轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用分析

◎ 丁 琪，馮志華，孫 濤

（江蘇海洋大學(xué)，江蘇 連云港 222005）

1 轉(zhuǎn)基因食品概念和分類(lèi)

1.1 轉(zhuǎn)基因食品概念

轉(zhuǎn)基因食品是現(xiàn)代生物技術(shù)的產(chǎn)物[1]。利用現(xiàn)代分子生物技術(shù)，將某些生物的一種或者幾種外源性基因轉(zhuǎn)移到其他物種中，改造它們的遺傳性狀，使其有效地表達(dá)出相應(yīng)的滿足人類(lèi)營(yíng)養(yǎng)、消費(fèi)能力等需求的性能。目前，根據(jù)轉(zhuǎn)基因食品來(lái)源的不同可分為植物性轉(zhuǎn)基因食品，動(dòng)物性轉(zhuǎn)基因食品和微生物性轉(zhuǎn)基因食品3大類(lèi)。其中，由于動(dòng)物性轉(zhuǎn)基因食品和微生物性轉(zhuǎn)基因食品目前存在較大的安全隱患，未被廣泛應(yīng)用，所以生活中常見(jiàn)植物性轉(zhuǎn)基因食品。

1.2 轉(zhuǎn)基因食品分類(lèi)

轉(zhuǎn)基因食品的分類(lèi)目前還沒(méi)有具體明確的劃分，只能根據(jù)以往研究按照不同標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行不同分類(lèi)。轉(zhuǎn)基因食品分類(lèi)見(jiàn)表1。

表1 轉(zhuǎn)基因食品分類(lèi)表

2 轉(zhuǎn)基因食品的發(fā)展現(xiàn)狀及安全性

2.1 轉(zhuǎn)基因食品的發(fā)展現(xiàn)狀

近幾年，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不斷的研究實(shí)踐中逐步走向成熟，尤其是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮了巨大作用。當(dāng)下，世界大多數(shù)國(guó)家仍將重點(diǎn)聚焦轉(zhuǎn)基因生物工程技術(shù)，例如針對(duì)食品供求這一重大問(wèn)題，各國(guó)投入大量財(cái)力、物力和人力來(lái)扶植這項(xiàng)生物技術(shù)的發(fā)展，由于各國(guó)之間科技水平層次不齊，使得各國(guó)轉(zhuǎn)基因食品研究成果存在較大差異[4]。由于城市化的加速發(fā)展使土地種植面積逐年減少，在此環(huán)境下，我國(guó)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平要求有所提高。因此，我國(guó)非常重視轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。自20世紀(jì)80年代初，我國(guó)已經(jīng)將現(xiàn)代生物技術(shù)納入國(guó)家科技發(fā)展計(jì)劃，迄今為止，轉(zhuǎn)基因食品在我國(guó)農(nóng)作物生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用且作物相繼取得豐碩成果。目前甜椒、西紅柿、土豆、玉米和水稻是被我國(guó)農(nóng)業(yè)部已經(jīng)批準(zhǔn)種植的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物[5]。今后可能陸續(xù)批準(zhǔn)的農(nóng)作物有小麥、甘薯、谷子、花生等。這些轉(zhuǎn)基因食品不僅擁有被人類(lèi)所需求的優(yōu)良性狀，而且還能夠帶來(lái)顯著的經(jīng)濟(jì)效益[5]。此外，我國(guó)還有15種農(nóng)作物的近百個(gè)品種正處于試驗(yàn)階段。我國(guó)近幾年在轉(zhuǎn)基因食品研發(fā)方面取得顯著成效，但相較于美國(guó)、加拿大等發(fā)達(dá)國(guó)家仍有差距。

2.2 轉(zhuǎn)基因食品的安全性

轉(zhuǎn)基因食品是現(xiàn)代生產(chǎn)技術(shù)產(chǎn)品，它在滿足人們食用、利益需求和提高幸福感的同時(shí)，也由于其技術(shù)新、不成熟、易在食物基因改造過(guò)程中發(fā)生意外突變等客觀原因給人們帶來(lái)安全隱患和擔(dān)憂。

