基于DLL4/Notch1信號通路的麥粒灸對薄型子宮內(nèi)膜大鼠血管生成的影響

沈真如，金純純，席瑾，劉靜玉，潘妍，李茜，程潔，沈潔，夏有兵，2，穆艷云

1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023；2.徐州醫(yī)科大學，江蘇 徐州 221004

薄型子宮內(nèi)膜目前尚無明確定義，一般將排卵后期經(jīng)陰道超聲檢查子宮內(nèi)膜厚度不足7 mm 作為標準[1-2]。而子宮內(nèi)膜厚度不足可導致子宮內(nèi)膜容受性降低，子宮內(nèi)膜容受性是胚胎著床過程中的重要因素[3]。Momeni 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，當子宮內(nèi)膜厚度≤7 mm時，胚胎植入率降低。內(nèi)分泌失調(diào)、人工流產(chǎn)導致子宮內(nèi)膜損傷增多，薄型子宮內(nèi)膜也越發(fā)常見，臨床可表現(xiàn)為月經(jīng)減少、閉經(jīng)、不孕或反復流產(chǎn)等[5]。目前，臨床多采用雌激素、低劑量阿司匹林等治療方法，但效果欠理想，且有一定不良反應[6]。麥粒灸作為一種傳統(tǒng)中醫(yī)艾灸療法，具有促進組織修復、整體調(diào)節(jié)的優(yōu)點，還能進一步激活機體防御系統(tǒng)，產(chǎn)生持久及多方面的調(diào)節(jié)作用，可彌補西藥治療的不足，減輕其不良反應[7]。血管生成受損和子宮血流量減少被認為是薄型子宮內(nèi)膜形成的原因[8]。血管生成是女性生殖系統(tǒng)周期性變化的關(guān)鍵因素，除子宮內(nèi)膜生長外，還包括黃體形成和卵泡發(fā)育[9]。Hahajan 等[10]報道，薄型子宮內(nèi)膜病理生理特征可能與子宮動脈血流阻抗增加、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平降低有關(guān)。VEGF、血管生成素-2（Ang-2）與子宮內(nèi)膜厚度密切相關(guān)[11]。Notch 信號通路在胚胎發(fā)生、器官發(fā)育、血管生成中發(fā)揮重要作用，DLL4 是眾多Notch 配體中具有血管內(nèi)皮細胞特異性的配體，是Notch 信號通路中調(diào)節(jié)血管生成的關(guān)鍵分子[12-13]。艾灸溫熱刺激可舒張血管，增加遠端血管的血流量[14]。本實驗基于DLL4/Notch1信號通路觀察麥粒灸對薄型子宮內(nèi)膜大鼠子宮內(nèi)膜組織VEGF、Ang-2 表達及血管生成的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

SPF 級雌性SD 大鼠30 只，體質(zhì)量（180±20）g，8～12 周齡，南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK（滬）2018-0006。飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對濕度40%～60%環(huán)境，光照12 h，正常攝食飲水，適應性飼養(yǎng)1 周。每日上午固定時間進行大鼠陰道脫落細胞涂片，觀察其動情周期，待出現(xiàn)一個完整、正常動情周期后開始實驗。按隨機數(shù)字表法將大鼠分為對照組、模型組、麥粒灸組，每組10 只。實驗操作遵循《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學倫理委員會審查批準（202004A017）。

1.2 主要試劑與儀器

VEGF 抗體（貨號19003-1-AP）、Ang-2 抗體（貨號24613-1-AP），美國Proteintech 公司；Notch1 抗體（貨號3608S），美國CST 公司；DLL4 抗體（貨號ab183532），英國Abcam 公司；β-tubulin 抗體（貨號AB0039）、HRP 標記山羊抗兔IgG（貨號AB0101），中國Abways 公司；HRP 標記兔抗山羊IgG（貨號A21030），亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液（貨號P0013B），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix（貨號11201ES03），上海翊圣生物科技有限公司；HE 染色試劑盒（貨號C0105），上海碧云天生物技術(shù)有限公司。吸入式氣體麻醉機（R550），深圳瑞沃德生命科技有限公司；石蠟組織包埋機（Tissue-Tek），日本Sakura公司；石蠟切片機（RM2235），德國Leica 公司；電泳儀（1645050），美國Bio-Rad 公司；實時熒光定量PCR 儀（Agilent Mx3000P），美國StrataGene 公司。

