模擬增溫對土壤真菌群落組成及多樣性的影響

姚世庭，蘆光新*，鄧曄 ，黨寧，王英成，張海娟，顏琿璘

1. 青海大學農牧學院，青海 西寧 810016；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心/中國科學院環(huán)境生物技術重點實驗室，北京 100085

以氣候變暖和大氣 CO2濃度升高為主要特征的全球氣候變化，嚴重影響著生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性（牟雪潔等，2016）。青藏高原作為中國的重要生態(tài)屏障，擁有著世界上海拔最高、面積最大、類型最為獨特的高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)，其生態(tài)系統(tǒng)一旦遭到破壞，恢復重建的難度非常大。鑒于青藏高原獨特的生態(tài)重要性和脆弱性，研究其高寒生態(tài)系統(tǒng)成為開展全球氣候變化響應的重要課題，青藏高原地區(qū)由于受到過度放牧、農業(yè)墾植等人類活動的影響，大片草地開始出現退化，草原土壤理化性質發(fā)生變化（斯貴才等，2015）。模擬增溫實驗表明增溫通過改變土壤溫度和水分含量，將改變土壤微生物的群落結構、生物量及土壤酶活性（溫小成等，2015），對植物、土壤以及微生物群落產生極大的影響（樸世龍等，2002）。

土壤微生物在對氣候變化的反饋中起到了至關重要的作用，氣候的變暖顯著改變了土壤微生物的數量、豐富度和碳氮元素的轉化功能（Xue et al.，2016；Cheng et al.，2017；Yu et al.，2018）。據估計，全球土壤中存在數萬種微生物（Gans et al.，2005；劉國華等，2012）。土壤微生物包括真菌、藻類（藍藻除外）、地衣等真核生物，和細菌、藍藻、放線菌等原核生物（Jenkinson et al.，1981）。它們加速土壤有機物質轉化，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著很重要的作用（周桔等，2007）。目前對于青藏高原土壤微生物的研究較多，但是通過模擬增溫研究青藏高原真菌變化的文獻很少，李欣等（2017）研究發(fā)現增溫有利于增加三大類群微生物數量，增幅表現為：細菌>放線菌>真菌。真菌在土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著至關重要的作用（Miao et al.，2016），真菌不但可以參與植物殘體的分解，推動土壤養(yǎng)分的循環(huán)（盛玉鈺等，2018），也會受到植物和土壤理化性質的影響（Rodriguez-Blanco et al.，2015），如溫度（Mateos-Rivera et al.，2016）、水分（Watson et al.，2017）、土壤養(yǎng)分（程虎等，2017）和pH（Janczak et al.，2018）等。

高通量測序技術被廣泛用于探索各種生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落（包括細菌，古細菌和真菌）的多樣性和組成結構（Gohl et al.，2016）。轉錄間隔區(qū)（ITS）是研究真菌最常用的測序靶點（Filippis et al.，2017）。ITS擴增子測序能夠真實地反映真菌群落結構和多樣性（Guo et al.，2020），目前在醫(yī)學、農業(yè)、工業(yè)等微生物領域應用廣泛（Bergsveinson et al.，2018）。對于真菌，一些基因組區(qū)域已被用作條形碼標記，包括小亞基（SSU）和大亞基（LSU）核糖體RNA（rRNA）基因，以及兩個非編碼內部轉錄間隔區(qū)（ITS1和ITS2）。研究表明，ITS區(qū)提供了很大的豐富性和分類學分辨率（Tedersoo et al.，2016）。核DNA的整個ITS已被提名為真菌群落的通用基因條形碼，由于其更高的擴增和測序成功率以及更高的分類學覆蓋范圍，從而實現了物種級的分辨率（Schoch et al.，2012）。但是，由于整個ITS區(qū)域太長無法完整測序，因此僅針對ITS1或ITS2區(qū)域是切實可行的。本論文通過在青藏高原高寒草地采用Illumina測序技術對高寒草甸土壤真菌進行ITS擴增子測序，深入全面研究模擬增溫后高寒草甸真菌群落組成與多樣性變化，為今后青藏高原土壤真菌多樣性的功能研究和發(fā)展利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于青海省玉樹州稱多縣珍秦鎮(zhèn)的青海大學-清華大學三江源草地生態(tài)系統(tǒng)監(jiān)測定位站，地理位置為 33°24′30″N，97°18′00″E，海拔 4270 m。氣候類型屬典型大陸性高原高寒氣候，氣候寒冷，四季不分明。年降水502.30 mm，主要集中在6—9月，占全年降水量的72.57%；土壤為高寒草甸土，植被為高寒草甸，存在輕度退化。建群種為高山嵩草（Kobresia pygmaea），伴生種有青藏薹草（Carex moorcroftii）、早熟禾（Poa pratensis）、垂穗披堿草（Elymus nutans）、異針茅（Stipaaliena keng）、洽草（Koeleria cristata）等；其他雜類草有黃花棘豆（Oxytropis ochrocephala）、釘柱萎陵菜（Potentilla saundersiana）、兔耳草（Lagotis ramalana）等。