自20世紀(jì)八九十年代起，國(guó)外先后有生物學(xué)專(zhuān)家采用動(dòng)物食用轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品試驗(yàn)判斷轉(zhuǎn)基因食品的安全性。例如，最早質(zhì)疑轉(zhuǎn)基因食品安全性的是英國(guó)阿伯丁羅特研究所普庇泰教授在幼鼠食用轉(zhuǎn)基因土豆的試驗(yàn)后提出的，研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因土豆會(huì)使幼鼠內(nèi)臟和免疫系統(tǒng)受損，該新聞報(bào)道后，引起全世界的廣泛關(guān)注[6]。自此以后，其他各國(guó)有針對(duì)性地對(duì)當(dāng)?shù)匮邪l(fā)的轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行活體試驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因食品的確存在食用安全隱患和不確定性因素。但也有研究機(jī)構(gòu)指出，某些昆蟲(chóng)在自然生態(tài)不斷循環(huán)進(jìn)化下已具有能抵抗轉(zhuǎn)基因毒素的能力，所以食用轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物后不會(huì)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

當(dāng)前，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因生物和轉(zhuǎn)基因食品的安全性的顧慮并未消除，造成該顧慮的原因主要是以下3個(gè)方面。①轉(zhuǎn)基因食品對(duì)人體健康造成安全威脅。②轉(zhuǎn)基因食品中改造出的新基因性狀對(duì)其他食物鏈造成不良影響。③轉(zhuǎn)基因食品是人們強(qiáng)硬改造出的食品，其對(duì)自然生物多樣性造成不良影響[7]。所以，人們應(yīng)理性看待基因工程技術(shù)，不能因眼前商業(yè)化利益和短期較好的食用體驗(yàn)而模糊轉(zhuǎn)基因食品的安全性問(wèn)題，應(yīng)提高現(xiàn)代轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)技術(shù)以保障食品安全。

3 轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)技術(shù)

隨著近幾年轉(zhuǎn)基因食品的蓬勃發(fā)展，轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)也被廣泛應(yīng)用和發(fā)展。目前，國(guó)際上通常采用兩類(lèi)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的安全性進(jìn)行檢測(cè)，即蛋白質(zhì)水平的檢測(cè)和核酸水平的檢測(cè)。通過(guò)比較和分析現(xiàn)有的檢測(cè)方法，可以找出各檢測(cè)方法之間的特點(diǎn)和有待改善之處。因此，根據(jù)被檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因食品的特性，選擇合適的檢測(cè)方法，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、高效，對(duì)檢測(cè)工作具有積極意義。

3.1 蛋白質(zhì)水平檢測(cè)

通過(guò)插入外源基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，或者是檢測(cè)插入外源基因?qū)d體基因表達(dá)的影響。蛋白質(zhì)檢測(cè)水平法比較見(jiàn)表2。

表2 常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)方法——蛋白質(zhì)檢測(cè)水平法比較表

3.2 核酸水平檢測(cè)

對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行核酸提取，釋放核酸，再進(jìn)行內(nèi)源性基因的檢測(cè)，篩選基因檢測(cè)和品系鑒定檢測(cè)[10]。核酸水平法比較見(jiàn)表3。

表3 常見(jiàn)轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)方法——核酸水平法比較表

4 轉(zhuǎn)基因食品安全檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用——以常用的PCR、基因芯片技術(shù)為例

