 蛋白表達(dá)上調(diào)。芪仙通絡(luò)方干預(yù)后，缺血側(cè)室管膜下區(qū)Nestin/BrdU、DCX/BrdU 及 NeuN/BrdU 雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及p-p38MAPK 蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高，表明芪仙通絡(luò)方能促進(jìn)腦梗死大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、神經(jīng)元定向分化及p38MAPK 活化。此外，通過(guò)Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，芪仙通絡(luò)方干預(yù)后，腦梗死大鼠缺血側(cè)室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移及神經(jīng)元定向分化細(xì)胞數(shù)與神經(jīng)功能評(píng)分呈高度負(fù)相關(guān)，而與p-p38MAPK 蛋白表達(dá)呈高度正相關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明p38MAPK 信號(hào)通路介導(dǎo)的室管膜下區(qū)神經(jīng)發(fā)生可能在芪仙通絡(luò)方促進(jìn)腦梗死大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，芪仙通絡(luò)方及其拆方能改善腦梗死大鼠受損神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與促進(jìn)缺血側(cè)室管膜下區(qū)p38MAPK 活化、上調(diào)內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生水平有關(guān)，其中以全方組作用最佳。