不同輪作方式對馬鈴薯根際土壤真菌群落結構的影響

韓芳 ，包媛媛，劉項宇，張新永*，韋燈會，張浩然，田清龍

1. 云南農業(yè)大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2. 昭通市農業(yè)科學院，云南 昭通 657000；3. 云南農業(yè)大學食品科學技術學院，云南 昆明 650201

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）為茄科茄屬一年生草本植物，具有廣泛的適應性，在海拔4000 m以下，從赤道到南北緯40° 的地區(qū)均可種植（劉洋等，2014）?；谥袊R鈴薯總產高、單產低的現狀，在推進馬鈴薯主糧化的戰(zhàn)略背景下（羅善軍等，2018），其種植面積不斷擴大。但隨之而出現了連作導致土壤養(yǎng)分失衡、環(huán)境惡化、病害增多等問題。昭通市常年種植馬鈴薯面積在20×104hm2左右，是中國馬鈴薯的主產區(qū)之一。蕎麥（Fagopyrum esculentum）面積3.5×104hm2左右，赤小豆（Vigna umbellata）也是該市的重要作物，在當地種植面積較大。隨著馬鈴薯栽培面積不斷增加，部分地區(qū)連作已不可避免，這3種作物之間的輪作在生產上也時有發(fā)生。輪作可改善作物殘茬、控制病害及土壤侵蝕，使產量及經濟效益得到提高。作物連作所造成的負面影響在很大程度上與土壤微生物環(huán)境有關（Roy et al.，1994），但可通過選擇種植制度和輪作方式來調控土壤微生物，進而改善土壤肥力（Bucher et al.，2005；Li et al.，2015）。土壤微生物是影響作物生長環(huán)境的主要原因之一，對植物的生長發(fā)育起著非常重要的作用。微生物不僅能固定和分解有機質，使其成為土壤的有效養(yǎng)分，參與養(yǎng)分循環(huán)和植被利用過程，而且對土壤中某些無機物起到固定和維持作用，是土壤肥力變化的主要指標之一（何志剛等，2015）。真菌在土壤中的數量僅次于細菌和放線菌，參與土壤有機質的合成與分解，影響著土壤的一系列生化過程（Yanardag et al.，2017），作為指示土壤質量變化的因子，可作為評價土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能與結構的指標（王娜等，2019）。Bunemann et al.（2014）研究發(fā)現，輪作效應對土壤微生物區(qū)系的影響遠大于磷肥，豬屎豆-玉米輪作顯著提高了真菌和細菌的豐度。輪作對土壤細菌和酶沒有明顯的影響，主要是對真菌數量有影響（Zhang et al.，2014）；真菌群落活動影響了植物的生長（李發(fā)虎等，2017）；在植物病蟲害防治過程中發(fā)揮作用（Vanelsas et al.，2002）；根際土壤真菌多樣性在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)平衡和土壤質量方面具有重要作用（Knelman et al.，2014）。根際土壤直接受植物根系及其分泌物的影響，是土壤微生物與植物相互作用的重要場所，植物通過根系活動影響根際土壤的養(yǎng)分含量和理化性狀，并改變根際微生物群落組成和多樣性。同時，根際土壤微生物多樣性和優(yōu)勢菌屬的變化，也在一定程度上反映出土壤肥力和質量的變化趨勢（Lynch，1990）。目前，對馬鈴薯與蕎麥、赤小豆輪作根際土壤真菌群落變化的研究鮮有報道。本試驗采用馬鈴薯、蕎麥和赤小豆進行不同順序的輪作，揭示不同種植順序對作物根際土壤真菌群落數量變化的規(guī)律，為耕地的保護和馬鈴薯產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

馬鈴薯品種選用“云薯505”，苦蕎麥和赤小豆選用當地品種“線蕎”和“紅腰豆”。

1.2 試驗地概況

試驗地點為云南省昭通市靖安鎮(zhèn)松杉村9社，海拔 2202 m，103°42′7″E，27°35′29″N。土壤類型為黃壤土類，典型黃壤土屬，山地黃壤。土壤基本理化指標如表1所示。

表1 試驗地土壤基本理化指標Table 1 Basic physical and chemical indexes of soil in the experimental site

