環(huán)青海湖4種生境土壤中原核微生物群落結(jié)構(gòu)及分子網(wǎng)絡(luò)特征

王宇姝 ，盛海彥，羅莎莎，胡月明, ，余玲玲 *

1. 農(nóng)業(yè)部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642；2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510642；3. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，廣西 西寧 810016；4. 廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣東 廣州 510316；5. 廣東省土地利用與整治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642

環(huán)青海湖地區(qū)位于中國青藏高原高寒地區(qū)農(nóng)牧交錯(cuò)帶，農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)交叉分布，土地利用變化頻繁，生態(tài)系統(tǒng)中的各類環(huán)境因素都處在邊緣過度狀態(tài)，屬于生態(tài)系統(tǒng)脆弱區(qū)，尤其是農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)的頻繁交替過程會(huì)改變地表植被覆蓋狀況、土壤養(yǎng)分物質(zhì)等環(huán)境因素，加劇土壤生態(tài)系統(tǒng)的退化（Liu et al.，2017；Wang et al.，2020）。改善土壤肥力和提高土壤質(zhì)量成為這一區(qū)域發(fā)展的關(guān)鍵問題。其中，土壤微生物擔(dān)當(dāng)了包括土壤碳、氮循環(huán)在內(nèi)的多個(gè)重要的生態(tài)系統(tǒng)功能，對(duì)維持生物多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能和穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用（Chapin et al.，2009），土壤微生物生態(tài)學(xué)特性是土壤質(zhì)量和土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的重要表征（Cruz et al.，2009；李娟等，2008）。高寒土壤微生物對(duì)氣候、溫度、水分等環(huán)境因子具有敏感的響應(yīng)，不同生境土壤的空間異質(zhì)性和環(huán)境因子的差異也會(huì)影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異，并包含了大量未知和遠(yuǎn)古的微生物種群。有研究表明，高寒土壤原核微生物在不同生境存在不同的優(yōu)勢菌種，高寒草甸帶土壤中細(xì)菌的優(yōu)勢菌門為放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）（朱平等，2017），在青藏高原凍融腹地不同生態(tài)系統(tǒng)中變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）及浮霉菌門（Planctomycetes）細(xì)菌為研究區(qū)優(yōu)勢菌種（張寶貴等，2012），北極凍土帶的土壤中變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）占主導(dǎo)地位（Koyama et al.，2014），在天山北坡高寒山地的研究中廣古菌門（Euryarchaeota）和泉古菌門（Crenarchaeota）在古菌群落中占主導(dǎo)地位（吳尊鳳等，2012）。

近年來高通量測序技術(shù)和分子網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)的發(fā)展為研究土壤微生物的多樣性、群落組成和與環(huán)境因子之間的相關(guān)性提供了有力的研究方法。分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)能夠更進(jìn)一步地探究土壤微生物種間的相互作用，評(píng)估微生物群落結(jié)構(gòu)變化引起的生態(tài)系統(tǒng)功能演變以及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性（石文莉等，2018）。汪峰等（2014）通過構(gòu)建土壤核心氮轉(zhuǎn)化基因分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，表明了種植玉米作物顯著改變了土壤氮轉(zhuǎn)化基因網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因；朱瑞芬等（2020）利用分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)表明了在退化草地土壤中施氮會(huì)對(duì)土壤中的關(guān)鍵菌種產(chǎn)生影響，進(jìn)一步可以通過合理施氮修復(fù)退化草地土壤；Zheng et al.（2017）比較了不同鹽度土壤中原核微生物群落分子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)高鹽度脅迫加強(qiáng)了微生物間的相互作用來適應(yīng)高鹽度的生境。然而，針對(duì)高寒農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)不同利用方式土壤中原核微生物的群落結(jié)構(gòu)組成和菌種間相互作用的研究目前較少。本文選取環(huán)青海湖地區(qū)農(nóng)牧交錯(cuò)帶不同類型土壤原核微生物為研究對(duì)象，利用Illumina Miseq測序探究了不同土壤類型土壤原核微生物多樣性、群落組成結(jié)構(gòu)特征以及影響微生物群落的主要環(huán)境因子；利用隨機(jī)矩陣原理構(gòu)建了不同土壤利用類型土壤原核微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，探究不同利用類型土壤原核微生物間的相互作用，解析土壤類型與原核生物群落的相互作用的關(guān)系。研究高寒生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和分子網(wǎng)絡(luò)特征能有效闡明土壤微生物對(duì)氣候變化的響應(yīng)進(jìn)而表征當(dāng)?shù)赝寥蕾|(zhì)量和環(huán)境變化，有助于推進(jìn)環(huán)青海湖農(nóng)牧交錯(cuò)帶的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 采樣地點(diǎn)與方法

