溫針結(jié)合電針對卵巢早衰大鼠血清性激素及炎癥因子的影響

張琴，嵇波，謝亞娜，牟秋杰，趙國楨，徐塽，劉翼天，石天宇，葛云鵬，韓娜娜，張靖宇，劉玉婷

1.北京中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，北京 100029；2.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京 100010

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性40 歲以前出現(xiàn)雌二醇（estradiol，E2）降低和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）升高，導致不孕及生殖器官萎縮的一種疾病[1]。目前西醫(yī)主要以激素替代療法緩解絕經(jīng)癥狀，以輔助生殖技術(shù)解決生殖問題，但不良反應(yīng)明顯[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，針灸能有效調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌環(huán)境，可在一定程度上延緩卵泡閉鎖，改善卵巢功能[3]。針灸治療，穴位是基礎(chǔ)，方法是關(guān)鍵。分析既往研究發(fā)現(xiàn)，臨床多從手針、電針、溫針等入手，涉及穴位覆蓋關(guān)元、三陰交、腎俞等[4]，但對不同針刺方法的配合及穴位配伍的機制研究甚少。因此，本實驗以溫針“關(guān)元”結(jié)合電針“三陰交”，從免疫炎性和內(nèi)分泌角度探討針刺對POF 大鼠卵巢功能的影響，旨在為針灸防治POF 提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

10 周齡SPF 級雌性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量（250±20）g，北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養(yǎng)于室溫（24±1）℃、相對濕度50%～60%屏障系統(tǒng)，12 h 明暗交替，自由攝食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d 后，每日8:00－9:00 對大鼠陰道脫落細胞進行涂片處理，連續(xù)觀察7 d，選擇動情周期規(guī)律的大鼠作為實驗對象。實驗動物處理經(jīng)北京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（BUCM-4-2019110802-4038）。

1.2 藥物

雷公藤多苷片，湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號20190417，10 mg/片；結(jié)合雌激素片，0.625 mg/片，新疆新姿源生物制藥有限責任公司，批號20190304。

1.3 主要試劑與儀器

FSH ELISA 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號ml059034-J；E2ELISA 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號ml002891-J；抗苗勒氏管激素（AMH）ELISA 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號ml003371-J；干擾素-γ（INF-γ）免疫組化試劑盒，美國Proteintech 公司，貨號15365-1-AP；白細胞介素-4（IL-4）免疫組化試劑盒，美國Proteintech公司，貨號66142-1-lg。0.20 mm×13 mm 一次性華佗牌無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），HT-2 型溫針電針綜合治療儀（常州華音電子有限公司），二導HAN’s 穴位刺激儀（北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)有限公司，型號LH202H），低溫離心機（德國Eppendorf 公司，型號Centrifuge 5810R），微孔板檢測系統(tǒng)（美國Molecular Devices 公司，型號Spectra Max M2），全玻片掃描系統(tǒng)（日本OLYMPUS 公司，型號VS200）。

1.4 分組、造模及干預

將實驗大鼠隨機分為對照組、模型組、針刺組和藥物組，每組8 只。除對照組外，其余組大鼠每日8:30給予雷公藤多苷75 mg/kg 灌胃，每日1 次，連續(xù)14 d，制備POF 模型[5]。自造模第8 日起，連續(xù)7 d，每日7:50 取大鼠陰道脫落細胞行美藍染色，鏡下觀察大鼠動情周期變化。若出現(xiàn)動情周期紊亂、動情間期延長、動情期消失等為造模成功[6]。

造模結(jié)束后（第15 日開始），對照組和模型組每日抓取固定20 min，針刺組每日進行溫針、電針，取穴參照《實驗針灸學》[7]，分別針刺“三陰交”“關(guān)元”?！叭幗弧敝贝?.5 mm，接穴位刺激儀負極，在“三陰交”上方2 mm 處針刺入皮，連接正極，電流強度0.5 mA，頻率2/15 Hz，時間20 min?！瓣P(guān)元”朝子宮方向平刺1 cm，接溫針儀，打開加熱功能，時間20 min。藥物組每日予結(jié)合雌激素灌胃，給藥劑量0.075 mg/kg。共干預28 d，第29 日麻醉大鼠，行腹主動脈采血，并取卵巢組織。

1.5 指標檢測

1.5.1 動情周期

治療第14～28 日，每日8:00－9:00 行大鼠陰道脫落細胞涂片美藍染色，觀察動情周期變化。

1.5.2 卵巢指數(shù)

大鼠腹主動脈取血后迅速取卵巢組織，去除表面脂肪組織，稱量濕重并記錄。計算卵巢指數(shù)（卵巢濕重÷末次體質(zhì)量×100%）。

1.5.3 HE 染色

稱重后將左側(cè)卵巢組織迅速放入4%多聚甲醛固定液，固定48 h，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度4 μm），按照HE 染色試劑盒說明書染色，鏡下觀察卵巢組織及卵泡形態(tài)。

