食用酵素中維生素B1的檢測

◎ 雷海峰

（陜西省渭南市檢驗檢測研究院，陜西 渭南 714000）

酵素，即為酶，起源于20世紀(jì)初的日本，指有活性的生物產(chǎn)生的具有催化生化反應(yīng)作用的活性大分子物質(zhì)，它的主要成分為具有催化生化反應(yīng)作用的蛋白質(zhì)或核酸。后來酵素用品逐漸傳播發(fā)展到歐美、泰國等地，目前市場上銷售的酵素產(chǎn)品主要為水果和蔬菜發(fā)酵制成的可飲用的酵素[1]。為了區(qū)分酵素產(chǎn)品與其他發(fā)酵產(chǎn)品，我國輕工業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《植物酵素》中定義食用植物酵素是以可用于食品加工的植物為主要原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分可供人們食用的酵素產(chǎn)品。根據(jù)酵素產(chǎn)品的使用途徑，還可將其分為食用酵素、環(huán)保酵素、日化酵素和農(nóng)用酵素等。其中食用酵素因富含各種維生素、益生菌、酶類、礦物質(zhì)和一些特定的生物活性功能成分而在食品及其健康領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[2]。

本文中的食用酵素以蔬菜、水果等可食用植物為主要原料，經(jīng)過加入糖類和益生菌，密封培養(yǎng)后，讓原料在有益微生物的作用下進(jìn)行發(fā)酵，過濾后得到可以飲用的植物發(fā)酵液體。我國水果和蔬菜品種多，產(chǎn)量大[3]，近年來，用水果和蔬菜制成的酵素逐漸被人們所接受，水果和蔬菜加糖密封發(fā)酵一段時間后，就可制成一個包含發(fā)酵材料和發(fā)酵產(chǎn)物（如維生素、有益菌和酶等產(chǎn)物）的保健飲用產(chǎn)品。在食用酵素的發(fā)酵制作過程中，維生素B1含量會在發(fā)酵前后產(chǎn)生怎么樣的變化，目前還沒有比較全面的試驗和文獻(xiàn)記載。

維生素B1又稱硫胺素或抗神經(jīng)炎維生素，為白色晶體。廣泛分布于骨骼肌、心肌、肝臟、腎臟和腦組織中，半衰期為9～10 d。維生素B1主要存在于種子的外皮和胚芽中，如米糠和麩皮中含量較豐富，在酵母菌、瘦肉、白菜和芹菜中含量也較豐富。在體內(nèi)，維生素B1以輔酶形式參與糖的分解代謝，有保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，同時還能促進(jìn)腸胃蠕動，增加食欲。由于食用酵素經(jīng)過發(fā)酵，會產(chǎn)生少量的維生素B1，而食用酵素中維生素B1的檢測方法沒有出臺相關(guān)的檢驗檢測標(biāo)準(zhǔn)。因此，本文應(yīng)用高效液相色譜法檢測食用酵素中的維生素B1，該方法相對簡單、經(jīng)濟(jì)實用，經(jīng)過多次試驗，取到了較好的效果[4]。通過對食用酵素發(fā)酵前后維生素B1檢測數(shù)據(jù)的分析，為制定相關(guān)的生產(chǎn)規(guī)范提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20A型島津高效液相色譜儀系統(tǒng)，配熒光檢測器（日本島津）；YXQ-LS-60A型高壓滅菌鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；JJ-2型組織搗碎機（上常州國華電器有限公司）；H1750型離心機，轉(zhuǎn)速＞4 000 r·min-1（湘儀離心機有限公司）；BT224S型分析天平，感量為0.1 mg（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；F1型微量進(jìn)樣器，10 μL（賽默飛）；DGU-20A型流動相真空抽濾脫氣裝置，配0.2 μm及0.45 μm微孔膜（日本島津）。

1.2 檢測試劑及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

正丁醇、鐵氰化鉀、氫氧化鈉、濃鹽酸、三水乙酸鈉、冰乙酸均為分析純，甲醇為色譜純。維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于99%。

