高粱葉夾角突變體LA1的表型鑒定與遺傳分析

李金紅，董 爽,2，李偉涵，張麗霞，陸曉春

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，沈陽 110161；2.沈陽大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，沈陽 110003；3.沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，沈陽 110034）

高粱（Sorghum bicolor）是我國主要的旱糧和谷類作物之一，其產(chǎn)量關(guān)系到食用[1-2]、釀酒[3]、畜牧飼料[4]和生物乙醇[5]等產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近年來，我國可利用的耕地面積逐年減少，但國家發(fā)展對高粱的需求卻越來越高。因此在有限的耕地面積上，提高單位面積的產(chǎn)量進而增加總產(chǎn)量是一條可持續(xù)發(fā)展的路徑。因此通過培育具有合理株型的新品種來增加種植密度、提高總產(chǎn)量，已經(jīng)成為育種家越來越重要的育種目標(biāo)。葉夾角是理想株型的重要直觀形態(tài)指標(biāo)之一，同時也是考慮優(yōu)良作物品種能否密植的重要農(nóng)藝性狀之一，其是指葉片與主莖的夾角。合理的葉夾角能夠在高密度種植條件下，把所接受的光能合理地分配到群體內(nèi)各葉層，使群體內(nèi)的透光率維持在較高的水平，從而滿足葉片光合作用對光能的需求[6]。

前人開展對葉夾角的形成、發(fā)育及調(diào)控葉夾角發(fā)育的基因克隆的相關(guān)研究工作，WANG等[7]通過對水稻“中花11”倒2葉葉枕的不同發(fā)育時期進行組織切片分析，結(jié)果表明水稻葉夾角的大小是由于近軸端與遠軸端細胞伸長生長的發(fā)育不平衡引起的；MORENO等[8-12]通過對玉米Liguleless 1（lg1）和Liguleless 2（lg2）突變體研究發(fā)現(xiàn)lg1和lg2基因缺失，均會造成葉耳、葉舌缺失，葉枕發(fā)育異常，lg1和lg2分別編碼SPL(SQUAMOSA promoter-binding protein-like)蛋白和堿性亮氨酸拉鏈蛋白（bZIP），lg2表達早于lg1,二者共同調(diào)控幼葉原基葉舌的發(fā)育，進而影響葉夾角的大小。TIAN等[13]克隆玉米UPA1和UPA2基因，并且發(fā)現(xiàn)玉米野生種中的UPA2等位基因與葉片發(fā)育基因DRL1具有較強的結(jié)合能力，DRL1與lg1互作并抑制lg1對ZmRAVL1的激活作用，導(dǎo)致下游基因brd1的表達下調(diào)，進而影響細胞的增殖，最終導(dǎo)致葉夾角減小，株型趨緊湊。水稻dl突變體表現(xiàn)為植株矮小、葉夾角變小，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)dl1編碼細胞色素P450,通過催化6-脫氧香蒲甾醇（6-Deoxo TY）和香蒲甾醇（TY）合成影響葉片的開張角度，DIAO等[14]在谷子中發(fā)現(xiàn)DROOPY LEAF1（DPY1），一種LRR受體樣激酶，對功能喪失突變DPY1研究發(fā)現(xiàn)，該突變體葉片中的木質(zhì)素含量低，該基因特異性在葉片的維管束中表達。該基因通過BR信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控葉片下垂。

本試驗利用EMS誘變高粱BTX623獲得一個葉夾角變小的突變體（LA1），對該突變體從形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)、遺傳特性和基因定位等方面進行研究，最終將該基因定位在標(biāo)記z1s11e1～z1s11e14，研究結(jié)果將為進一步克隆突變基因和解析高粱葉夾角形成的分子機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

LA1突變體是由高粱自交系BTX623經(jīng)0.1%EMS誘變的后代，2015年種植于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科學(xué)研究試驗基地，M1單株單穗留種，2016年將M2株系種植后發(fā)現(xiàn)1株系表現(xiàn)為葉夾角變小和葉片變窄。該株系經(jīng)2017~2019年連續(xù)自交，突變性狀已穩(wěn)定遺傳，命名為LA1。利用突變體LA1分別與野生型BTX623和葉夾角較大的自交系TX430進行雜交，獲得F1后自交得到2個F2分離群體，用于突變性狀的遺傳分析和基因定位。

1.2 方法

1.2.1 農(nóng)藝學(xué)性狀的調(diào)查抽穗開花期隨機選取野生型植株和突變體植株各10株，調(diào)查倒1節(jié)至倒8節(jié)不同節(jié)位的葉片長、葉片寬、葉夾角、葉枕長、葉耳周長、株高、一級枝梗數(shù)、千粒重、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、粒長、粒寬等農(nóng)藝學(xué)性狀。