1.5.4 血清雌二醇、卵泡刺激素及抗苗勒氏管激素含量

將腹主動脈血室溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。實驗按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，檢測血清E2、FSH 和AMH 含量。

1.5.5 卵巢組織干擾素-γ 和白細胞介素-4 蛋白表達

每只大鼠隨機選擇2 張石蠟切片，置于70 ℃恒溫烤箱烘烤30 min，脫蠟、水化，于修復液中進行微波加熱修復，H2O2溶液封閉10 min，山羊血清封閉80 min，按照免疫組化試劑盒說明書進行抗體孵育、染色、脫水、封片，鏡下隨機選擇2 個視野觀察。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SAS9.4 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以表示，多組比較符合正態(tài)分布且方差齊用方差分析，兩兩比較用LSD法；計數(shù)資料用Fisher’s 精確概率法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 陰道脫落細胞涂片分析

陰道脫落細胞在動情前期多為橢圓形有核上皮細胞，動情期為片狀無核角化細胞，動情后期為大量白細胞和少量無核角化細胞，動情間期有白細胞、有核上皮細胞、片狀角化細胞。與對照組比較，模型組大鼠動情周期紊亂率顯著上升（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組和藥物組大鼠動情周期紊亂率顯著下降（P＜0.05）。見圖1、表1。

圖1 大鼠陰道脫落細胞涂片（美藍染色，×20）

表1 各組大鼠動情周期變化比較

2.2 針刺對模型大鼠卵巢指數(shù)的影響

與對照組比較，模型組大鼠卵巢指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組大鼠卵巢指數(shù)顯著升高（P＜0.05），藥物組大鼠卵巢指數(shù)有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與藥物組比較，針刺組大鼠卵巢指數(shù)未見明顯差異（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠卵巢指數(shù)比較（，每組8 只）

2.3 HE 染色結(jié)果

對照組大鼠卵巢結(jié)構(gòu)正常，可見原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇卵泡，黃體較多，分布均勻。與對照組比較，模型組卵巢組織松散，卵泡排列紊亂，結(jié)締組織增多，初級卵泡、次級卵泡和竇卵泡明顯減少，閉鎖卵泡增加；與模型組比較，針刺組和藥物組大鼠卵巢組織相對緊實致密，次級卵泡增加，竇卵泡增多，黃體均勻，閉鎖卵泡減少。見圖3。

圖3 各組大鼠卵巢組織形態(tài)（HE 染色，×4）

對照組細胞排列整齊，細胞核清晰圓潤，顆粒細胞層豐厚，可見清晰卵子細胞核、透明帶和放射冠；模型組較對照組細胞排列不均，細胞核邊緣界限不清，卵泡形態(tài)不規(guī)則，顆粒細胞逐漸溶解，卵泡內(nèi)卵子丟失，未見透明帶與放射冠；針刺組較模型組細胞排列整齊，細胞核邊界清晰，周圍基質(zhì)細胞層次分明，顆粒細胞層較厚，可見透明帶；與模型組比較，藥物組細胞排列較整齊，細胞核邊界較清晰，顆粒細胞層增多，但排列稍顯不均。見圖4。

圖4 各組大鼠卵泡形態(tài)（HE 染色，×40）

2.4 針刺對模型大鼠血清雌二醇、卵泡刺激素及抗苗勒氏管激素含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清E2、AMH 含量顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），F(xiàn)SH 含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組和藥物組大鼠血清AMH、E2含量顯著增加（P＜0.05），F(xiàn)SH 含量顯著減少（P＜0.01）；針刺組與藥物組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠血清E2、AMH、FSH 含量比較（，每組8 只）

2.5 針刺對模型大鼠卵巢組織干擾素-γ 和白細胞介素-4 蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠卵巢組織IFN-γ 蛋白表達顯著升高（P＜0.01），IL-4 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組、藥物組大鼠卵巢組織IFN-γ 蛋白表達顯著降低（P＜0.01），IL-4 蛋白表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）；針刺組與藥物組比較未見明顯差異。見圖6～圖8。

圖6 各組大鼠卵巢組織IFN-γ 陽性表達（免疫組化染色，×40）

圖7 各組大鼠卵巢組織IL-4 陽性表達（免疫組化染色，×40）

圖8 各組大鼠卵巢組織IL-4、IFN-γ 蛋白表達比較（，每組8 只）

3 討論

POF 屬中醫(yī)學“血枯”“血隔”“閉經(jīng)”“不孕”等范疇，病因是“天癸早竭”[8]?！端貑?上古天真論篇》有“二七而天癸至，任脈通，太沖脈盛，月事以時下，故有子……七七任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無子也”。女子生育功能與任脈盛衰息息相關(guān)，任脈虛是POF 的致病關(guān)鍵，但造成“未老先衰”最根本的原因是氣血虧虛，尤以精血虧虛為主，從而導致形容枯槁、經(jīng)水斷絕。

