葡萄霜霉病菌遺傳多樣性和致病力分化研究

賈 姝，于舒怡，劉長遠，趙奎華，王 平，趙 達

（1.遼寧省蠶業(yè)科學研究所，遼寧鳳城 118100；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學院a.植物保護研究所，b.高粱研究所，沈陽110161；3.沈陽大學，沈陽 110044）

葡萄霜霉病是由單軸霉屬葡萄生單軸霉[Plasmopara viticola(Berk et Curtis)Bert.et Toni]引起的一種世界性病害，我國各葡萄產(chǎn)區(qū)均有分布，該病是葡萄生產(chǎn)中的第一大病害[1]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，同一葡萄品種在不同地區(qū)發(fā)病程度有明顯差異，同一地區(qū)不同葡萄品種的發(fā)病程度也明顯不同。ROUXEL等[2]認為葡萄霜霉病菌存在明顯致病性分化現(xiàn)象，我國學者也對葡萄霜霉病菌致病力分化開展了一系列研究，先后報道了廣西、河北、新疆、吉林、湖南、寧夏等地的葡萄霜霉病菌存在致病力分化現(xiàn)象[3-7]。我國葡萄種植地理分布廣泛，各主要葡萄產(chǎn)地均有不同程度霜霉病發(fā)生，病原菌致病性可能存在較明顯分化，因此明確全國葡萄霜霉病菌致病性的分化可為合理高效防治葡萄霜霉病提供理論依據(jù)。

隨著分子生物學的發(fā)展與研究技術的不斷完善提高，一系列分子標記技術被廣泛應用于病原菌群體遺傳多樣性研究中，但每項技術的可靠性、特異性、多態(tài)性都有所不同。目前用于病原菌多態(tài)性分析的技術主要包括RAPD、RFLP、ISSR、SSR和SRAP（Sequence-Related Arnplified Polymorphism，相關序列擴增多態(tài)性）等，RAPD[8]和SSR[3,9-13]分子標記技術已經(jīng)應用于葡萄霜霉病菌的遺傳差異研究。SRAP技術是2001年由LI等[14]在蕓苔屬植物上開發(fā)出的新型分子標記技術，與其他分子標記技術相比，SRAP的優(yōu)點在于方便快捷，需要樣品量極少且不需要預先知道DNA序列便可快速獲得大量信息，最重要的是重復性與多態(tài)性好，因此非常適合于指紋圖譜的繪制、遺傳連鎖圖譜的構建及遺傳多樣性方面的研究。目前，SRAP標記已經(jīng)廣泛用于植物病原菌的遺傳多樣性和親緣關系分析[16-20]。

本研究采用葉盤接種法和SRAP標記技術對全國19個?。ㄊ校┑钠咸阉共〔≡闹虏×Ψ只瓦z傳多樣性進行分析，通過比較各地區(qū)葡萄霜霉病菌的遺傳多樣性，明確該病菌的遺傳特征，有利于理解病害的發(fā)生、流行和預測，為綜合防治葡萄霜霉病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試葡萄（Vitis viniferaL.）品種為無核白雞心、巨峰和香悅，其中香悅為抗?。≧）品種，巨峰為感?。⊿）品種，無核白雞心為高感（HS）品種。

供試菌株為采自19個?。ㄊ校┑钠咸阉共【?9株，其中遼寧共取樣21株，其中沈陽（SY-1~6）和朝陽（CY-1~6）各6株，遼陽（LY-1，2）、大連（DL-1，2）、葫蘆島（HLD-1，2）和阜新（FX-1，2）各2株，錦州（JZ-1）1株，云南(YN-1~5)、山東(SD-1~5)和福建(FJ-1~5)各5株，陜西(SX-1~4)、甘肅(GS-1~4)、新疆(XJ-1~4)和河北(HB-1~4)各4株，黑龍江(HLJ-1~3)3株，寧夏(NX-1，2)、四川（SC-1，2）、山西（SXX-1，2）、湖南（HN-1，2）各2株，河南（HN-1）、江蘇（JS-1）、安徽（AH-1）、江西（JX-1）、浙江（ZJ-1）和北京（BJ-1）各1株。

供試10條正向引物及10條反向引物（表1）均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1 供試SRAP引物Table 1 SRAP primers used in this study