鐵氰化鉀溶液（20 g·L-1）。稱取2.0 g鐵氰化鉀，溶于水中并定容至100 mL。

氫氧化鈉溶液（100 g·L-1）。稱取25.0 g氫氧化鈉，溶于水中并定容至250 mL。

堿性鐵氰化鉀溶液。將5 mL鐵氰化鉀溶液與200 mL氫氧化鈉溶液混合。

鹽酸（0.1 moL·L-1）。吸取9 mL濃鹽酸，溶于水中并定容至100 mL。

鹽酸（0.01 moL·L-1）。吸取0.1 moL·L-1濃鹽酸50 mL，溶于水中并定容至500 mL。

乙酸鈉溶液（0.05 moL·L-1）。稱取6.80 g三水乙酸鈉，加入900 mL水溶解，并用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至4.0～5.0，定容至1 000 mL。

維生素B1標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500 μg·mL-1）。稱取相當(dāng)于硫胺素50 mg的維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品，用0.01 moL·L-1鹽酸溶解并定容于100 mL。置于0～4℃冰箱中。

維生素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液（10 μg·mL-1）。準(zhǔn)確吸取2.0 mL維生素B1標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水稀釋并定容于100 mL[5]。

1.3 試驗原理

食用酵素在稀鹽酸環(huán)境中恒溫水解、酶解，樣液用堿性鐵氰化鉀衍生，正丁醇萃取后，經(jīng)C18反相色譜柱分離，按順序流出色譜柱，進(jìn)入信號檢測器，用熒光檢測器檢測，在計算機上記錄并顯示出各個組分的譜峰數(shù)據(jù)，根據(jù)保留時間，用外標(biāo)法定量計算維生素B1含量[5]。

1.4 食用酵素的制作

以水果和蔬菜為主原料，加入白砂糖和發(fā)酵菌株，密封、保存，讓其充分發(fā)酵，最終得到可以飲用的發(fā)酵液體。

1.4.1 發(fā)酵器材的準(zhǔn)備

取干凈的發(fā)酵瓶，清洗干凈，用滅菌紙包好瓶口，經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌備用；用紫外滅菌法滅菌發(fā)酵瓶蓋30 min以上備用；用滅菌紙包好切水果的刀具，經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌備用；洗凈用于切水果和蔬菜的切板，晾干備用，以上所有用具要求確保無油，無易污染水果和蔬菜的雜菌。

1.4.2 發(fā)酵蔬菜和水果的準(zhǔn)備

選擇含糖量較高的水果，水果中的營養(yǎng)成分要求容易被微生物所發(fā)酵利用，清洗水果上的污漬和泥土，干燥去除殘留在水果表面的水漬，用刀去除所有水果核，將水果切成小片；選擇維生素含量較豐富的蔬菜，蔬菜中的營養(yǎng)成分要求容易被乳酸菌所發(fā)酵利用，清洗殘留在蔬菜上的污漬和泥土，干燥去除殘留在蔬菜表面的水漬，切成大小較均勻的條狀。發(fā)酵輔料白砂糖要求干凈衛(wèi)生，無雜菌污染。

1.4.3 酵母菌發(fā)酵過程

取出滅菌后發(fā)酵瓶，往發(fā)酵瓶中投入水果總量的1/3，并加入少量的白砂糖和酵母菌，密封瓶蓋并能保證可透出發(fā)酵產(chǎn)生的氣體，在28 ℃左右恒溫培養(yǎng)發(fā)酵約10 d左右。觀察發(fā)酵情況，充分發(fā)酵后，用紗布過濾提取發(fā)酵濾液。

1.4.4 乳酸菌發(fā)酵過程

取出滅菌后發(fā)酵瓶，往發(fā)酵瓶中投入水果總量的1/3和少量蔬菜，并加入少量的白砂糖和乳酸菌，密封瓶蓋并能保證可透出發(fā)酵產(chǎn)生的氣體，在36 ℃左右恒溫培養(yǎng)發(fā)酵約10 d左右。觀察發(fā)酵情況，充分發(fā)酵后，用紗布過濾提取發(fā)酵濾液。

1.4.5 醋酸菌發(fā)酵過程

取出滅菌后發(fā)酵瓶，往發(fā)酵瓶中投入水果總量的1/3，并加入少量的白砂糖和醋酸菌，在36 ℃左右恒溫培養(yǎng)發(fā)酵約10 d左右，密封瓶蓋并能保證可透出發(fā)酵產(chǎn)生的氣體。觀察發(fā)酵情況，充分發(fā)酵后，用紗布過濾提取發(fā)酵濾液。