針灸治療中穴位選擇和針刺方法是決定療效的重要因素。三陰交為足三陰經(jīng)交會穴，承接三條陰經(jīng)之氣，刺激三陰交不僅可健脾，還可疏肝益腎[9]，進而益精旺血。研究表明，電針“三陰交”可調(diào)節(jié)卵巢激素水平及卵泡的生長發(fā)育狀態(tài)[10-11]，以達到延緩卵巢衰老的作用。關(guān)元是任脈和足三陰經(jīng)的交會穴，溫針的熱量可通過針體傳遞，深入至組織內(nèi)部并向周圍擴散，具有行氣活血、溫經(jīng)通絡(luò)、振奮陽氣等作用[12-13]，能有效培腎固本、調(diào)理沖任、溫通胞宮。本實驗結(jié)果表明，溫針“關(guān)元”結(jié)合電針“三陰交”能調(diào)整POF 大鼠動情周期，改善卵巢形態(tài)，這可能與其益精固本、溫通沖任的作用相關(guān)。

POF 對卵巢內(nèi)環(huán)境最直觀影響體現(xiàn)在E2水平降低與FSH 水平升高。E2由卵泡分泌，是主要的類固醇激素，能促進卵泡早期發(fā)育[14]，協(xié)同F(xiàn)SH 促進卵泡膜細胞和顆粒細胞膜上合成黃體生成素受體，促進顆粒細胞增殖和分化[15]。FSH 是垂體前葉嗜堿性細胞分泌的一種糖蛋白激素，主要功能是促進卵泡的發(fā)育和成熟，激活卵巢顆粒細胞內(nèi)的芳香化酶[16-17]，促進E2合成與分泌，并且參與調(diào)節(jié)優(yōu)勢卵泡的選擇與進一步發(fā)育。FSH 與E2水平能高度反映卵巢功能，但二者均隨月經(jīng)周期而改變，穩(wěn)定性差。La Marca 等[18]發(fā)現(xiàn)，AMH 在整個月經(jīng)周期呈相對穩(wěn)定狀態(tài)，或許能作為確定卵巢儲備的標志物[19]。AMH 主要由顆粒細胞分泌，開始表達于初級卵泡，在次級卵泡和小竇卵泡中達到峰值[20]，具有抑制FSH 的功能[21]，是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)唯一可調(diào)控卵泡募集的細胞因子，對卵泡的生長發(fā)育及優(yōu)勢卵泡的選擇起重要作用。本研究顯示，溫針“關(guān)元”結(jié)合電針“三陰交”能顯著提高POF 大鼠血清E2、AMH 含量（P＜0.05），降低血清FSH 含量（P＜0.01），改善大鼠內(nèi)分泌環(huán)境，提高卵巢儲備，對POF 大鼠卵巢功能有良性調(diào)節(jié)作用。

IFN-γ 是Th1 細胞分泌的具有代表性的細胞因子，能促進細胞免疫，Th2 細胞分泌的代表性因子IL-4主要介導體液免疫，Th1、Th2 細胞通過各自分泌的細胞因子相互制約。既往研究顯示，IFN-γ 增多最終可導致卵巢功能異常[22]，而IL-4 可抑制該反應(yīng)。IL-4和IFN-γ 是影響卵巢免疫炎性反應(yīng)的重要細胞因子，IFN-γ 作為典型的促炎因子，能活化單核、巨噬細胞并增強溶菌酶活性。研究發(fā)現(xiàn)，POF 患者血清IFN-γ水平升高[23]，POF 大鼠卵巢組織IFN-γ 蛋白與mRNA表達均升高[24]。IFN-γ 還存在于卵泡液中，在大鼠原始卵泡、初級卵泡及次級卵泡的卵泡內(nèi)膜細胞呈強陽性反應(yīng)，在成熟卵泡內(nèi)膜細胞則呈弱陽性反應(yīng)[25]。IL-4 作為抗炎因子，能拮抗IFN-γ 的作用，它最初由Howard等[26]確定為B細胞的伴生因子，隨后證實IL-4在生理和病理條件下都在白細胞存活中起重要作用[27-28]，如Th2 細胞介導的體液免疫。IL-4 在對抗與年齡相關(guān)的促炎變化方面有潛在的作用，然而炎癥本身是否源于缺乏IL-4 信號尚不清楚[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，溫針“關(guān)元”結(jié)合電針“三陰交”能有效降低促炎因子IFN-γ 蛋白表達（P＜0.01），提高抗炎因子IL-4 蛋白表達（P＜0.01）。我們推測針刺通過提高IL-4 的表達，誘導Th0 向Th2 轉(zhuǎn)化并抑制IFN-γ 促炎作用，調(diào)控Th1/Th2 比值，使細胞免疫與體液免疫達到平衡，從而降低卵巢組織炎性反應(yīng)，對卵巢起到保護作用。

綜上所述，本研究提示溫針“關(guān)元”結(jié)合電針“三陰交”可調(diào)節(jié)POF 大鼠生殖內(nèi)分泌環(huán)境，降低卵巢炎性反應(yīng)，從而改善卵泡發(fā)育，恢復卵巢形態(tài)，提高卵巢儲備能力，具有改善POF 的作用。