研究地位于青藏高原東北部，環(huán)青海湖進(jìn)行采樣，采樣時(shí)間為2015年5月，期間以晴和多云天氣為主。采樣模式是選擇了4種不同生境的樣地進(jìn)行采樣，采樣點(diǎn)按生境類型分為山地（XSo）、草地（DSo）、牧場（LSo）和農(nóng)田（QSo）。其中，山地選擇橡皮山生態(tài)保護(hù)區(qū)的凍土地帶（36°45′15″N，99°36′21″E），植被主要以針茅和苔草為主；草地選擇倒淌河牧場天然草地（36°24′10″N，100°58′35″E），植被是以芨芨草為主的禾本科、莎草科、雜類牧草為主；牧場選擇青海湖近東岸草場（36°30′22″N，100°44′03″E），以禾本科牧草為主要植被，其次是莎草科、菊科、蓼科等；農(nóng)田選擇青海湖岸邊以種植青稞為主的地塊（36°33′24″N，100°31′58″E）。采用梅花布點(diǎn)法采集5個(gè)位置（區(qū)域內(nèi)中心點(diǎn)及4個(gè)頂點(diǎn)）土壤表層（0—20 cm）的土壤樣品，除去動(dòng)植物殘?bào)w及石塊，混合均勻即為一個(gè)樣品，每個(gè)采樣點(diǎn)有設(shè)有3個(gè)重復(fù)，共12個(gè)樣品用于后續(xù)分析。采集土壤樣品后立即將土樣放入便攜式冰盒保存，隨后，一部分土樣存于?20 ℃冷凍冰箱用于土壤原核生物高通量測序，另一部分存于 4 ℃條件下保存用于土壤理化性質(zhì)測定。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

采用玻璃電極法測定土壤pH（土?水=1?2.5），重鉻酸鉀-外加熱法測定土壤有機(jī)碳（SOC）含量，采用半微量凱氏定氮法測定總氮，鉬銻比色法測定總磷，火焰光度法測定總鉀，水蒸氣蒸餾法測定有效氮，比色法測定有效磷，原子吸收法測定有效鉀（鮑士旦，2000）。

1.3 高通量測序

土壤總DNA采用PowerSoil DNA Isolation Kit（MoBio，USA）試劑盒提取。提取方法按試劑盒說明書進(jìn)行。采用 Nanodrop 2000（Thermo，UAS）測定提取后土壤DNA濃度及純度。純化、質(zhì)控后，建立Illumina測序文庫，采用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行 Paired-end 250測序（美吉生物，上海，http://www.majorbio.com）。測序引物選取細(xì)菌16S rRNA V4—V5 區(qū)域的 338F（5′-ACTCCTACGGGA GGCAGCA-3′）/806R（5′-GGACTACHVGGGTWTC TAA-3′）和古菌16SrRNA V3-V5區(qū)域的Arch344F（5′-ACGGGGYGCAGCAGGCGCGA-3′）/Arch915R（5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′）。測序結(jié)果使用Flash軟件和Trimmomatic軟件拼接并去除低質(zhì)量序列，根據(jù)序列兩端的序列結(jié)構(gòu)和引物序列得出有效序列，校正序列方向。使用UPARSE（version 7.1 http://drive5.com/uparse/）軟件將相似度閾值97%以上的序列歸為一個(gè) Operation Taxonomic Unit（OTU），生成OTU表格，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)OTU代表序列與數(shù)據(jù)庫（采用16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)庫 Greengenes）進(jìn)行比對(duì)，獲得各個(gè)OTU的物種分類信息。使用MOTHUR（v.1.30.1）對(duì)OTU進(jìn)行α多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，利用R語言vegan包分析和作RDA圖，Mantel test使用QIIME軟件對(duì)環(huán)境因子與微生物群落的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