模擬增溫試驗開始于2013年7月。采用開頂式氣室增溫方法，從2013—2018年連續(xù)增溫使0—15 cm土壤溫度年均增加2.50 ℃，15—30 cm土壤溫度年均增加1.36 ℃。增溫氣室由6塊梯形聚碳酸酯板鏈接成正六邊形棱臺體，梯形板下底邊長91.4 cm，上底邊長62.6 cm，斜邊長為62.6 cm，高為61.0 cm，上底邊與斜邊的夾角為103.3°和下底邊與斜邊的夾角為76.7°，將下底邊以寬度為5.0 cm的鋁合金條固定，梯形板之間用螺絲固定。試驗期內將增溫氣室底部的鋁合金邊扎入土中，保證增溫小室和地面的密閉性，同時也避免冬季大風吹移。樣地所處地點地勢平坦，植物群落組成相對均一。為保證試驗樣地不受干擾和破壞，用圍欄封閉，禁止放牧活動，文中用編號F、M分別代表增溫樣地與未增溫樣地，用a、b分別代表0—15 cm土層和15—30 cm土層，Fa代表增溫0—15 cm，Fb代表增溫15—30 cm，Ma代表不增溫0—15 cm，Mb代表不增溫15—30 cm。

1.2 試驗方法

微生物測定方法參考Wang et al.（2019）的研究方法，用冷凍研磨法從2 g土壤中提取微生物群落基因組DNA，并使用PowerSoil?DNA分離試劑盒（MOBIO）進行純化。DNA質量和濃度是根據用 NanoDrop分光光度計（Nano-100，Aosheng Instrument Co Ltd.）檢測到的260/280 nm（>1.8）和260/230 nm（>1.7）的吸光度比評估的。土壤樣品的DNA濃度在20—100 ng之間更適合PCR擴增。但是對于GeoChip雜交和Illumina測序，使用PicoGreen分析和Qubit熒光定量法（Thermo Fisher Scientific）來定量DNA量。對于真菌的ITSrRNA基因2區(qū)用成對的通用引物gITS-7F和4R，結合自行設計的條形碼來區(qū)分樣品。Illumina Miseq測序序列在（http://mem.rcees.ac.cn: 8080）平臺進行，使用 UPARSE刪除嵌合體并將序列分類為操作分類相似度為97%的單位（OTU），不丟棄任何單例；獲得隨機重采樣OTU表。

1.3 環(huán)境因子數據采集

1.3.1 地上植物指標的觀測

植物調查工作在 2013—2018每年植物生長季的生長高峰期（8月上旬）進行，在每個處理內隨機設置1個0.5 m×0.5 m的植物調查樣方，調查內容包括物種多度、高度、生物量。