1.3 造模

參照文獻[15-16]方法造模。取動情期SD 大鼠，采用吸入式氣體麻醉機麻醉，仰臥位固定，腹部手術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒后，下腹部正中縱行切口（距恥骨聯(lián)合上約2 cm），長約2.5～3 cm，打開腹腔，無齒鑷輕輕將大鼠左側(cè)子宮拉直，用0 號縫合線活結(jié)結(jié)扎子宮近卵巢及近陰道端。無菌紗布墊于子宮周圍，于子宮頸上方0.5 cm 處用1 mL 注射器緩慢注入95%乙醇，使子宮保持充盈狀，針頭停留2 min，緩慢吸出95%乙醇，輕輕擠壓殘留液體，生理鹽水沖洗1～2次，無菌紗布將沖洗液擦干，回納子宮，為防止粘連，再用生理鹽水沖洗腹腔1～2 次，逐層縫合后碘伏消毒。術(shù)后連續(xù)3 d 肌內(nèi)注射青霉素（8 萬U/只）預防感染。手術(shù)后密切觀察大鼠精神狀態(tài)、食納情況。

1.4 干預

參照《實驗針灸學》[17]定位，選取“關(guān)元”“子宮”（雙側(cè)）。麥粒灸組自造模次日起予麥粒灸治療，大鼠麻醉后腹部備皮，于施灸處涂抹適量凡士林，將麥粒型艾炷（約5 mg/壯）置于穴位處，用線香將其點燃，待大鼠施灸部位出現(xiàn)短暫收縮動作時移去剩余艾絨，每穴7 壯，1 次/d。對照組及模型組只麻醉固定15 min。嚴格規(guī)范執(zhí)行各項操作，連續(xù)干預3 個動情周期（約15 d）。

1.5 取材

實驗結(jié)束后，頸椎脫臼處死大鼠，開腹取子宮，觀察子宮形態(tài)。取部分子宮組織，4%多聚甲醛固定，剩余子宮組織置于凍存管內(nèi)，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標檢測

1.6.1 HE 染色

4%多聚甲醛固定大鼠子宮組織，石蠟包埋，切片（4 μm），行HE 染色，鏡下觀察大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)。每個子宮組織隨機選取1 張切片，Image J 圖像處理軟件測定大鼠子宮內(nèi)膜厚度（子宮內(nèi)膜肌層交接處至宮腔的垂直距離），隨機選取4 個視野，以平均值作為該子宮組織內(nèi)膜厚度。統(tǒng)計每張切片血管及腺體數(shù)目。

1.6.2 免疫組化染色

取大鼠子宮組織切片烘干，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫溶液浸泡10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶；PBS 浸洗后，抗原修復，自然冷卻至室溫；1%BSA 封閉1 h，滴加VEGF、Ang-2 一抗（1∶50），4 ℃孵育12 h；次日復溫并用PBS 浸洗，滴加二抗，孵育30 min；PBS 浸洗，DAB 顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照，每張切片隨機選取4 個視野，Image Pro Plus 圖像處理軟件測定VEGF、Ang-2 的平均光密度（MOD）。

1.6.3 Western blot 檢測

取大鼠子宮組織，冰上刮取子宮內(nèi)膜，加入適量預冷的RIPA 裂解液，裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液測定蛋白濃度；蛋白樣品經(jīng)8% SDS-PAGE 進行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%BSA 封閉1 h；加入Notch1（1∶1 000）、DLL4（1∶1 000）、β-tubulin 一抗（1∶1 000），4 ℃孵育12 h；TBST 洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h；TBST 洗膜3 次，暗室中曝光顯影，以β-tubulin 為內(nèi)參，采用Image J 圖像處理軟件測定Notch1、DLL4 蛋白相對表達量。