1.2 方法

1.2.1 葡萄霜霉病菌致病力分化測定孢子囊懸浮液配制：使用無菌毛刷蘸取無菌水刷去病葉背面的雜物和病菌，22℃保濕培養(yǎng)24h。待葉片長出大量新鮮菌體后，將孢子囊刷至無菌水中，配成每毫升含有1×105個孢子囊的孢子囊懸液備用。

接種方法和分級標準：葉盤噴霧法接種[22-23]。采集無核白雞心、巨峰和香悅3個不同抗性水平葡萄品種枝條頂端倒數(shù)第2~4葉位置的健康葉片，用無菌水沖洗凈表面的灰塵，晾干備用，用打孔器制備直徑2cm的葉盤，葉背朝上置于底部墊有潤濕濾紙的直徑9cm塑料培養(yǎng)皿中，將配制好的孢子囊懸液均勻地噴施到葉盤上，封口后置于22℃的恒溫室中保濕培養(yǎng)。10d后調查發(fā)病情況。每10個葉盤為1個處理組，3次重復，無菌水對照。分級標準：0級，無病斑；1級，病斑面積占葉盤面積的5%以下；3級，病斑面積占葉盤面積的6%~25%；5級，病斑面積占葉盤面積的26%~50%；7級，病斑面積占葉盤面積的51%～75%；9級，病斑面積占葉盤面積的76%以上。

病情指數(shù)=[∑（各級葉盤數(shù)×各級代表值）/（調查總葉盤數(shù)×最高一級代表值）]×100。使用SPSS 19.0對病情指數(shù)進行組間聯(lián)接法聚類分析。

1.2.2 葡萄霜霉病菌SRAP標記分析供試菌株的收集：將配制的孢子囊懸浮液接種到健康葡萄葉片上，置于22℃全光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9d。待葉片發(fā)病后，用無菌鑷子夾取菌體于1.5mL離心管中，-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌株DNA提取：采用CTAB法[24]，向離心管中加入少量液氮，用無菌塑料鋤將菌體研磨至粉末狀，加入700 μLCTAB提取液（含2%巰基乙醇），65℃水浴裂解2h。取出冷卻至室溫后，加入700μL氯仿/異戊醇（24∶1），混勻，4℃12000r·min-1離心10min。取上清液450~500μL，加入2倍體積預冷的無水乙醇，輕輕上下顛倒混勻，-40℃靜置15min。4℃12000r·min-1離心10min，棄上清液。加入1mL預冷的75%乙醇，吹洗2次，風干，加入20μL ddH2O，待DNA充分溶解后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

引物篩選：引物Me1~10分別與Em1~10進行組合，最終得到100對引物。使用地理區(qū)域差異較大的SY-4、HB-3、XJ-4、YN-4、FJ-4等5株霜霉病菌對引物進行篩選，確定條帶清晰、特異性豐富、穩(wěn)定性好的引物組合后，對所有供試菌株進行PCR擴增。PCR擴增步驟：2×Taq PCR Green Mix 5μL，正、反向引物各0.5μL，模板DNA0.5μL，用ddH2O定容至10μL。反應程序：95℃預變性5min，95℃變性1min，37℃復性45s，72℃延伸1min，5個循環(huán)；95℃變性1min，57℃復性1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；最后72℃延伸15min，4℃保存。PCR產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

電泳分析檢測：將擴增產(chǎn)物進行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色、洗板。然后進行顯色、拍照，統(tǒng)計條帶。

1.2.3 葡萄霜霉病菌遺傳結構分析每個樣品電泳條帶出現(xiàn)DNA擴增帶的位置有帶記為“1”（強帶和可分辨率、穩(wěn)定性、重復性好的弱帶均賦值為1），無帶記為“0”，收集所有樣品PCR結果，統(tǒng)計數(shù)據(jù)建立二元數(shù)據(jù)矩陣，利用NTSYS-2.1計算材料間遺傳相似性系數(shù)，使用UPGMA（Unweighted pair group method arithmetic averages）法聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同地區(qū)葡萄霜霉病菌致病力的分化