對(duì)高通量測序獲得的OTU數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，在 Molecular Ecological Network Analyses Pipeline（MENA）網(wǎng)站上傳數(shù)據(jù)后，構(gòu)建Pearson相關(guān)性矩陣，基于隨機(jī)矩陣?yán)碚摚╮andom matrix theory，RMT）通過設(shè)置合適的閾值，構(gòu)建微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，研究在不同生態(tài)系統(tǒng)下高寒土壤微生物群落之間的相互作用。利用Cytoscape 3.8.0軟件對(duì)微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理，得到各群落間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。節(jié)點(diǎn)代表群落中的物種，節(jié)點(diǎn)間的連線表明了物種間的相互作用關(guān)系。連通度代表直接與某節(jié)點(diǎn)相連節(jié)點(diǎn)的數(shù)目，路徑長度代表節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的最短距離，聚類系數(shù)代表了一個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)之間的連通程度，模塊性表現(xiàn)了分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中的模塊化特征。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行樣地間土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落豐度數(shù)據(jù)的單因素方差分析，采用Duncan進(jìn)行差異顯著性分析。利用Pearson相關(guān)性分析分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分別與環(huán)境因子之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)及養(yǎng)分狀況

通過測定土壤的 pH、有機(jī)碳（SOC）、全氮（TN）、有效磷（Olsen-P）、堿解氮（AN）、速效鉀（AK）和碳氮比來表征土壤的化學(xué)性質(zhì)及養(yǎng)分狀況。4種不同生境的土壤皆呈現(xiàn)堿性且存在顯著差異（表 1），其中山地（XSo）的土壤呈弱堿性；而牧場（DSo）土壤的pH顯著高于其他三者；SOC、TN和AN都表現(xiàn)為在山地土壤中顯著高于其它3個(gè)樣地，草場（LSo）、農(nóng)田（QSo）次之，在草場土壤中含量最低；在農(nóng)田中有效磷的含量最高，速效鉀的含量則顯著低于其他生境；山地土壤的速效鉀和碳氮比較顯著高于其他生境。

表1 不同生境土壤化學(xué)性質(zhì)及養(yǎng)分狀況Table 1 Soil chemical properties and nutrient status in different habitats

2.2 土壤微生物群落組成差異

采用Illumina MiSeq（PE250）對(duì)4種不同生境土壤測序分析，得到228833條細(xì)菌原始序列含有1432個(gè)OTU，古菌原始序列310644條含有309個(gè) OTU。隨著細(xì)菌和古菌測序量的升高，稀釋曲線雖然還存在增加的趨勢，但是增加速率趨近于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量達(dá)到了可分析水平（圖1）。

圖1 稀釋曲線圖Fig. 1 Rarefaction curve

α多樣性表征了微生物群落的豐富度和多樣性，采用Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)對(duì)群落的α多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)。QSo的細(xì)菌豐富度和多樣性最高且與其他生境差異顯著（圖2），DSo、XSo和LSo之間細(xì)菌豐富度沒有顯著差異；細(xì)菌Shannon指數(shù)LSo顯著高于DSo和XSo，DSo和XSo之間沒有顯著差異。在4種不同生境的古菌多樣性中，XSo的Chao1指數(shù)顯著高于其他三者，說明在山地土壤中的古菌群落豐富度較高且顯著高于其它生境。Shannon指數(shù)表明XSo的群落多樣性最高，而DSo和QSo之間多樣性沒有顯著差異，并低于XSo。在4種樣地中，LSo的多樣性最低且顯著低于XSo。

圖2 不同生境土壤微生物α多樣性Fig. 2 α-diversity of prokaryotic community in different soil habitats