1.2.2 細胞學(xué)觀察隨機選取孕穗期突變體植株和野生型植株各10株，分別取倒4葉的葉耳，于FAA固定液（50%乙醇∶0.9mol·L-1冰乙酸∶甲醛=90∶5∶5）固定，經(jīng)乙醇脫水、浸蠟、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、脫水和番紅固綠染色后，置于NIKON E6000顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 LA1突變基因定位利用重測序BSA（bulked segregate）方法對突變基因進行初定位。在（LA1×TX430）獲得F2分離群體中分別選取50株野生表型和突變表型的葉片，提取基因組DNA，等量混合構(gòu)建2個混池，對片段化的DNA進行片段純化、末端修復(fù)、3'端加A、連接測序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進行片段大小選擇，進行PCR擴增形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina平臺進行測序，對突變基因進行初定位。根據(jù)初定位結(jié)果，以BTX623為參考基因組，找出差異序列后設(shè)計SSR和InDel標(biāo)記引物，在目標(biāo)區(qū)間繼續(xù)篩選和加密分子標(biāo)記，進行目標(biāo)基因的精細定位。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 10.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體植株LA1和野生型植株的表型分析和細胞學(xué)觀察

在幼苗期突變體植株與野生型植株均未出現(xiàn)明顯差異，隨著植株的生長，在拔節(jié)期突變體開始出現(xiàn)葉片變窄變短，葉耳變小（圖1a和圖1b），葉夾角變小，此時對葉耳進行細胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：與野生型植株相比，突變體葉耳細胞明顯增大，細胞層數(shù)明顯減少（圖1c），因此推測突變體LA1的葉夾角的變化是由于葉耳部位細胞層數(shù)和細胞大小的變化引起的。

在成熟期與野生型相比，LA1突變體各部位葉片呈現(xiàn)較小的葉夾角（圖1d、圖1e和圖1f）,葉耳周長和葉長均小于野生型葉耳周長和葉長（圖1g和圖1h），同時穗長也小于野生型穗長（圖1i）。農(nóng)藝學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，突變體的株高、粒長、粒寬、千粒重、結(jié)實率與野生型均沒有差異，但突變體的每穗粒數(shù)極顯著低于野生型的每穗粒數(shù)，一級枝梗數(shù)顯著低于野生型的一級枝梗數(shù)（表1）。

表1 野生型WT和葉夾角突變體LA1農(nóng)藝學(xué)性狀比較Table 1 Comparison of agronomic trait between wild type WT and mutant LA1

圖1 野生型植株(WT)和突變體植株(LA1)的形態(tài)表現(xiàn)Figure 1 Morphological traits of the wild type(WT)and its mutant(LA1)

2.2 突變體LA1葉夾角及與葉夾角相關(guān)的性狀分析

由圖2可知，抽穗開花期，與野生型植株相比，突變體LA1植株的倒1葉至倒8葉的葉長和葉寬差異均極顯著，且突變體的倒1葉葉長和葉寬分別下降35%和30%。野生型植株和突變體植株的葉夾角均呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，突變體LA1植株各節(jié)位葉夾角均極顯著低于野生型植株相應(yīng)各葉片葉夾角，其中倒3葉下降的更明顯，下降了49%。野生型植株和突變體植株各節(jié)位葉枕長（倒1葉除外）、葉耳周長的變化與葉夾角變化呈相反的趨勢，即葉枕長和葉耳周長表現(xiàn)為先升高后降低。與野生型相比，LA1突變體植株倒4和倒5葉片葉枕長均顯著低于野生型植株相應(yīng)節(jié)位的葉枕長，其他節(jié)位葉枕長差異不顯著；各節(jié)位葉耳周長均極顯著低于野生型植株的各節(jié)位葉耳周長。這說明該突變體植株的葉夾角大小與葉枕、葉耳呈負相關(guān)，且葉夾角大小的性狀主要與葉耳周長有關(guān)。

圖2 抽穗開花期突變體植株和野生型植株田間表型調(diào)查Figure 2 Field phenotype of the mutant and wild type in heading and flower period

2.3 突變體LA1的遺傳模式分析

依據(jù)葉夾角的大小作為突變表型的判斷依據(jù)，將LA1突變體植株與野生型植株正反交得到F1（均為野生型表型），F(xiàn)1自交獲得正反交2個F2分離群體（表2），其中LA1×WT的F2分離群體共1391株，野生表型1024株、突變表型為367株，分離比例經(jīng)卡方檢驗符合3∶1分離；WT×LA1 F2分離群體共1519株，野生表型1127株、突變表型為392株，分離比例同樣符合3∶1，推測該突變性狀受1對隱性核基因控制。

表2 高粱葉夾角在2個F2群體中分離比例的卡方測驗Table 2 Chi-sequare test of segregation ration of leaf angle in two F2 populations

2.4 基因定位

為了定位LA1突變基因，首先在LA1突變體與TX430的F2群體中分別選取突變型植株和野生型植株50株，提取基因組DNA，分別等量混合成正常基因池和突變基因池。結(jié)合親本信息，計算△SNP-index，并對△SNP-index進行擬合，按照擬合后的△SNP-index計算機模擬實驗，取置信度99%的閾值（圖3），初步將LA1突變基因定位1號染色體的7.3Mb范圍內(nèi)(圖4a)。

