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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討余甘子葉總黃酮抗結(jié)直腸癌的分子機(jī)制及活性成分

    2021-10-13 05:04:50黃燕鄒天駿羅雪菲鐘振國(guó)蘭太進(jìn)
    關(guān)鍵詞:黃酮數(shù)據(jù)庫(kù)

    黃燕,鄒天駿,羅雪菲,鐘振國(guó),蘭太進(jìn)

    1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣西 南寧 530200;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院,廣西 南寧 530011;3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,廣西 南寧 530200

    中藥在腫瘤的治療和預(yù)防中發(fā)揮著重要作用,具有多靶點(diǎn)和低毒性的特點(diǎn)[1-2]。余甘子Phyllanthus emblicaL.是大戟科Euphorbiaceae 葉下珠屬Phyllanthus落葉小喬木或灌木,在我國(guó)分布廣泛,資源豐富。全世界約有17 個(gè)國(guó)家的傳統(tǒng)藥物體系中使用了余甘子,我國(guó)約有16 個(gè)民族使用該藥[3],其被2015 年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載,以果實(shí)入藥[4]。在民間,余甘子常用于治療膽道疾病、支氣管炎、糖尿病等,也以根和葉入藥[5]。研究表明,余甘子葉具有廣泛的藥理活性[6]。目前認(rèn)為黃酮類(lèi)是余甘子葉的主要活性成分,并已鑒定出多種黃酮類(lèi)化合物[7]。余甘子葉總黃酮(total flavonoids fromPhyllanthus emblicaleaves,TFPL)可抑制多種腫瘤的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡[8-9],但其調(diào)控機(jī)制和活性成分尚不甚清楚。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,系統(tǒng)探究TFPL抗結(jié)直腸癌的分子機(jī)制及效應(yīng)物質(zhì),為后續(xù)研究提供參考。

    1 儀器、試藥與細(xì)胞

    Impact Ⅱ型超高分辨四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,美國(guó)Bruker Daltonic;Waters 2695-2489 高效液相色譜儀,美國(guó)Waters;SynergyTMH1 型多功能微孔檢測(cè)儀,美國(guó)BioTek Instruments;3131 型二氧化碳培養(yǎng)箱,賽默飛世爾科技(中國(guó));STR16 型臺(tái)式冷凍離心機(jī),美國(guó)Thermo;BSA224S 型分析天平,北京賽多利斯;Omni-G 型獨(dú)立超純水系統(tǒng),廈門(mén)銳思捷;SCQ-6201型超聲波清洗儀,上海聲彥;UV-2550 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津;RE-5203 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮;YRDC-0515 型低溫恒溫槽,上海亞榮;DHG-9203A 型電熱恒溫干燥箱,上海齊欣;HWS-24型水浴鍋,上海一恒。

    余甘子葉采自廣西邕寧縣,經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)劉壽養(yǎng)教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥葉。1640 不完全培養(yǎng)基,江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào)KG 038784;胎牛血清,浙江天杭科技股份有限公司,批號(hào)18 070503;MTS,江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào)20 190304;無(wú)水乙醇,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20 161212;甲醇(分析純),成都科隆化學(xué)品有限公司,批號(hào)2018 030801;甲醇(色譜純),賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,批號(hào) 178512;DMSO,美國(guó)SIGMA-ALDRICH 公司,批號(hào)SHBG3288V;水為超純水,其他試劑均為分析純。

    人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞COLO 320DM、DLD-1 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),正常結(jié)直腸細(xì)胞NCM460 購(gòu)自上海酶研生物科技有限公司。

    2 方法

    2.1 余甘子葉總黃酮制備

    2.1.1 粗提取

    取余甘子葉適量,粉碎成粗粉,加95%乙醇浸泡48 h 后進(jìn)行滲漉,收集滲漉液;藥渣干燥,加50%乙醇浸泡48 h,加同濃度乙醇進(jìn)行滲漉,收集滲漉液。合并2 次滲漉液,減壓濃縮,回收乙醇,得到濃縮液[10]。

    2.1.2 純化

    將D101 大孔吸附樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h,使其充分膨脹,用蒸餾水洗至無(wú)漂浮物,濕法裝柱,沉淀24 h,濃縮液經(jīng)溫水溶解后上柱,吸附2 h,用蒸餾水洗脫,至洗脫液澄清透明,再依次用30%、50%、70%乙醇進(jìn)行洗脫,洗脫液顏色變淺后,換梯度洗脫,洗脫液與鹽酸-鎂粉呈陽(yáng)性反應(yīng)后開(kāi)始收集洗脫液。將收集的各梯度洗脫液混合,減壓濃縮。用乙酸乙酯萃取,收集乙酸乙酯層。減壓濃縮,干燥處理成粉末,即得TFPL[10]。