以69株病原菌對無核白雞心、巨峰、香悅的病情指數(shù)為3組數(shù)據(jù)用SPSS進行聚類分析，結果表明，以相似性測度5.0為界限，供試菌株致病力可分為4類群（圖1）：Ⅰ類群（弱致病力）是以SY-5（接種后無核白雞心的病情指數(shù)為17.78，接種后巨峰的病情指數(shù)為9.44，接種后香悅的病情指數(shù)為0.56）為代表的38份弱致病力菌株；Ⅱ類群（中等致病力）是以HLJ-3（接種后無核白雞心的病情指數(shù)為43.33，接種后巨峰的病情指數(shù)為26.67，接種后香悅的病情指數(shù)為7.78）為代表的25份中等致病力菌株；Ⅲ類群（強致病力）是以GS-1（接種后無核白雞心的病情指數(shù)為74.72，接種后巨峰的病情指數(shù)為41.11，接種后香悅的病情指數(shù)為26.89）為代表的5株強致病力菌株；Ⅳ類群（最強致病力）是DL-1（接種后白雞心的病情指數(shù)為88.89，接種后巨峰的病情指數(shù)為63.89，接種后香悅的病情指數(shù)為34.44）菌株。

圖1 不同地區(qū)葡萄霜霉病菌致病力的聚類分析Figure 1 Cluster analysis of pathogenicity of Plasmopara Viticola in different regions

將69株霜霉病菌按照地理區(qū)域進行致病力類群分布可知（圖2），6個區(qū)域的病原菌群體均存在一定程度的致病力分化，東北地區(qū)的病原菌群體致病力可劃分為4個類群，分化程度高；而華北、華中和西南地區(qū)致病力分化程度相對較低；東北、西南和西北地區(qū)的弱致病力菌株占優(yōu)勢，占比在58%以上，而華北、華東和華中地區(qū)中等致病力菌株占優(yōu)勢，華北和華中地區(qū)未發(fā)現(xiàn)強致病力菌株。

圖2 葡萄主要產(chǎn)區(qū)霜霉病菌致病力差異Figure 2 Difference in pathogenicity of Plasmopara Viticola in main grape producing areas

2.2 不同地區(qū)葡萄霜霉病菌的遺傳多樣性

2.2.1 不同引物對霜霉病菌SRAP的擴增結果從100對SRAP引物中篩選出條帶清晰、多樣性豐富的10對引物（Me3/Em6、Me6/Em2、Me6/Em3、Me6/Em4、Me6/Em9、Me7/Em7、Me7/Em10、Me8/Em2、Me8/Em3和Me8/Em5），分別對69株供試菌株進行PCR擴增。結果表明，10對引物共擴增出269條重復性DNA條帶，其中多態(tài)性條帶267條，多態(tài)性比率為99.19%，多態(tài)性豐富。每對引物擴增條帶數(shù)為22~35條，平均每對引物可擴增條帶27條，說明SRAP標記可產(chǎn)生較豐富的條帶，且多態(tài)性條帶檢出率較高。

2.2.2 不同地區(qū)葡萄霜霉病菌的遺傳多樣性分析對69株葡萄霜霉病菌進行聚類分析結果顯示（圖3），不同個體間存在一定的遺傳差異，供試菌株的相似性系數(shù)為0.60~0.84。在相似性系數(shù)0.622時，69個菌株被劃分為5個類群。A類群為優(yōu)勢類群，共包括46個供試菌株，其中，遼寧省菌群為組內(nèi)優(yōu)勢群體，共出現(xiàn)12株；其次為福建，5株；新疆、甘肅、云南等地菌株4株，陜西及山東3株；黑龍江2株，四川2株，山西1株，安徽1株，北京1株，河北1株，湖南省1株，江西省1株、寧夏1株；類群B在相似性系數(shù)0.67處分為3個亞群，第1個亞群包括來自遼寧省遼陽市的LY-2菌株和來自云南省的YN-2菌株；亞群2包括NX-1、JS-1、ZJ-1、SD-4、SD-5、SX-1、HN-1、SXX-2、HNN-2和HB-1菌株，親緣關系較近，聚為一類；第3個亞群包括來自河北省的HB-2和HB-3菌株。類群C包括來自遼寧省的FX-2、SY-4、CY-1、CY-2和CY-3菌株，遺傳差異較小。類群D包括來自遼寧省的DL-2、SY-5和JZ-1菌株親緣關系較近，聚為一類。來自黑龍江省的HLJ-2菌株單獨聚為E類群，與其余供試菌株親緣關系較遠。