將所有發(fā)酵過濾液混合后制成可飲用的食用酵素。

1.5 試樣的前處理

取5.0 g食用酵素樣品，置于100 mL三角瓶中，加入60 mL 0.01 moL·L-1鹽酸，充分搖勻，用棉花塞和牛皮紙封口，放入高壓滅菌鍋中，在121 ℃下保持30 min，待冷卻至40 ℃以下后取出，輕搖數(shù)次；用2.0 moL·L-1乙酸鈉溶液調(diào)pH至4.0左右，加入2.0 mL混合酶解液，搖勻后置于37 ℃的培養(yǎng)箱中過夜；將酶解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，濾紙過濾，取濾液備用。

取上述10 mL濾液于25 mL具塞比色管中做衍生化，加入5 mL堿性鐵氰化鉀，充分搖勻后，加10.0 mL正丁醇，強烈振蕩后靜置約10 min，充分分層，吸取正丁醇萃取液，于4 000～6 000 r·min-1離心5 min，取上清液經(jīng)有機微孔膜過濾，供進(jìn)色譜儀用。另取10 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，與試樣同時做衍生化。以上步驟需在避免強光照射下進(jìn)行。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取100 mL容量瓶或比色管6支，依次加入維生素B1標(biāo)準(zhǔn)使用液0 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL（分別相當(dāng)于維生素B1濃度0 μg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1、0.20 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1、1.00 mg·mL-1），上述各溶液用0.45 μm微孔膜過濾，收集過濾液，作為進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)溶液。用測定的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為r=0.999 9，回歸方程為Y=908 286.5X-10.1。

1.7 樣品測定

液相色譜儀檢測條件：色譜柱：C18反相色譜柱（粒徑5 μm，250 mm×4.6 mm）；

流 動 相：0.05 moL·L-1乙 酸 鈉 溶 液∶甲 醇（65∶35）；流速：1.00 mL·min-1；檢測波長：激發(fā)波長為375 nm，發(fā)射波長為435 nm。

用天平稱取5 g（精確至0.001 g）酵素樣品，放于250 mL具塞三角瓶中，加12.5 mL 50 g·L-1硼砂溶液后，再加入70 ℃左右的溫水約150 mL，搖勻，在沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫。把上述提取液定量轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，加入5 mL 106 g·L-1亞鐵氰化鉀溶液，混勻，再加入5 mL 220 g·L-1乙酸鋅溶液，以沉淀其中的蛋白質(zhì)。加水至刻度，搖勻，放置30 min，除去多余脂肪，上清液用濾紙過濾，棄去初濾液30 mL，濾液備用。

將標(biāo)準(zhǔn)溶液和制備好的試樣分別進(jìn)樣10 μL。根據(jù)標(biāo)樣的保留時間定性樣品中維生素B1的色譜峰，根據(jù)樣品的峰面積，以外標(biāo)法計算維生素B1的含量。

2 結(jié)果和分析

2.1 準(zhǔn)確度試驗

取食用酵素樣品加入定量的維生素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.7方法進(jìn)行測定，其結(jié)果見表1。

表1 食用酵素維生素B1含量準(zhǔn)確度試驗結(jié)果表

2.2 發(fā)酵前后的比較試驗

取食用酵素發(fā)酵前混合的原材料和發(fā)酵后的酵素原液，按照1.7方法進(jìn)行測定，其結(jié)果見表2。

表2 食用酵素發(fā)酵前后維生素B1含量比較試驗結(jié)果表

3 結(jié)論

本文利用高效液相色譜法檢測食用酵素中維生素B1的含量，其前處理相對比較簡單，經(jīng)濟(jì)實用，維生素B1的檢測結(jié)果令人滿意。

對照食用酵素發(fā)酵前混合的原材料和發(fā)酵后的酵素原液，文中的食用酵素的制作方法能有效提高食用酵素發(fā)酵液維生素B1的含量，該方法使用酵母菌、乳酸菌、醋酸菌進(jìn)行發(fā)酵，雖然發(fā)酵菌種使用不夠全面，但經(jīng)過此方法制成的酵素，可以顯著提高食用酵素維生素B1的含量。