1.3.2 土壤理化性質

全氮（Total nitrogen，TN）采用凱氏定氮法（李容榕等，2020）；全碳（Total carbon，TC）采用重鉻酸鉀容量法（鮑士丹，2000）；土壤微生物量碳（Soil microbial biomass carbon，SMBC）采用熏蒸提取-儀器分析法（馬婷，2013）；土壤微生物量氮（Soil microbial biomass nitrogen，SMBN）和土壤硝態(tài)氮（Nitrate nitrogen，NO3?-N）采用紫外分光光度法（苗杰等，2019）；土壤銨態(tài)氮（Ammonium nitrogen，NH4+-N）采用靛酚藍比色法（李志萍等，2013）；堿解氮（Alkaline nitrogen，AN）采用堿解擴散法（李金彥，2010）；有機質（Organic matter，OM）采用重鉻酸鉀氧化-油浴加熱法（張旭等，2014）；土壤pH值采用電位測定法（王瑞琨，2018）。

1.3.3 土壤水分、土壤溫度、土壤電導率的測定

在試驗樣地安裝 HOBO U30小型自動氣象站和基于CR1000的土壤三參數分層測量系統(tǒng)，連續(xù)觀測土壤水分、土壤溫度、土壤電導率等指標（姚世庭等，2019；2020），并且在各處理小區(qū)內，分別在地上30、15 cm，地表，地下7.5、15、22.5 cm處安置溫濕度自動記錄儀探頭（Onset公司生產的溫濕度測定儀）。

1.4 數據統(tǒng)計與分析

本研究中使用Microsoft Excel 2010對各項分析測定數據進行運算，所有測序的原始數據均于中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心鄧曄研究員課題組的Galaxy分析平臺（http://mem.rcees.ac.cn:8080）完成。采用DPS 6.55，SPSS 2.0中的方差分析、最小顯著差異法和相關性分析等方法進行數據統(tǒng)計分析，用 Origin 8軟件進行非度量多維尺度分析（Non-metric multidimensional scaling analysis，NMDS）和主坐標分析圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 真菌多樣性分析

2.1.1 土壤微生物群落稀釋性曲線

利用高通量測序技術，分析高寒草地不同土壤微生物群落結構多樣性，測序剔除不合格序列，所得真菌有效序列數介于74000—134000。通過個體數與物種數來構建稀釋性曲線（圖 1），反映測序的數據是否合理，樣品中物種是否豐富。通過真菌群落稀釋性曲線發(fā)現物種的豐富度（observed species）呈 Mb>Ma>Fb>Fa。

圖1 土壤樣品真菌群落的稀釋曲線Fig. 1 Dilution curve of fungal communities in soil samples

由表 1可知，土壤真菌群落 Shannon指數和Simpson指數均呈現出 Mb>Fb>Ma>Fa，而 Chao1指數呈現Mb>Fa>Ma> Fb。說明相較于對照，增溫會使真菌群落多樣性有所降低；且增溫后真菌群落豐富度也有所降低。

表1 真菌群落Alpha多樣性指數特征Table 1 Alpha diversity index characteristics of fungal communities

2.1.2 土壤真菌群落組成

通過測序分析，土壤中真菌共檢測出6個門，繪制其物種相對豐度累加圖（圖2），發(fā)現在Fa、Fb、Ma、Mb中子囊菌門（Ascomycota）分別為52.6%、48.9%、47.4%、66.6%，擔子菌門（Basidiomycota）分別為7.0%、14.8%、10.3%、9.4%，接合菌門（Zygomycota）分別為3.4%、14.8%、3.6%、17.2%等，無法確定到門的物種（Unclassified）分別為37.0%、20.6%、38.7%、6.7%。

圖2 真菌群落門水平相對豐度的比較Fig. 2 Comparison of relative abundance of fungal community gate levels

通過測序分析，土壤中真菌共檢測出261個屬。在屬分類水平上，將豐度占比前 20的物種進行排序，其余物種合并成other，由物種相對豐度累加圖（圖3）可知，土壤真菌主要分布為Davidiella（8.77%—15.44%）、孢霉屬（Mortierella 2.93%—10.89%）、盤菌（Aleuria 0.03%—4.72%）、隱球菌（Cryptococcus 1.17%—3.98%）、Tetracladium（0.32%—6.05%）、光黑殼屬（Preussia 1.12%—1.91%）、絲蓋傘屬（Inocybe 0.00%—4.88%）、異莖點霉屬（Paraphoma 0.75%—2.07%）、赤霉菌（Gibberella 0.74%—1.63%）等，但依然有 35.01%—61.56%無法鑒定到屬水平上。發(fā)現Fb表現出在Davidiella上豐度最高，Ma表現出在 Thelebolus上豐度最高，Mb表現出在Mortierella上豐度最高。