    2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

    2.2.1 細(xì)胞種板

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,胰酶消化,得到單細(xì)胞懸液,細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整至所需細(xì)胞量,置50 mL 離心管,加入培養(yǎng)基,定容至所需細(xì)胞懸液體積。吸取細(xì)胞懸液加入96 孔板,每孔100 μL,靜置30 min 后移至細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。

    2.2.2 藥液配制

    稱取TFPL 適量,加入DMSO,超聲溶解,制成0.05 g/mL 貯備液。吸取一定量貯備液,加入培養(yǎng)基,配成一定濃度藥物母液,350 W、25 kHz 超聲1 h。取母液,0.22 μm 針孔濾頭過(guò)濾2 次。等度稀釋法配制各濃度藥液。

    吸取一定量DMSO,加入培養(yǎng)基,制成不同濃度(0.1%、0.2%、0.5%)DMSO 對(duì)照藥液,0.22 μm 針孔濾頭過(guò)濾1 次。

    2.2.3 分組與給藥

    分為7 個(gè)藥物濃度組(22.5、45、62.5、90、125、180、250 μg/mL)及空白對(duì)照組、DMSO 對(duì)照組。每組4 個(gè)復(fù)孔,每個(gè)給藥組另設(shè)2 個(gè)調(diào)零孔。種板第3日,吸出96 孔板中細(xì)胞培養(yǎng)液,加入100 μL 相應(yīng)藥液,于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育。

    2.2.4 指標(biāo)檢測(cè)

    給藥24、48、72 h,每孔加入10 μL MTS,孵育2 h,于波長(zhǎng)490 nm 處檢測(cè)各孔光密度(OD),計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活力(OD實(shí)驗(yàn)組÷OD對(duì)照組×100%)。采用Excel2013 計(jì)算IC50。

    2.3 余甘子葉總黃酮成分分析

    采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。

    色譜條件:采用Agilent C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為0.5%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0~10 min,5%~10%B;10~10.01 min,10%~12%B;10.01~20 min,12%~13% B;20~30 min,13%B;30~60 min,13%~21%B),柱溫30 ℃,流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,進(jìn)樣量5 μL。

    質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子模式,毛細(xì)管電壓3 500 V,霧化氣壓力2 bar,干燥氣流速8.0 L/min,干燥氣溫度200 ℃;掃描模式為全掃描和auto ms/ms 掃描,掃描范圍(m/z)50~1 300。

    結(jié)合一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜碎片離子信息,依據(jù)文獻(xiàn)檢索結(jié)果,通過(guò)與Scifinder、Massbank、Chemspider數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行峰匹配檢索,初步鑒定得到TFPL 化合物成分信息。

    2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

    2.4.1 余甘子葉總黃酮成分-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

    通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取TFPL 化學(xué)成分的Smile 數(shù)據(jù),輸入ChemMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lilab-ecust.cn/chemmapper),獲得各成分相關(guān)靶點(diǎn),通過(guò)Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建TFPL 成分-靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

    2.4.2 結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)收集

    以“Colorectal Cancer”為關(guān)鍵詞檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.omim.org/),得到結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn),通過(guò)Cytoscape3.7.1 軟件構(gòu)建結(jié)直腸癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

    2.4.3 共有靶點(diǎn)篩選

    比對(duì)TFPL 相關(guān)靶點(diǎn)與結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn),二者共有靶點(diǎn)即為T(mén)FPL 抗結(jié)直腸癌的潛在靶點(diǎn)。

    2.5 分子對(duì)接

    采用Sybyl X 2.0 軟件評(píng)價(jià)關(guān)鍵靶點(diǎn)受體與化合物配體之間的結(jié)合能力。首先在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到化合物sdf 格式的結(jié)構(gòu),使用Open Babel GUI 軟件將其轉(zhuǎn)化為mol2 格式,導(dǎo)入Sybyl X 2.0 軟件,進(jìn)行能量?jī)?yōu)化并保存為mol2 格式文件。然后通過(guò)Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.rcsb.org/)搜索蛋白晶體結(jié)構(gòu)并下載PDB 格式文件,導(dǎo)入Sybyl X 2.0 軟件,對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行去除水分子、加氫原子等結(jié)構(gòu)優(yōu)化,并找到靶點(diǎn)蛋白的對(duì)接活性位點(diǎn)。最后將化合物配體與蛋白質(zhì)受體相互作用,對(duì)接完成后通過(guò)所得的Total Score 評(píng)價(jià)配體與受體的結(jié)合作用,評(píng)分>6.0 認(rèn)為化合物與靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合能力,以此篩選TFPL 抗結(jié)直腸癌的可能有效成分,使用PyMOL1.5.0.3 軟件繪制對(duì)接結(jié)果示意圖。