定性PCR技術(shù)是目前篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因食品中一種通用且簡(jiǎn)便的方法。李建勇等[12]采用定性PCR技術(shù)分別對(duì)山東菜區(qū)普通市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的22種番茄樣品、1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照（由山東農(nóng)科院提供）、1個(gè)陰性對(duì)照（由志彪教授贈(zèng)予）進(jìn)行編號(hào)，并對(duì)檢測(cè)對(duì)象中外源基因35S啟動(dòng)子、NPTⅡ基因和NOS終止子分別檢測(cè)，試驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)采取設(shè)計(jì)兩對(duì)引物的方法，篩選出優(yōu)而適的引物，比較被檢測(cè)對(duì)象擴(kuò)增結(jié)果的優(yōu)劣。通過(guò)3次檢測(cè)試驗(yàn)，初步證明陽(yáng)性對(duì)照（由山東農(nóng)科院提供）檢測(cè)對(duì)象中含有可疑外源基因。但同時(shí)也出現(xiàn)另一問(wèn)題，雖然定性PCR技術(shù)具有省時(shí)、省成本、便捷的特點(diǎn)，但在NPTⅡ基因檢測(cè)時(shí),采用這種方法會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果,這需要李建勇等采用其他檢測(cè)方法對(duì)其結(jié)果進(jìn)行再次證實(shí)補(bǔ)充。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在所有定量PCR技術(shù)中新興的檢測(cè)方法，其在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，通過(guò)添加熒光染料或者使用熒光探針來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增反應(yīng)并制定標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量分析的技術(shù)。陳穎等[13]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)我國(guó)市場(chǎng)流通的兩種轉(zhuǎn)基因玉米Mon 810（YieldGard）和Event 176（Maximizer）3種濃度共6份樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施定量標(biāo)識(shí)提供了理論、技術(shù)支撐。在試驗(yàn)中，陳穎等非常注重對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米中DNA的提取和所提取的DNA是否適合于進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以避免在試驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性檢測(cè)結(jié)果。此外，為了保障轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)結(jié)果的有效性，陳穎等通過(guò)查閱研究國(guó)內(nèi)外發(fā)表的論文，大量商品化轉(zhuǎn)基因構(gòu)建文獻(xiàn)等，最終選用最佳引物/探針。本次試驗(yàn)中，陳穎對(duì)這兩種轉(zhuǎn)基因玉米的3個(gè)濃度的6份樣品分別做了10次試驗(yàn)，并且對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了t檢驗(yàn)（顯著性水平α=0.105）統(tǒng)計(jì)分析,以保證數(shù)據(jù)科學(xué)合理、檢測(cè)方法可信。

多重PCR技術(shù)方法是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，實(shí)現(xiàn)在單個(gè)反應(yīng)管中一次性檢測(cè)多個(gè)靶標(biāo)的方法，與單一PCR反應(yīng)相比，其更加便捷有效。董立明等[14]把大豆內(nèi)源基因Lectin和國(guó)內(nèi)種植面積最大的5種轉(zhuǎn)基因大豆品系305243、MOM89788、CV127、GTS40-3-2和356043作為檢測(cè)對(duì)象，建立六重PCR技術(shù)。為確定該技術(shù)方法的有效可靠，董立明等主要圍繞方法的靈敏度、適用性和特異性展開(kāi)研究。其中在測(cè)試特異性環(huán)節(jié)中，通過(guò)采用六重PCR技術(shù)做空白對(duì)照試驗(yàn)和作用到轉(zhuǎn)基因玉米混合物、轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1、轉(zhuǎn)基因棉花MON531、轉(zhuǎn)基因油菜GT73中，測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)這4種轉(zhuǎn)基因作物樣品中沒(méi)有擴(kuò)增到6種靶標(biāo)成分，從而確定六重PCR技術(shù)的特異性。

數(shù)字PCR技術(shù)是近年來(lái)在實(shí)時(shí)熒光PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的微量DNA分子定量檢測(cè)新技術(shù)，該方法相較于其他檢測(cè)技術(shù)具有較好的測(cè)量獨(dú)立性，特異性更強(qiáng)，靈敏度更高，結(jié)果更精確和可靠。任怡菲等[15]把未在我國(guó)批準(zhǔn)種植食用的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系作為研究對(duì)象，建立轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系特異性微滴式數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法。在試驗(yàn)中，通過(guò)制備不同百分比含量的轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系成分混合樣品以驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系特異性微滴數(shù)字PCR定量法的檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。同時(shí)，由于數(shù)字PCR擴(kuò)增對(duì)引物和探針有著較高的特殊要求，需試驗(yàn)人員在充分查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料的前提下，最終選擇采用Primer Express2.0軟件設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因水稻LL62品系以及水稻內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因SPS的特異性引物和探針序列。此外，任怡菲等重點(diǎn)圍繞建立的方法的特異性、操作可重復(fù)性，定量的精確性、重復(fù)性和比較引針探針檢測(cè)體系展開(kāi)相應(yīng)研究。研究結(jié)果表明，數(shù)字PCR檢測(cè)技術(shù)因表現(xiàn)出定量結(jié)果準(zhǔn)確、方法可重復(fù)，節(jié)約成本等的優(yōu)點(diǎn)可用于研究我國(guó)口岸農(nóng)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因水稻LL62成分的定性定量分析，也為后人在該領(lǐng)域的研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