圖3 真菌群落屬水平相對豐度的比較Fig. 3 Comparison of relative abundance of fungal community genus levels

2.1.3 不同樣品Dissimilarity test差異檢測

對 Fa、Fb、Ma、Mb等 4個不同樣品進行Bray-Curtis相異系數和Jaccard相似系數差異檢測（表2），結果發(fā)現真菌中各組之間差異均不顯著（P>0.05）。

表2 不同樣品Dissimilarity test差異檢測Table 2 Dissimilarity test for different samples

2.1.4 非度量多維尺度分析

Bray-Curtis距離主要基于OTUs的計數統(tǒng)計比較兩個群落的組成差異。相比于 Jaccard、Bray-Curtis，其包含了OTUs豐度信息。從圖4可以看出，不同處理水平下土壤樣品真菌群落組成差異不顯著，真菌群落結構較為相似。

圖4 不同處理土壤真菌的非度量多維尺度分析（NMDS）Fig. 4 Non-metric multidimensional scaling analysis (NMDS) of soil fungi with different treatments

2.1.5 主坐標分析樣本群落組成

構組成較為相似主坐標分析（PCoA，Principal Co-ordinates Analysis），用于分析研究樣本中群落組成的相似性或差異性。圖 5中 PC1貢獻率為66.8%，PC2貢獻率為14.6%，累計貢獻率達81.4%，可以反映數據主要信息。樣品點距離越近，微生物群落的相似性度越高，PCoA結果表明，Fa、Fb、Ma和Mb微生物群落間的相似性都較高。

圖5 不同處理土壤真菌主坐標分析Fig. 5 Analysis of principal coordinates of soil fungi in different treatments

2.2 真菌多樣性指數與土壤環(huán)境因子相關性分析

2.2.1 不同環(huán)境因子之間的相關關系

應用Pearson相關性分析探究15種環(huán)境因子之間存在的相關性（表3）。結果發(fā)現：環(huán)境因子之間相關性顯著，其中銨態(tài)氮與堿解氮，全氮與微生物碳，堿解氮與土壤微生物量碳，有機質與土壤微生物量氮，土壤微生物量碳與土壤微生物量氮，土壤溫度與土壤含水量呈極顯著正相關（P<0.001），全氮與全碳、pH，堿解氮與pH、全碳，全碳與土壤微生物量氮呈極顯著負相關（P<0.001）。

表3 環(huán)境因子相關關系Table 3 Correlation between environmental factors

2.2.2 真菌多樣性指數與土壤環(huán)境因子相關性分析

微生物群落組成和分布受環(huán)境因子的影響而呈現出多樣性，因此微生物群落的多樣性與環(huán)境因子之間存在著一定的相關性。Pearson相關系數分析結果顯示（表 4）：Shannon指數與銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、堿解氮、微生物碳、微生物量氮、物種鮮重生物量、土壤電導率呈現負相關的關系，而與其他指數均呈正相關關系。Simpson指數與pH、全碳、高度、溫度、土壤含水量呈負相關關系，而與其他指數呈正相關關系，其中與物種數呈顯著正相關（P<0.05），Chao指數與pH、全碳、高度、物種數呈正相關而與其他指數呈負相關。PD指數與pH、全碳、高度呈正相關，與其他指數呈負相關關系。

表4 微生物多樣性與土壤環(huán)境因子Pearson相關系數矩陣Table 4 Pearson correlation coefficient matrix of microbial diversity and soil environmental factors

采用Mantel test分析微生物群落結構與土壤環(huán)境因子的關系（表 5），發(fā)現在真菌群落結構中發(fā)現 pH、微生物氮與真菌存在顯著相關關系（P<0.05），相關系數分別為r=0.3218，r=0.2318。