圖3 69株葡萄霜霉病菌株的SRAP聚類圖Figure 3 Dendrogram of 69 P.viticola isolates with SRAP

2.3 菌株致病力與SRAP類群相關性分析

由圖4可知，A類群中共46株菌株，其中最強致病力菌株1株，強致病力菌株5株，中等致病力菌株20株，弱致病力菌株20株；B類群共有14株菌株，其中4株中等致病力菌株，10株弱致病力菌株；C類群中1株中等致病力菌株，4株弱致病力菌株；D類群和E類群菌株分別為3株和1株，全部為弱致病力菌株。從SRAP類群看，A類群中的菌株致病力分化程度較高，弱致病力菌株和中等致病力菌株數(shù)目相同；B類群和C類群中菌株致病力分化程度較低，弱致病力菌株占優(yōu)勢；D類群和E類群菌株全部為弱致病力菌株。從SRAP聚類圖和致病力分化聚類圖可以看出，在SRAP標記的聚類群組中，東北地區(qū)菌株的遺傳多樣性較豐富，其致病力分化程度也較高；而其他地區(qū)的遺傳多樣性分化不明顯，其致病力分化程度也相對較低。

圖4 菌株致病力與SRAP類群相關性分析Figure 4 The relevant analysis of the tested isolates disease index and SRAP

3 討論與結論

在生產(chǎn)上，由于缺乏免疫和高抗的葡萄品種，在不合理的栽培模式和氣候條件較適宜的情況下，會發(fā)生葡萄霜霉病的爆發(fā)和流行，因此應加強對葡萄霜霉病菌群體結構及其致病力的相關研究，對弄清該病菌的遺傳進化規(guī)律和有效防控葡萄霜霉病具有深遠的意義。目前葡萄霜霉病菌的致病力測定還沒有一套標準、有效、統(tǒng)一的寄主，因此在不同的研究中所采用的致病力測定寄主有所不同。本研究對采自全國19個省（市）的葡萄霜霉病菌對無核白雞心、巨峰和香悅3個不同抗性水平葡萄品種的致病力進行測定，病情指數(shù)聚類分析結構表明，供試的69株霜霉病菌存在一定程度的致病力分化。這與前人的研究結果一致[3，6，13]，廣西、河北、新疆和寧夏賀蘭山東麓等不同地區(qū)的葡萄霜霉病菌存在致病力分化現(xiàn)象，同一地區(qū)不同寄主來源霜霉病菌群體間及不同菌株間致病力也存在顯著差異。黃曉慶[5]也驗證了來自河北、遼寧、吉林、河北、湖南省的14株霜霉病病菌存在致病力分化現(xiàn)象。

利用分子標記鑒定不同地區(qū)、不同葡萄霜霉病菌株的研究報道越來越多，有些研究認為葡萄霜霉病菌遺傳多樣性與地域和寄主來源無關[5,25]，也有些研究認為葡萄霜霉病菌多樣性與地理分布或栽植品種具有一定的相關性[3-4,7,26]。SRAP標記技術具有快速高效、穩(wěn)定性好、操作簡單等優(yōu)點，可用于地區(qū)間病原真菌多樣性分析及寄主、生態(tài)區(qū)等遺傳背景差異造成的遺傳多樣性分析[27]。本研究利用SRAP技術分析采自全國19個省（市）的69株葡萄霜霉病菌的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)來自遼寧省和黑龍江省的菌株分別分布于不同的類群，具有較豐富的遺傳多樣性，這可能是與遼寧省采樣地點較分散、地域氣候差異較大以及菌株本身的遺傳特質等因素有關。而來自云南省、河北省、陜西省、福建省和山東省的菌株以很高的相似性水平聚在同一組中，表明該地區(qū)葡萄霜霉病菌菌株親緣關系較近，遺傳分化程度較低。遺傳分化和地域來源之間并未發(fā)現(xiàn)具有明顯相關性，這與前人的研究結果一致[4-5]。

研究首次報道了全國19個?。ㄊ校┑钠咸阉共【闹虏⌒院瓦z傳變異情況，發(fā)現(xiàn)其致病性與遺傳變異之間不存在簡單的對應關系。所測定的69株供試菌株中55%屬于弱致病力菌株，36%屬于中等致病力菌株，有關葡萄霜霉病菌致病力分化的致病機制尚需進一步研究。