    3 結(jié)果

    3.1 余甘子葉總黃酮對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響

    TFPL 對(duì)COLO 320DM、DLD-1 細(xì)胞均具有較好的抑制增殖作用。TFPL 分別作用24、48、72 h,對(duì)COLO 320DM 細(xì)胞的IC50值分別為60.46、36.23、23.87 μg/mL,對(duì)DLD-1 細(xì)胞的IC50值分別為157.28、95.97、49.72 μg/mL。對(duì)正常結(jié)直腸細(xì)胞NCM460 則無(wú)明顯抑制作用,IC50>250 μg/mL。見(jiàn)圖1。

    圖1 TFPL 對(duì)COLO 320DM、DLD-1、NCM460 細(xì)胞增殖的影響

    3.2 余甘子葉總黃酮化學(xué)成分

    初步鑒定得到TFPL 化學(xué)成分12 個(gè)(見(jiàn)表1),DAD 掃描圖和一級(jí)質(zhì)譜總離子流圖見(jiàn)圖2。

    圖2 TFPL 樣品LC-MS/MS 圖

    表1 TFPL 化學(xué)成分LC-MS/MS 鑒定結(jié)果

    3.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

    通過(guò)ChemMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)收集到TFPL 中10 個(gè)成分對(duì)應(yīng)的100 個(gè)靶點(diǎn),Corilagin 和Chebulinic acid無(wú)相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù),結(jié)果見(jiàn)表2。去重后得到51 個(gè)靶點(diǎn),成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3。通過(guò)OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)收集到結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)192 個(gè),見(jiàn)圖4。通過(guò)比對(duì)篩選出TFPL 成分和結(jié)直腸癌疾病共有靶點(diǎn)EGFR,提示TFPL 抗結(jié)直腸癌作用的潛在靶點(diǎn)為EGFR。

    表2 TFPL 成分及相關(guān)靶點(diǎn)

    圖3 TFPL 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

    圖4 結(jié)直腸癌相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

    3.4 分子對(duì)接結(jié)果

    EGFR 與Quercetin、Kaempferol 能夠較好地結(jié)合(見(jiàn)圖5、表3),這2 個(gè)化學(xué)成分可能是TFPL 抗結(jié)直腸癌的潛在活性成分。

    表3 EGFR 與潛在活性成分對(duì)接得分

    圖5 EGFR 與Quercetin、Kaempferol 分子對(duì)接示意圖

    4 討論

    網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立在高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析、計(jì)算機(jī)虛擬計(jì)算及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索基礎(chǔ)上,從藥物-靶點(diǎn)-疾病相互作用的整體性和系統(tǒng)性出發(fā),采用復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)模型表達(dá)和分析研究對(duì)象的藥理學(xué)性質(zhì)。相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和完善是網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得以迅速發(fā)展的基礎(chǔ),一系列用于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析的算法、軟件為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)模型直觀表達(dá)和數(shù)據(jù)分析提供了有力保障。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念與中藥及其有效組分多層次、多靶點(diǎn)的機(jī)制契合度較高,適宜研究中藥多成分-多靶點(diǎn)的作用關(guān)系,有利于揭示中藥及其有效組分的復(fù)雜作用機(jī)制[11]。

    本研究通過(guò)LC-MS/MS 鑒定獲得了TFPL 的12個(gè)化合物。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,篩選得出EGFR 可能是參與TFPL 抗結(jié)直腸癌作用的核心靶點(diǎn)。EGFR是一種跨膜蛋白,其過(guò)表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[12]。通過(guò)阻斷EGFR 在受體胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn),或抑制細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶活性,均可阻斷EGFR信號(hào)傳導(dǎo),從而阻止腫瘤的生長(zhǎng)[13]。分子對(duì)接結(jié)果顯示,TFPL 中的2 個(gè)成分Quercetin、Kaempferol 可與EGFR 很好結(jié)合,進(jìn)一步表明EGFR 可能是TFPL 抗結(jié)直腸癌的作用靶點(diǎn)。Quercetin 作為一種潛在的抗腫瘤藥物已引起廣泛關(guān)注,其機(jī)制包括抗氧化和抑制激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等,其中包括EGFR[14]。Kaempferol 具有廣泛的生物學(xué)特性,與EGFR 具有較強(qiáng)的結(jié)合能力[15],對(duì)包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期的作用[16]。

    綜上所述,TFPL 可能通過(guò)其活性成分Quercetin、Kaempferol 作用靶點(diǎn)EGFR,達(dá)到抗結(jié)直腸癌作用,本研究可為余甘子葉的進(jìn)一步臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究提供參考。

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