1.3 試驗設計

前茬作物為玉米。對土表厚度20 cm的土層進行充分混合均勻，采用隨機區(qū)組設計，設置 9個小區(qū)即9個處理，每處理3個重復。小區(qū)寬5 m，長12 m，隨機安排種植馬鈴薯、蕎麥和赤小豆。2017年和2018年的3月中旬播種馬鈴薯，每0.067 hm2施用 50 kg 三元復合肥（mN?mP?mK=15?15?15），普鈣40 kg，硫酸鉀10 kg，一次性作底肥施用，雙行壟作并覆蓋地膜；4月中旬播種蕎麥和赤小豆，施肥量均與馬鈴薯一致，3種作物均在播種當年的9月中旬收獲并對根際土壤取樣。馬鈴薯種植規(guī)格：每個小區(qū)共種10行，采用大壟雙行種植，大壟距1 m，小行距0.4 m，株距0.4 m。蕎麥：采用條播撒種，每個小區(qū)共種20行，行距0.25 m。赤小豆：每個小區(qū)共種10行，行距0.5 m，株距0.4 m。試驗進行2年，每年一季作物，每小區(qū)種植作物情況如表2所示。

表2 作物輪作種植情況Table 2 The planting situation of crop rotation

取樣：2018年9月中旬收獲，同時進行作物根際土壤的取樣，每小區(qū)采用“S”形 5點法采集 5—20 cm耕層的根際土壤，將取樣點的作物根系從土中取出后收集附著在根系上的土壤，裝入密封袋置于冰盒內，帶回實驗室，保存在?80 ℃冰箱中用于真菌群落的測定。真菌群落測定采用真菌 ITS1區(qū)相對定量測序的方法進行，引物序列如下：Primer F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；Primer R：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。

1.4 數據處理

真菌群落相對定量測定數據使用USEARCH軟件進行OUT聚類分析，使用mothur軟件進行OTU分類學分析和物種注釋統(tǒng)計，使用R繪圖進行物種總豐度柱狀圖、群落結構柱狀圖、樣本聚類樹柱狀圖、Heatmap熱圖和PCA分析。數據差異顯著性使用SPSS 25.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同輪作方式真菌群落多樣性分析

土壤樣品測序結果如表3，在97%相似水平上所建立的微生物文庫，樣本覆蓋率在99%以上，說明試驗所建立的文庫能夠真實地反映土壤樣本微生物群落的 OTU組成，所反映的各樣本的微生物物種信息的置信度高，具有真實性和研究意義。

表3 不同輪作方式根際土壤真菌群落的多樣性Table 3 Diversity of fungal communities in rhizosphere soil under different rotation patterns

不同輪作方式的OUT數量、Chao1和ACE指數、Shannon和 Simpson指數皆有所差異，Chao1指數最高的是處理 F、H、A，其次為 C、D、G，最小為B、I、E。ACE指數最高的是處理F、H、A，其次為C、D、B，最小的是G、I、E。結合Chao1和ACE指數，得出處理F、H、A的真菌豐富度最高。Shannon指數最大的是處理F、A、H，其次為C、B、D，最小的是G、I、E。Simpson指數最小的是處理A、F、H，其次為B、D、C，最大的是G、I、E。結合Shannon和Simpson指數可看出，不同輪作方式，處理F、A、H的真菌多樣性指數較高，而處理E和I較低。即：9個處理中，A（赤小豆連作）、F（蕎麥-赤小豆）和 H（馬鈴薯-赤小豆）的真菌豐度和多樣性較豐富，而處理E（馬鈴薯-蕎麥）和I（蕎麥-馬鈴薯）的則較低。

2.2 不同輪作方式真菌群落組成結構分析

實驗結果如圖1所示。共檢測出10個真菌門類，分別是Ascomycota（子囊菌門）、Basidiomycota（擔子菌門）、Mortierellomycota（被孢霉門）、Glomeromycota（球囊菌門）、Chytridiomycota（壺菌門）、Kickxellomycota（梳霉門）、Cercozoa（曳尾蟲門）、Rozellomycota（羅茲菌門）、Olpidiomycota（油壺菌門）、Calcarisporiellomycota。各處理所含真菌門相似， Ascomycota所占比例在12.4%—56.8%之間，Basidiomycota占比8.4%—28.0%，Mortierellomycota占比5.3%—18.1%。各處理間的Ascomycota百分占比為 G>D>B>F>C>A>H>I>E，處理 G、D、B的Ascomycota含量顯著高于其他處理，而含量最低的是處理I和E。Basidiomycota的百分占比為B>I>H>E>A>G>C>F>D。各處理的Mortierellomycota百分占比為C>D>G>F>A>B>H>I>E。