對(duì) 4種不同生境土壤微生物群落在門水平上進(jìn)行分布組成分析，采用線性判別分析（LDA）探究不同生境下土壤微生物群落存在差異的主要組分（圖3）。由圖3A可知，在DSo土壤中的關(guān)鍵細(xì)菌群落分別為 Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi和 Gemmatimonadetes，其中Actinobacteria所占比例在最大，達(dá)到29.61%；在 QSo土壤中細(xì)菌關(guān)鍵種共有 6門，其中Bacteroidetes是QSo土壤中的獨(dú)有優(yōu)勢種，占比達(dá)到10.66%；在XSo和LSo中土壤優(yōu)勢菌種包含了Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi、Gemmatimonadetes和特有的Nitrospirae。由LDA分析結(jié)果（圖3A）可以得出，在 DSo中土壤細(xì)菌群落差異主要來源于Actinobacteria、Gemmatimonadetes、Chloroflexi和Proteobacteria；QSo土壤中影響細(xì)菌群落差異的關(guān)鍵菌群為 Bacteroidetes和 Proteobacteria；而Nitrospirae、Acidobacteria和Proteobacteria是影響XSo土壤群落差異的主要組分；在 LSo中，Actinobacteria和Gemmatimonadetes作為關(guān)鍵菌種影響了細(xì)菌群落差異。

不同生境土壤中古菌的群落組成及其群落在門水平上差異的關(guān)鍵菌種（圖3B）顯示在DSo和XSo土壤中的優(yōu)勢古菌種為 Euryarchaeota和Thaumarchaeota，而在 QSo和 LSo中Thaumarchaeota是唯一優(yōu)勢菌種。LDA分析結(jié)果表明在DSo土壤中Euryarchaeota是決定古菌群落結(jié)構(gòu)差異性的關(guān)鍵菌種；XSo中 Euryarchaeota和Thaumarchaeota共同影響了群落結(jié)構(gòu)差異性；QSo和LSo中Thaumarchaeota是唯一優(yōu)勢菌種決定著不同生境群落間差異。

圖3 不同生境土壤微生物群落組成與組間LDA分析結(jié)果分布Fig. 3 Soil prokaryotic community composition in different habitats and LDA analysis

2.3 環(huán)境因子對(duì)微生物群落的影響

基于RDA分析來解釋環(huán)境因子對(duì)不同生境土壤微生物群落的影響。環(huán)境因子對(duì)土壤細(xì)菌群落的總解釋量為74.60%，第一軸解釋了48.56%，第二軸解釋了26.04%（圖4A）。DSo受pH影響顯著，XSo則受到SOC、TN、AN、AK和碳氮比的影響。其中pH、SOC、TN、AN、AK和碳氮比都與土壤細(xì)菌群落顯著相關(guān)（表2）。

環(huán)境因子解釋了古菌群落的75.84%（圖4B），第一軸和第二軸分別解釋了51.37%和24.47%，pH主要影響DSo的土壤古菌群落，XSo主要受TN、AN、SOC、AK、碳氮比和Olsen-P的影響。環(huán)境因子中pH、SOC、TN、AN、AK和碳氮比顯著影響了土壤古菌群落（表2）。

表2 土壤化學(xué)性質(zhì)與微生物群落結(jié)構(gòu)的Mantel檢驗(yàn)和冗余分析Table 2 The Mantel test and Redundancy Analysis between soil chemical properties and nutrient status and microbial communities

圖4 不同生境土壤微生物群落與環(huán)境因子RDA分析Fig. 4 Redundancy analysis of soil microbial communities in different habitats