表5 Partial Mantel test分析微生物群落結構與土壤環(huán)境因子Table 5 Partial Mantel test analysis of microbial community structure and soil environmental factors

3 討論

目前有關青藏高原高寒草地真菌對增溫的響應研究很少，本文基于Illumina測序技術分析模擬增溫后不同土層土壤真菌多樣性的改變以及不同土壤環(huán)境因子與土壤真菌的相關性，為將來全球變暖研究提供數據基礎。研究發(fā)現，模擬增溫導致真菌群落多樣性和豐富度有所降低。本次共檢測出 6個門261個屬，子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、球囊菌門（Glomeromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）為主要門。子囊菌門（Ascomycota）豐度最高，可達 66%，其次是擔子菌門，這與李定瑤（2014）在青藏高原多年凍土中發(fā)現子囊菌門和擔子菌門兩個類群為優(yōu)勢菌群的結果相似。王艷發(fā)等（2016）研究的青藏高原凍土區(qū)垂直剖面土壤子囊菌（Ascomycota）與擔子菌（Basidiomycota）組成比例為75.3%和24.7%，凍土活動層的26個克隆序列均屬于子囊菌，說明活動層土壤真菌多樣性較低，推測與活動層較高的地溫有關，這與我們研究所得增溫后真菌豐度低于對照組真菌豐度的結果不謀而合。

在非度量多維尺度分析中發(fā)現在 Bray-Curtis距離和jaccard距離結果上，不同處理水平下土壤樣品真菌群落組成差異不顯著，F和M樣品聚集在一起，說明這兩個樣品的真菌群落結構組成無顯著差異。PCoA結果表明Fa、Fb、Ma和Mb微生物群落間的相似性都較高，原因可能是模擬增溫年限不夠溫度增幅太小，或者是采集的土壤深度不夠。Partial Mantel test分析微生物群落結構與土壤環(huán)境因子時發(fā)現 pH、微生物氮對真菌多樣性群落結構影響顯著，這與王楠等（2020）研究發(fā)現土壤 pH是構建土壤真菌群落結構的主要驅動力結果一致。代表著微生物群落穩(wěn)定性的土壤真菌多樣性，在一定程度上反映著群落對生態(tài)效應的響應（林先貴，2010）。土壤環(huán)境對真菌生長繁殖影響很大，土壤pH、溫濕度及土壤的呼吸方式等都會給微生物生存造成不同程度的影響（馬驄毓，2017）。在相似的環(huán)境下，微生物群落的結構由植物的類型來確定，土壤微生物多樣性的不同與受到植被的影響、土壤碳氮含量、土壤含水量、酸堿度等息息相關。微生物作為青藏高原高寒草地生態(tài)系統(tǒng)中不可缺少的一部分，對土壤碳氮循環(huán)具有重要作用。

4 結論

通過對青藏高原高寒草地土壤微生物群落組成、多樣性與環(huán)境因子進行相關性分析，初步探討了土壤環(huán)境因子對微生物群落結構和多樣性的影響，不同的環(huán)境因子對土壤微生物群落結構產生不同的影響。結果如下：

（1）群落結構分析和多樣性分析，發(fā)現Fa（增溫0—15 cm）、Fb（增溫15—30 cm）、Ma（不增溫0—15 cm）、Mb（不增溫15—30 cm）在微生物組成上差異不明顯，子囊菌門（Ascomycota），擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota），球囊菌門（Glomeromycota），壺菌門（Chytridiomycota）。子囊菌門（Ascomycota）豐度最高，最高可達66%，其次是擔子菌門（Basidiomycota）。

（2）多維尺度分析及主坐標分析結果表明，Fa、Fb、Ma、Mb群落結構較相似。土壤真菌群落Alpha多樣性指數表現為：Shannon指數Mb>Fb>Ma>Fa；Simpson指數 Mb>Fb>Ma>Fa；Chao1指數Mb>Fa>Ma>Fb。

（3）微生物與土壤環(huán)境因子相關性分析結果表明，pH、微生物氮是真菌群落結構中的主要影響因子。