圖1 不同輪作方式土壤真菌門水平群落組成及相對豐度Fig. 1 Composition and relative abundance of soil fungal phylum under different rotation patterns

Ascomycota（子囊菌門）、Basidiomycota（擔子菌門）和Mortierellomycota（被孢霉門）在所有處理中占比最高；含量最豐富的是處理 B（馬鈴薯連作）、D（赤小豆-馬鈴薯）和G（赤小豆-蕎麥），最低的是處理E（馬鈴薯-蕎麥）和I（蕎麥-馬鈴薯）；馬鈴薯連作在真菌門水平上的豐度高于赤小豆和蕎麥的連作，而馬鈴薯和蕎麥輪作的真菌豐度最低。

如圖2所示，真菌屬水平共檢測出32種真菌屬，不同處理在屬水平上主要有Mortierella（被孢霉屬）、Metacordyceps、Acremonium（頂孢霉屬）、Saitozyma、Plectosphaerella（癬囊腔菌屬）、Trechispora（糙孢菌屬）、Vishniacozyma（維希尼克氏酵母菌屬）、Spirosphaera（球旋霉屬）、Boeremia、Fusarium（鐮孢菌屬）、Isaria（棒束孢屬）、Cladophialophora（瓶霉屬）、Clitopilus（陡蓋菌屬），所占比例均在1.22%—18.05%范圍內，其余真菌屬所占比例較低。通過真菌群落豐度比例可知，處理A的主要優(yōu)勢屬的相對豐度為：Mortierella 8.78%、Metacordyceps 6.52%、Fusarium 3.75%；處理B的優(yōu)勢屬的相對豐度為：Mortierella 7.69%、Trechispora 5.31%、Acremonium 3.27%；處理C的優(yōu)勢屬的相對豐度為 Mortierella 16.43%、Trechispora 4.77%、Clitopilus 2.57%。而Mortierella（被孢霉屬）是 3種作物連作的優(yōu)勢屬，其余真菌屬根據作物不同有較大差異。

圖2 不同輪作方式土壤真菌屬水平群落組成及相對豐度Fig. 2 Composition and relative abundance of soil fungal genus under different rotation patterns

兩種相同作物，因種植順序不同，對真菌優(yōu)勢屬的影響也不同。馬鈴薯和赤小豆輪作：處理D（赤小豆-馬鈴薯）優(yōu)勢屬的相對豐度為 Mortierella 18.05%、Boeremia 6.42%、Fusarium 4.67%；處理H（馬鈴薯-赤小豆）的優(yōu)勢屬的相對豐度為Saitozyma 6.31%、Mortierella 5.27%、Metacordyceps 3.17%；馬鈴薯和蕎麥輪作：處理E（馬鈴薯-蕎麥）優(yōu)勢屬的相對豐度為 Saitozyma 12.28%、Vishniacozyma 4.72%、Plectosphaerella 2.48%；處理I（蕎麥-馬鈴薯）的優(yōu)勢屬的相對豐度為 Saitozyma 16.08%、Plectosphaerella 8.38%、Vishniacozyma 5.87%。蕎麥和赤小豆輪作：處理F（蕎麥-赤小豆）的優(yōu)勢屬的相對豐度為 Mortierella 11.14%、Vishniacozyma 3.17%、Plectosphaerella 2.32%；處理 G（赤小豆-蕎麥）的優(yōu)勢屬的相對豐度為Mortierella 11.56%、Trechispora 7.79%、Plectosphaerella 3.64%。

由此可見，不同的輪作方式對作物根際土壤真菌群落優(yōu)勢屬的種類和豐度存在不同程度的影響，在9個處理中，連作真菌屬多樣性明顯高于輪作的處理，馬鈴薯和蕎麥的種植順序對優(yōu)勢屬的種類和豐度影響較小，處理E（馬鈴薯-蕎麥）和處理I（蕎麥-馬鈴薯）的真菌屬水平多樣性相對其他處理較低。而馬鈴薯和赤小豆的種植順序對優(yōu)勢屬的種類和豐度影響較大，其次是蕎麥和赤小豆。