1.6.4 RT-qPCR 檢測

提取大鼠子宮內(nèi)膜組織總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。按試劑盒說明書進行熒光定量PCR檢測。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設計與合成，見表1。

表1 各基因PCR 引物序列

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用方差分析，Levene 檢驗方差齊性，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnet’s T3法；不服從正態(tài)分布用非參數(shù)統(tǒng)計的秩和檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 麥粒灸對模型大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)的影響

對照組大鼠動情期子宮組織結(jié)構(gòu)完整，子宮內(nèi)膜腺上皮及腔上皮細胞形態(tài)正常，呈單層立方狀，腺體密集、血管豐富；模型組大鼠動情期子宮組織結(jié)構(gòu)不完整，子宮壁全層變薄，腺上皮及腔上皮細胞多呈扁平、低柱狀，內(nèi)膜組織血管稀疏、腺體減少；麥粒灸組大鼠動情期子宮組織結(jié)構(gòu)基本完整，子宮內(nèi)膜表面呈波浪形，腺上皮及腔上皮細胞形態(tài)較為正常，腺體較少，部分區(qū)域新生毛細血管增多。見圖1。與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜厚度明顯變薄，腺體數(shù)及血管數(shù)目明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，麥粒灸組大鼠子宮內(nèi)膜厚度增加，腺體數(shù)及血管數(shù)目明顯增多（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2。

圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)（HE 染色）

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜厚度、腺體數(shù)及血管數(shù)目比較（，每組5只）

2.2 麥粒灸對模型大鼠子宮內(nèi)膜組織血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素-2蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織VEGF、Ang-2蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，麥粒灸組大鼠子宮內(nèi)膜組織VEGF、Ang-2蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.05）。見圖3～圖5。

圖4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織Ang-2 陽性表達（免疫組化染色）

圖5 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織VEGF、Ang-2蛋白表達比較（，每組5只）

2.3 麥粒灸對模型大鼠子宮內(nèi)膜組織Notch1、DLL4蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織Notch1、DLL4蛋白表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，麥粒灸組大鼠子宮內(nèi)膜組織Notch1、DLL4蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖6、圖7。

圖6 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織Notch1、DLL4蛋白免疫印跡圖

圖7 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織Notch1、DLL4 蛋白表達比較（，每組5只）

2.4 麥粒灸對模型大鼠子宮內(nèi)膜組織血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素-2、Notch1、DLL4 mRNA 表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織VEGF、Ang-2、Notch1、DLL4mRNA 表達明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，麥粒灸組大鼠子宮內(nèi)膜組織VEGF、Ang-2、Notch1、DLL4mRNA表達明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖8、圖9。

圖8 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織VEGF、Ang-2mRNA 表達比較（，每組5只）

圖9 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織Notch1、DLL4 mRNA 表達比較（，每組5只）

3 討論

子宮內(nèi)膜是一個復雜的動態(tài)組織，包括基底層和功能層，排卵后螺旋動脈血管收縮，流向功能層血液減少，減少氧張力有助于胚胎植入[18]。當子宮內(nèi)膜變薄時，胚胎植入更靠近基底層，具有更多的血流和較高的氧張力，從而導致活性氧產(chǎn)生，不利于胚胎的發(fā)育和植入[19]。研究顯示，子宮內(nèi)膜過薄會影響子宮內(nèi)膜容受性并顯著降低胚胎著床率[20-21]。