2.4 微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析

基于4種不同樣地中細(xì)菌和古菌的OTU數(shù)據(jù)分別構(gòu)建分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)代表群落中的物種，邊代表物種間的聯(lián)系。土壤細(xì)菌群落網(wǎng)絡(luò)包含576個(gè)節(jié)點(diǎn)和2124條邊組成（圖5A，表3）。XSo土壤中細(xì)菌物種間連接數(shù)較多，相互作用關(guān)系更復(fù)雜，在網(wǎng)絡(luò)中正相關(guān)占多數(shù)表明細(xì)菌物種間更多的是合作或共生關(guān)系；QSo網(wǎng)絡(luò)中正相關(guān)占主導(dǎo)作用，負(fù)相關(guān)大多是來自硝化螺旋菌門；在 DSo土壤中細(xì)菌間的連接數(shù)減少，負(fù)相關(guān)也明顯增多，表明在 DSo土壤中細(xì)菌物種間的相互作用較少且競爭關(guān)系較強(qiáng)；LSo網(wǎng)絡(luò)中存在唯一菌種Tectomicrobia。

表3 微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)Table 3 Characteristic parameters of the molecular ecological network of soil microorganism

土壤古菌群落網(wǎng)絡(luò)包含53個(gè)節(jié)點(diǎn)和693條邊（圖5B，表3），Thaumarchaeota在4種不同生境土壤中均存在，在古菌群落中具有重要位置。在4種生境中 XSo網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)和連接數(shù)較多，表明物種間相互作用強(qiáng)，種間關(guān)系復(fù)雜；QSo網(wǎng)絡(luò)中負(fù)相關(guān)占大多數(shù)，種間競爭關(guān)系較強(qiáng)；DSo中網(wǎng)絡(luò)連接和節(jié)點(diǎn)數(shù)較少。對(duì)比不同生境土壤細(xì)菌和古菌網(wǎng)絡(luò)屬性，細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)和連接數(shù)更多，節(jié)點(diǎn)間的聯(lián)系更加復(fù)雜；而古菌網(wǎng)絡(luò)的平均路徑長較小，平均連通度和聚類系數(shù)較高，說明古菌種間的物質(zhì)信息傳遞效率更高，對(duì)外界有敏感的響應(yīng)，但是群落結(jié)構(gòu)更加脆弱。

圖5 不同生境土壤微生物菌群間的網(wǎng)絡(luò)相互作用Fig. 5 Ecological networks of soil microbial community in different habitats

3 討論

高寒生態(tài)系統(tǒng)下土壤微生物對(duì)全球氣候變化響應(yīng)敏感，氣候和環(huán)境條件的改變可以影響微生物群落組成和功能，進(jìn)而影響高寒生態(tài)的系統(tǒng)功能（褚海燕，2013）。對(duì)具有高海拔、強(qiáng)光照、氣溫差異大等特點(diǎn)的環(huán)青海湖農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)，土壤利用類型一直被認(rèn)為是微生物群落結(jié)構(gòu)的主要決定因子（李冰等，2020）。農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)土地的利用方式會(huì)對(duì)土壤碳氮庫造成改變，進(jìn)而影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的組成和功能（Bossuyt et al.，2001），針對(duì)該地區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究有助于揭示高寒生態(tài)系統(tǒng)下土壤質(zhì)量和利用效率。本研究對(duì)環(huán)青海湖地區(qū) 4種不同土地利用方式下土壤原核生物進(jìn)行研究，闡明高寒地區(qū)不同生境下土壤原核生物群落對(duì)土地利用方式的響應(yīng)過程與特點(diǎn)，不同生境的土壤由于人類干擾和植物覆蓋不同等方面差異可能導(dǎo)致土壤化學(xué)性質(zhì)和養(yǎng)分情況存在一定的差異。在環(huán)青海湖農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)，4種不同生境（農(nóng)田，牧場，草地和山地）土壤的化學(xué)性質(zhì)及養(yǎng)分狀況存在顯著差異，不同生境土壤化學(xué)性質(zhì)和養(yǎng)分狀況不同使得微生物群落結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性也存在一定的差異。本研究顯示，土壤中的SOC、TN、AN、AK都表現(xiàn)為在XSo土壤中含量最高，由于人為干擾，在土壤中施肥導(dǎo)致土壤礦化，全氮含量減少，同時(shí)外源養(yǎng)分也影響了Olsen-P的含量；農(nóng)田收獲和牧場放牧可能導(dǎo)致土壤中的有機(jī)碳含量降低。同時(shí)，土壤各項(xiàng)化學(xué)性質(zhì)和養(yǎng)分指標(biāo)也受到植株生長和氣候條件等方面的顯著影響（孫小麗等，2015）。