基因芯片法是通過(guò)與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定的方法，彌補(bǔ)了PCR技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品高通量檢測(cè)的缺陷。黃文勝等[16]在設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因油菜基因芯片檢測(cè)方法時(shí)，結(jié)合多重PCR檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)一次可檢測(cè)多種基因的可能性。在方法設(shè)計(jì)中，黃文勝等把國(guó)產(chǎn)油菜籽、進(jìn)口油菜籽和純轉(zhuǎn)基因油菜作為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)3類(lèi)初樣品進(jìn)行高質(zhì)量DNA提取，設(shè)計(jì)10對(duì)引物、探針，制備寡核甘酸芯片。整個(gè)試驗(yàn)中最重要的環(huán)節(jié)是采用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增不同樣品的DNA和對(duì)其熒光標(biāo)記后，將PCR產(chǎn)物與芯片雜交，篩選出油菜樣品中含有的外源基因（轉(zhuǎn)基因成分），同時(shí)也突出此檢測(cè)方法的特異性。此外，黃文勝等對(duì)此檢測(cè)方法的靈敏度和可重復(fù)性均作了驗(yàn)證。張光遠(yuǎn)[17]也利用復(fù)合PCR-基因芯片聯(lián)用技術(shù)對(duì)商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162、BVLA430101、MON88017，轉(zhuǎn)基因大豆MON89788、GTS40-3-2，轉(zhuǎn)基因油菜MS1、RF1建立一個(gè)三重PCR檢測(cè)體系和兩個(gè)四重PCR檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。

在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)中，PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，其包含的檢測(cè)方法種類(lèi)較多。本文主要對(duì)常用的PCR技術(shù)和基因芯片技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行典型舉例（國(guó)內(nèi)），研究了不同檢測(cè)方法在不同農(nóng)作物中的具體建立和應(yīng)用，方便使該知識(shí)的初學(xué)者對(duì)所研究的檢測(cè)技術(shù)有一定的理解和認(rèn)知，輔助其建立轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方法。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展和人們對(duì)物質(zhì)生活水平要求的提高，轉(zhuǎn)基因食品行業(yè)發(fā)展前景愈發(fā)光明，同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的研究也顯得尤為重要。目前，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，筆者對(duì)不同的轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)方法原理及應(yīng)用做了較為詳細(xì)的闡述和比較，了解了不同轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)之間的優(yōu)缺點(diǎn)，為相關(guān)人士在研究不同的食物種類(lèi)成分、食品轉(zhuǎn)基因片段或者食品的生產(chǎn)加工工藝時(shí)提供高效、科學(xué)、精確的檢測(cè)方法和技術(shù)手段。然而，在轉(zhuǎn)基因食品成分檢測(cè)技術(shù)日趨成熟的同時(shí)，轉(zhuǎn)基因食品成分檢測(cè)技術(shù)也遇到了難題，如研發(fā)轉(zhuǎn)基因食品的生物技術(shù)多樣化，轉(zhuǎn)基因食品的基因編輯信息不透明，導(dǎo)致在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品成分時(shí)，對(duì)未知的擴(kuò)增序列把握性不強(qiáng)，增加了檢測(cè)難度。此外，由于現(xiàn)代食品加工技術(shù)愈發(fā)精細(xì)，可能會(huì)出現(xiàn)食品原料中的DNA被破壞的情況，這將導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中高質(zhì)量、高濃度的DNA提取率減小，給后期的基因分析帶來(lái)困難。

綜上所述，不同種類(lèi)的轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮了不同的價(jià)值，在今后對(duì)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)研究時(shí)，應(yīng)繼續(xù)堅(jiān)持“高靈敏性、高特異性、高通量化、自動(dòng)化、低成本、高準(zhǔn)確性、操作便捷”的標(biāo)準(zhǔn)，只有實(shí)現(xiàn)該標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)技術(shù)才能給轉(zhuǎn)基因食品安全提供強(qiáng)有力的保障，人們才會(huì)更加踏實(shí)地接受轉(zhuǎn)基因食品。