圖3 SNP-index關(guān)聯(lián)值在染色體上的分布Figure 3 Distribution of SNP-index correlation values on chromosomes

利用高粱基因注釋網(wǎng)站（http://plants.ensembl.org/Sorghum_bicolor/Info/Index）的BTX623的基因組序列比對信息，在初定位區(qū)間新開發(fā)了S1-22、S1-32、S1-40、S1-54、S1-68、S1-97和S1-132標(biāo)記，利用這7個標(biāo)記對F2分離群體的759個突變單株進行基因型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這7個標(biāo)記的交換單株分別為73，57，45，26，14，54和91株，初步將該基因定位在S1-54和S1-68之間，物理距離為960kb（圖4b）。

為了進一步精細定位，在S1-54和S1-68之間設(shè)計了11對SSR和indel標(biāo)記，其中有5對表現(xiàn)為多態(tài)性。利用5個多態(tài)性標(biāo)記對40個隱性單株進行連鎖分析，最終將LA1基因定位在z1s11e1～z1s11e14，根據(jù)已經(jīng)公布的BTX623參考基因組序列，兩者的物理距離為70kb(圖4c)，該定位區(qū)間內(nèi)共有12個注釋基因(圖4d)，目前正在對該區(qū)間內(nèi)的候選基因進行篩選和克隆。

圖4 高粱葉夾角突變基因LA1的精細定位Figure 4 Fine mapping of leaf angle mutation gene LA1 in sorghum

3 討論與結(jié)論

培育合理株型的高粱品種是提高高粱產(chǎn)量的有效策略。高粱的葉不僅包括葉鞘和葉片，還包括葉枕、葉耳和葉舌等附屬器官，葉夾角是高粱株型的主要性狀之一，具有直立葉片、葉夾角小特點的株型不僅影響群體的受光面積，與產(chǎn)量也密切相關(guān)[15]。ZHANG等[16-17]對高產(chǎn)水稻株型的研究發(fā)現(xiàn)：劍葉葉夾角13~17°，倒2葉、倒3葉夾角依次增大，使植株呈塔狀，更大限度地接受光能，提高光能利用率。葉夾角的大小與葉耳、葉枕和葉舌的大小密切相關(guān)。本試驗對高粱葉夾角和葉耳周長研究發(fā)現(xiàn)，無論是野生型還是突變體，不同節(jié)位葉片的葉耳周長呈現(xiàn)先增加后減低的趨勢，這與葉夾角大小的先減少后增加的趨勢正相反，這說明葉夾角的大小與葉耳周長呈負相關(guān)。

葉夾角大小的基因與油菜素內(nèi)酯、生長素和赤霉素等植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物合成密切相關(guān)。BRD2是擬南芥DIM/DWF1的同源基因，在BR生物合成途徑中DIM/DWF1能夠?qū)?4-亞甲基膽固醇催化成菜油甾醇。BRD2基因突變后擬南芥表現(xiàn)為植株矮小、葉片直立等性狀[18]。在IAA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中ARF、Aux/IAA和SCF參與水稻葉片夾角的調(diào)控，如OsIAA1、OsARF1和OsARF19等。F-box蛋白TIR1能夠結(jié)合IAA和Aux/IAA，并且使Aux/IAA發(fā)生泛素化和降解，激活A(yù)RF，進而調(diào)控水稻葉片夾角。OsIAA1編碼Aux/IAA蛋白，過表達植株出現(xiàn)株高降低，葉片夾角增大等特征[19]。

玉米、水稻、小麥和谷子已經(jīng)克隆多個控制葉夾角的基因。玉米中l(wèi)g1和lg2基因缺失，葉耳和葉舌缺失，葉枕發(fā)育異常，lg1和lg2在同一條信號通路上，且lg2表達早于lg1,二者共同調(diào)控葉舌、葉耳和葉枕的發(fā)育，進而調(diào)控葉夾角的大小[20-21]。對水稻直立型葉片和披散型葉片細胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：披散型葉片葉枕的細胞長度變大，葉片彎曲下垂，形成較大的葉夾角，而直立型葉片葉枕處的細胞長度變小，產(chǎn)生較小的葉夾角[22]。本研究對突變體和野生型不同節(jié)位葉耳研究發(fā)現(xiàn),突變體葉耳周長極顯著低于野生型的葉耳周長；細胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與野生型植株葉耳相比，突變體的葉耳細胞變大，細胞層數(shù)變少。這說明突變體葉夾角變小是由于突變體的葉耳周長細胞變大、層數(shù)變少引起的。

遺傳分析和基因定位表明：LA1基因受單隱性核基因控制，該基因定位于第1染色體的z1s11e1和z1s11e14兩個標(biāo)記之間，物理距離為70kb,該定位區(qū)間內(nèi)共有12個注釋基因。對葉夾角突變基因的后續(xù)深入研究，包括候選基因的篩選、突變基因功能驗證、葉夾角形成分子機制的解析，有可能為培育適宜密植機械化的高粱品種提供新材料和新基因。