在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，合理施肥可以促進(jìn)土壤有機(jī)碳、氮的積累，并驅(qū)動(dòng)著農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)演變（Cruz et al.，2009），在本研究中，農(nóng)田（QSo）土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性最高且達(dá)到顯著水平，可能是農(nóng)田土壤的外源性養(yǎng)分輸入影響了土壤理化性質(zhì)和植物生長發(fā)育，進(jìn)而改變了土壤細(xì)菌多樣性（Wei et al.，2008）。土壤古菌的Chao1指數(shù)在山地（XSo）土壤中顯著增加，而Shannon指數(shù)在草地（DSo）、農(nóng)田（QSo）和山地（XSo）中較高，僅在山地（XSo）Shannon指數(shù)達(dá)到了顯著較高水平。這可能由于山地（XSo）土壤中的可利用的SOC顯著較高，增加了土壤中古菌群落的豐富度和多樣性。土壤中的有機(jī)物很大一部分來源于植物凋落物和根系分泌物，這為土壤中的微生物提供了豐富的養(yǎng)分，山地的植被生物量較大，對(duì) SOC有較大影響（楊玉盛等，1998；秦杰等，2015）。在4種不同生境土壤中，細(xì)菌的豐富度和多樣性指數(shù)均高于古菌的指數(shù)，表明古菌生態(tài)位的限制多于細(xì)菌，古菌對(duì)環(huán)境因子的利用限制性更高，Aller et al.（2010）也比較多種環(huán)境中細(xì)菌與古菌多樣性的均表現(xiàn)為細(xì)菌的多樣性高于古菌，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與其一致。