VEGF和Ang-2是促進血管生成的重要因子。血管生成是行經(jīng)后子宮內(nèi)膜再生的必需過程，對子宮內(nèi)膜容受性也起著至關(guān)重要的作用[22]。許多血管生成因子已被證實與子宮內(nèi)膜血管的發(fā)育和分化有關(guān)。VEGF 是包括子宮內(nèi)膜在內(nèi)的多種組織中血管生長和重塑的關(guān)鍵介質(zhì)，可直接作用于血管內(nèi)皮細胞，促進新生血管形成[23-24]。Takasaki 等[25]推測，薄型子宮內(nèi)膜血管發(fā)育不良可能由于子宮內(nèi)膜VEGF水平較低，影響子宮內(nèi)膜容受性。Ang-2作為促進血管形成的重要因子之一，能與血管內(nèi)皮細胞特異性酪氨酸激酶受體結(jié)合，進而影響血管的穩(wěn)定性，且與VEGF密切相關(guān)[26]。萬秋園等[27]研究表明，益母草總生物堿可增加薄型子宮內(nèi)膜大鼠VEGF、Ang-2的表達，促進子宮內(nèi)膜血管生成，改善子宮內(nèi)膜厚度。

DLL4/Notch1信號通路在子宮內(nèi)膜細胞、胚胎、胎盤組織中均有調(diào)控血管發(fā)育的作用[12]。Notch 通路參與調(diào)節(jié)多種細胞的分化和發(fā)育，在胚胎發(fā)育、細胞增殖分化、腫瘤轉(zhuǎn)移、干細胞分化調(diào)節(jié)等方面扮演重要角色[13]。DLL4是一種跨膜蛋白，作為Notch配體DLL4基因缺失會導致胚胎和產(chǎn)后血管發(fā)育嚴重異常[28]。研究發(fā)現(xiàn)，在反復著床失敗患者的子宮內(nèi)膜中Notch1表達降低可能抑制VEGF受體（VEGFA）活性，使VEGFA 和DLL4/Notch1的平衡狀態(tài)被打破，最終導致胚胎反復種植失敗[29]。

麥粒灸屬直接灸，其灼熱、灼痛感穿透性明顯。灸法可通過激發(fā)經(jīng)氣起到整體調(diào)節(jié)作用，具有溫經(jīng)通絡、活血散瘀等功效，還能調(diào)節(jié)機體免疫功能[30]。關(guān)元為任脈穴，又為足三陰經(jīng)交會穴，還與胞宮、沖脈、督脈聯(lián)系密切，具有補腎固本、通調(diào)陰陽、和血理沖任之效。研究表明，艾灸關(guān)元等穴可有效促進子宮動脈血流，改善子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，提高妊娠率[31]。子宮屬經(jīng)外奇穴，為子宮在腹部的體表投影，艾灸該穴可起到溫煦子宮、改善子宮血流的作用[32]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，麥粒灸可提高薄型子宮內(nèi)膜大鼠子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)因子同源框轉(zhuǎn)錄因子HOXA10、白血病抑制因子、波形蛋白、角蛋白和VEGF 表達，改善大鼠子宮內(nèi)膜形態(tài)，誘導血管再生，調(diào)節(jié)大鼠子宮內(nèi)膜微環(huán)境[33]。

本實驗結(jié)果顯示，95%乙醇宮腔注射后，大鼠子宮結(jié)構(gòu)不完整，腺體稀疏萎縮，血管數(shù)量減少，子宮內(nèi)膜顯著變薄，子宮內(nèi)膜組織VEGF、Ang-2蛋白和mRNA 表達顯著降低，與血管生成相關(guān)的Notch信號通路Notch1、DLL4蛋白和mRNA 水平顯著下調(diào)，提示造模后血管生成嚴重受損。麥粒灸“關(guān)元”“子宮”可改善薄型子宮內(nèi)膜大鼠宮腔形態(tài)，促進上皮細胞與間質(zhì)細胞生長，增加子宮內(nèi)膜厚度及腺體和血管數(shù)目，顯著提高大鼠子宮內(nèi)膜組織VEGF、Ang-2蛋白和mRNA 表達，促進血管生成。進一步探討其機制發(fā)現(xiàn)，麥粒灸可上調(diào)Notch信號通路相關(guān)分子Notch1、DLL4蛋白和mRNA 水平。本實驗初步探討麥粒灸對薄型子宮內(nèi)膜大鼠血管生成的影響，從DLL4/Notch1信號通路分析其可能的作用機制，而VEGF與Notch信號通路在血管生成過程中的相互作用及機制還需今后進一步研究。