2.3 不同輪作方式真菌群落熱圖分析

根據 OTU豐度進行聚類，將高豐度、低豐度的物種模塊聚集，通過顏色變化與相似程度來直觀反映不同樣品在屬水平上群落結構的差異性和相似性，群落熱圖能夠較為直觀反應不同處理樣品間真菌群落中物種組成相似性、差異性、物種聚類關系等情況。由圖3可知，處理不同，根際土壤真菌優(yōu)勢屬也不同。處理 A優(yōu)勢屬為 Mortierella、Metacordyceps和 Fusarium；處理 B優(yōu)勢屬為Mortierella、Acremonium、Metacordyceps；處理 C優(yōu)勢屬為 Mortierella、Trechispora、Clitopilus；處理 D 優(yōu)勢屬：Mortierella、Fusarium、Boeremia；處理 E優(yōu)勢屬：Saitozyma、Vishniacozyma、Plectosphaerella；處理 F優(yōu)勢屬：Mortierella、Vishniacozyma、Trechispora；處理 G 優(yōu)勢屬：Mortierella、Plectosphaerella、Trechispora；處理H優(yōu)勢屬：Saitozyma、Mortierella、Metacordyceps；處理 I優(yōu)勢屬為 Saitozyma、Plectosphaerella和Mortierella。

熱圖聚類結果（圖3）中，顏色代表物種豐度，縱向聚類表示不同物種在各處理間豐度的相似情況，兩物種間距離越近，枝長越短，說明這兩個物種在各樣品間的豐度越相似；橫向聚類表示不同處理間物種豐度的相似情況，與縱向聚類一樣，兩樣品距離越近，枝長越短，說明這兩個樣品的各物種豐度越相似。由聚類樹可知，處理B（馬鈴薯連作）和處理F（蕎麥-赤小豆）的物種豐度差異最顯著，處理B和處理D（赤小豆-馬鈴薯）、處理E（馬鈴薯-蕎麥）和處理 I（蕎麥-馬鈴薯）、處理 C（蕎麥連作）和處理G（赤小豆-蕎麥）、處理A（赤小豆連作）、F（蕎麥-赤小豆）和處理 H（馬鈴薯-赤小豆）之間的物種豐度較為相似。

圖3 不同輪作方式土壤真菌群落結構屬水平的熱圖聚類Fig. 3 Thermal map clustering of soil fungal community structure at genus level in different rotation patterns

2.4 不同輪作方式對真菌群落組成的主成分分析

為了更直觀的分析不同輪作方式對土壤真菌群落的影響，繪制了PCA分析圖（圖4）。PCA分析共提取了兩個主成分PC1和PC2，二者方差累計貢獻率為62.485%，說明這兩因素是造成不同輪作方式土壤真菌群落差異的主要因素。圖中各個點代表不同的處理，點距離越近，表示真菌群落結構越相似；點距離越遠，表示真菌群落結構差異性越大。9個處理中，處理 E（馬鈴薯-蕎麥）在主成分 1軸和2軸上與其他處理的距離都較遠，其中最接近的是處理 H（馬鈴薯-赤小豆）和處理 I（蕎麥-馬鈴薯）；處理F（蕎麥-赤小豆）與其他處理在主成分1軸和2軸上都有一定距離，處理B（馬鈴薯連作）和D（赤小豆-馬鈴薯）、處理H和I在主成分1軸和2軸上距離較近。PCA分析結果表明，不同的輪作方式改變了土壤真菌群落的組成結構，且相同的作物，種植順序不同，對真菌群落的結構也有較大的影響。

圖4 同輪作方式土壤真菌群落結構PCA分析Fig. 4 PCA analysis of soil fungal community structure in the same crop rotation