原核生物群落的生態(tài)位分化主要體現(xiàn)在門水平上，何馨竹等（2021）在環(huán)青海湖農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)的4種不同生境土壤細(xì)菌群落中，Proteobacteria、Actinobacteria、Acidobacteria、Gemmatimonadetes和Chloroflexi普遍存在于每一個(gè)生境的土壤中，它們也作為優(yōu)勢菌群出現(xiàn)在各類生境尤其是高寒土壤細(xì)菌群落（Hartmann et al.，2006；Hollister et al.，2010；Will et al.，2010；孫懷博，2013；候曉翠，2014；楊媛媛，2019），表明這些菌種可以很好地適應(yīng)不同生境。不同生境間土壤細(xì)菌的群落組成結(jié)構(gòu)存在顯著差異，在農(nóng)田（QSo）與山地（XSo）中 Proteobacteria的豐度最高且與其他生境相比到達(dá)顯著水平，Proteobacteria作為嗜營養(yǎng)型菌（Singh et al.，2010），更易于在農(nóng)田和凍土等植物凋落物積累的土壤中占據(jù)更廣泛的生態(tài)位。Bacteroidetes作為農(nóng)田（QSo）土壤中的獨(dú)有優(yōu)勢種也可能受到土壤養(yǎng)分和農(nóng)田作物根系分泌物的影響，而Actinobacteria在農(nóng)田（DSo）和牧場（LSo）兩種草地和牧場生境中占有最高的群落豐度，Actinobacteria作為富營養(yǎng)型細(xì)菌的代表，對(duì)土壤營養(yǎng)條件要求高并且對(duì)環(huán)境響應(yīng)敏感，已有研究表明有效磷和堿解氮對(duì) Actinobacteria的數(shù)量、種類分布都有顯著影響（趙卉琳，2008），該結(jié)果進(jìn)一步表明在環(huán)青海湖農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)牧場和草地的土壤養(yǎng)分較為充足。Gemmatimonadetes和Chloroflexi的相對(duì)豐度在農(nóng)田（DSo）中最高而Nitrospirae在山地（XSo）和牧場（LSo）中相對(duì)豐度較高。前人的研究表明Gemmatimonadetes能很好地適應(yīng)各類生態(tài)系統(tǒng)，對(duì)土壤酶活性有積極響應(yīng)，且在水分含量較低的環(huán)境更具有優(yōu)勢（Fawaz，2013；馮慧琳等，2021），Chloroflexi由于營養(yǎng)方式和代謝途徑的多樣性能參與土壤中碳、氮、硫多種循環(huán)因而也普遍存在于各類土壤中（鮮文東等，2020），在環(huán)青海湖農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)，本研究采集土壤樣品中的TN和AN含量較高，促進(jìn)了Nitrospirae的繁殖。土壤微生物群落對(duì)pH變化響應(yīng)敏感，pH值作為重要因素之一顯著影著響土壤微生物群落組成結(jié)構(gòu)（Bartram et al.，2014；Feng et al.，2014）。本研究中土壤細(xì)菌群落中 Acidobacteria的相對(duì)豐度與土壤pH值呈顯著相關(guān)，隨著pH的降低Acidobacteria的豐度呈現(xiàn)顯著增加趨勢，該結(jié)果與前人研究結(jié)果一致（Jones et al.，2009；Shen et al.，2013）。在本實(shí)驗(yàn)中，不同生境之間土壤的pH值存在顯著差異，但是Acidobacteria的豐度卻沒有顯著性差異，可能是由于Acidobacteria的豐度除了受pH值得影響，還受到其他環(huán)境因子的共同作用，控制原核生物群落結(jié)構(gòu)和組成的機(jī)理機(jī)制還需要進(jìn)一步探究。本實(shí)驗(yàn)中，土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與pH、SOC、TN、Olsen-P、AN、AK含量和碳氮比都具有顯著相關(guān)關(guān)系。在 4種生境的土壤古菌群落中，Thaumarchaeota和 Euryarchaeota是古菌群落中的兩大主要門類。在前人的研究中，高寒凍土區(qū)優(yōu)勢古菌中包含 Euryarchaeota和 Crenarchaeota，在高寒草甸和高寒沼澤區(qū)Crenarchaeota都廣泛分布（吳尊鳳等，2012；李月嬌等，2015；黨寧，2020）。土壤古菌群落受到生境中的多種環(huán)境因子影響，環(huán)境因子中的pH值、SOC、TN、Olsen-P、AN、AK和碳氮比都顯著作用于土壤古菌的群落組成。在4種不同生境土壤中，土壤環(huán)境因子的差異是影響土壤原核生物的群落組成結(jié)構(gòu)和功能上的差異主要控制因素，反過來，關(guān)鍵微生物群落的差異也可作為土壤化學(xué)性質(zhì)和養(yǎng)分狀況的生物學(xué)參考指標(biāo)。

利用分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)對(duì) 4種不同生境土壤中原核生物群落相互作用進(jìn)行研究，與細(xì)菌分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)相比，古菌網(wǎng)絡(luò)的連接數(shù)和節(jié)點(diǎn)數(shù)都明顯較少，表明在同一生境古菌的生態(tài)位限制更高，古菌網(wǎng)絡(luò)更易因環(huán)境因子的變化影響網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)（Kitano，2004；Wang et al.，2016；汪峰等，2014）。網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)和連接數(shù)表現(xiàn)了網(wǎng)絡(luò)的規(guī)模和關(guān)系復(fù)雜程度。在4個(gè)不同生境的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)中，農(nóng)田（QSo）和山地（XSo）的連接數(shù)更高，表明土壤細(xì)菌物種間的聯(lián)系更加復(fù)雜，網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性更高；并且在這2個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，Proteobacteria的節(jié)點(diǎn)數(shù)和連接數(shù)較高，這表明 Proteobacteria作為嗜營養(yǎng)菌在養(yǎng)分較高的環(huán)境中種間交互作用增加，而在草地（DSo）與牧場（LSo）中放線菌門Actinobacteria占主導(dǎo)地位。在古菌網(wǎng)絡(luò)中山地（XSo）的連接數(shù)高于其他三者，可能由于古菌在養(yǎng)分充足，缺少人為干擾的環(huán)境能更好地定殖并維持群落的結(jié)構(gòu)。這表明土壤化學(xué)性質(zhì)、養(yǎng)分含量差異能夠影響土壤中原核生物群落結(jié)構(gòu)和不同菌種間的相互作用，這與李冰等（2020）研究對(duì)于不同土地利用方式土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤性質(zhì)的關(guān)系得到的結(jié)果具有一致性。網(wǎng)絡(luò)中的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)可以用來表征微生物之間的相關(guān)關(guān)系，微生物間生態(tài)位一致或存在共生關(guān)系呈現(xiàn)正相關(guān)，若存在競爭或捕食關(guān)系則呈負(fù)相關(guān)（Layeghifard et al.，2017）。本實(shí)驗(yàn)中，在農(nóng)田（QSo）和山地（XSo）土壤中細(xì)菌間正相關(guān)關(guān)系占大部分，尤其在農(nóng)田（QSo）中，僅有正相關(guān)，表明在這 2種生境中土壤細(xì)菌群落間的合作關(guān)系大于競爭關(guān)系；在古菌群落中，山地（XSo）的古菌群落的正相關(guān)關(guān)系較多，農(nóng)田（QSo）中以負(fù)相關(guān)關(guān)系為主，而草地（DSo）和牧場（LSo）中正負(fù)關(guān)系相當(dāng)，這表明在農(nóng)田、草地和牧場3種生境土壤中古菌間資源競爭更加激烈。與之相似，Barberán et al.（2012）研究發(fā)現(xiàn)151個(gè)土壤樣品構(gòu)成的細(xì)菌分子網(wǎng)絡(luò)中，同一個(gè)門的OTUs趨向于彼此高度連接，表明細(xì)菌的親緣關(guān)系越近越趨于彼此連接發(fā)生相互作用。

4 結(jié)論

環(huán)青海湖農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)不同生境之間土壤化學(xué)性質(zhì)和養(yǎng)分狀況存在顯著差異，人為干擾會(huì)引起土壤礦化使得有機(jī)養(yǎng)分含量降低，同時(shí)影響土壤中速效養(yǎng)分的含量。而不同生境土壤中原核微生物的豐度和多樣性受到 pH、SOC、TN、AN、AK、C/N和Olsen-P影響顯著，其中，農(nóng)田土壤中細(xì)菌群落的豐度和多樣性顯著最高，古菌群落多樣性表現(xiàn)為在山地土壤中群落豐度和多樣性顯著較高。細(xì)菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌門在不同生境中存在一定差異，主要表現(xiàn)在 QSo中的特有優(yōu)勢細(xì)菌菌門為Bacteroidetes，XSo和LSo中Nitrospirae也是其中的優(yōu)勢細(xì)菌類群，古菌群落表現(xiàn)為DSo和XSo的優(yōu)勢菌群包括兩種，分別是 Euryarchaeota和Thaumarchaeota，而QSo和LSo的優(yōu)勢菌門僅有一種為Thaumarchaeota。不同生境中土壤原核微生物的種間相互作用關(guān)系存在差異，菌種間的物質(zhì)信息交流頻率不同，原核微生物網(wǎng)絡(luò)中低豐度菌門同樣具有重要作用。

4種土壤類型中細(xì)菌和古菌的菌群豐度和多樣性都處于不飽和狀態(tài)，說明在環(huán)青海湖農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)的高寒生態(tài)土壤中存有大量未被認(rèn)知的原核生物群落和物種資源。為了獲得更為完善的原核生物群落信息，充分發(fā)掘新物種的潛力，在今后的研究中還需加大采樣的數(shù)量、加大測序廣度和深度。此外，冗余分析結(jié)果顯示原核生物群落結(jié)構(gòu)與 4種不同土壤類型成對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明環(huán)青海湖農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)地上生物因素與非生物因素一起控制著原核生物的群落豐度、多樣性和組成結(jié)構(gòu)。綜上，本研究揭示了環(huán)青海湖農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)原核生物群落的豐度和多樣性，初步闡明土壤類型—原核生物群落的相互作用、相互影響的關(guān)系，為農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)土壤質(zhì)量和可持續(xù)發(fā)展提供了理論依據(jù)。