3 討論

土壤微生物對農作物的生長及養(yǎng)分獲取具有重要的作用（Almario et al.，2013），其群落結構組成和多樣性是土壤生態(tài)環(huán)境的重要生物指標（Bossio et al.，2006）。連作會降低土壤質量，單作環(huán)境下，作物的化感物質會影響土壤微生物群落，易形成連作障礙，不利于作物生產（Huang et al.，2013）。本研究結果表明，連作的真菌屬水平上多樣性高于輪作處理，這與馬春梅等（2014）的研究結果一致。連作使微生物活性不斷降低，真菌的比例明顯升高，使土壤由細菌型向真菌型轉化（顧美英等，2012）；大豆連作，土壤微生物總數差異不顯著，但根際真菌相對數量較高，土壤微生物組成向真菌型轉變（孟麗娜，2008）。細菌型是土壤肥力提高標志，真菌是土壤肥力降低的指示器（劉軍等，2012）。在本研究中，馬鈴薯、赤小豆和蕎麥對根際真菌群落結構有不同的影響，馬鈴薯連作使真菌群落豐度和多樣性高于輪作，這與孫小花等（2019）研究結果一致。土壤真菌的群落結構和多樣性受到土壤理化性質、化學因子等多方面的影響（王曉彤等，2019）；不同作物輪作方式對真菌群落結構變化的響應不同，作物根系向土壤中釋放的多糖、氨基酸和酶類等化學物質使土壤環(huán)境形成了差異，對土壤真菌群落結構產生了影響（袁月等，2014）；長期的單一栽培和連作導致真菌群落多樣性的變化，土壤真菌多樣性隨著連作年限的增加而增加（Li et al.，2019）。本研究顯示，Ascomycota（子囊菌門）、Basidiomycota（擔子菌門）、Mortierellomycota（被孢霉門）是 9個處理中優(yōu)勢門類，但每個處理所占比例不同，這是由于作物的改變顯著改變了土壤的物理及化學性質進而影響了微生物的生存環(huán)境（陳桂香等，2017）。在優(yōu)勢屬水平真菌的分析結果中發(fā)現，輪作方式對真菌屬的影響較大，每個處理的優(yōu)勢屬及所占比例不同。劉星等（2015）研究表明，馬鈴薯連作導致土壤微生物群落結構顯著改變，病原菌成為優(yōu)勢種群，比如Fusarium（鐮孢菌屬）等土傳病原真菌的數量顯著增加，容易導致病害發(fā)生。本研究中，處理D（赤小豆-馬鈴薯）的輪作方式鐮孢菌屬占比最高，而處理E（馬鈴薯-蕎麥）、I（蕎麥-馬鈴薯）的占比較低，說明赤小豆和馬鈴薯的輪作方式更有利于鐮孢菌屬的繁殖，而馬鈴薯和蕎麥的輪作方式在一定程度上抑制了鐮孢菌屬的繁殖，可以緩解鐮孢菌引起的馬鈴薯土傳病害，這與柴瑩等（2018）的研究結果相似。土壤微生物群落多樣性和組成，受到土壤理化性質和不同生境的影響，在不同的生境中，根際微生物群落存在差別（丁麗等，2020）。真菌群落結構的變化與植物生物量，真菌豐度和根際分泌物等變化有關（Shi et al.，2020）。因此，可通過不同的輪作方式定向調節(jié)土壤微生物群落結構，優(yōu)化土壤生態(tài)結構，提高土壤肥力。

4 結論

馬鈴薯、赤小豆和蕎麥不同的輪作方式，對土壤理化指標改善最明顯的是處理E（馬鈴薯-蕎麥）、I（蕎麥-馬鈴薯）和 H（馬鈴薯-赤小豆）；蕎麥與馬鈴薯的輪作方式優(yōu)于其他處理。真菌豐度和多樣性最高的是處理A（赤小豆連作）、F（蕎麥-赤小豆）和H（馬鈴薯-赤小豆）；最小的是處理E（馬鈴薯-蕎麥）和處理 I（蕎麥-馬鈴薯）。優(yōu)勢門類是Ascomycota（子囊菌門）、Basidiomycota（擔子菌門）和Mortierellomycota（被孢霉門）；最豐富的是處理 B（馬鈴薯連作）、D（赤小豆-馬鈴薯）和 G（赤小豆-蕎麥）；最低的是處理 E（馬鈴薯-蕎麥）和處理I（蕎麥-馬鈴薯）；馬鈴薯連作在真菌門水平上的豐度高于赤小豆和蕎麥的連作，而馬鈴薯和蕎麥的輪作方式豐度最低。不同的輪作方式對作物根際土壤真菌群落優(yōu)勢屬的種類和豐度存在不同程度的影響，在9個處理中，連作真菌屬多樣性明顯高于輪作的處理。馬鈴薯和蕎麥的種植順序對優(yōu)勢屬的種類和豐度影響最小，且處理E（馬鈴薯-蕎麥）和處理I（蕎麥-馬鈴薯）的真菌屬水平多樣性相對其他處理較低；而馬鈴薯和赤小豆的種植順序對優(yōu)勢屬的種類和豐度影響最大，其次是蕎麥和赤小豆。所以，選擇適宜的作物，比如蕎麥進行輪作對于馬鈴薯生產的可持續(xù)發(fā)展是有利的。