壯骨止痛解郁方對RAD模型大鼠行為學(xué)及FKN/CX3CR1信號通路的影響

藺曉源，劉檢，孟盼，劉平安，*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種極易致殘的慢性免疫性疾?。?］。RA 所致的關(guān)節(jié)損傷、功能受限等均可導(dǎo)致患者產(chǎn)生精神癥狀，其中以抑郁最為常見。目前，我國RA 的患病率為0.42%，患病人數(shù)達(dá)500 萬［2］，其中約有40%～60%的RA 患者伴有不同程度的抑郁癥狀［3］。RA 伴發(fā)抑郁癥（rheuma?toid arthritis with depression，RAD）嚴(yán)重影響了人們的身心健康和生活質(zhì)量，因此，開展RAD 的防治研究具有重要意義。目前，西醫(yī)治療RAD 尚無特效藥，且存在明顯的不良反應(yīng)。而中醫(yī)藥立足整體，通過辨證論治RAD 優(yōu)勢則更為明顯。RAD 屬中醫(yī)學(xué)中痹病合并郁證的范疇，為虛實夾雜之證，具有“虛、瘀、郁”的中醫(yī)病機特點。課題組立補腎祛寒、活血通絡(luò)、疏肝解郁的治法，創(chuàng)壯骨止痛解郁方治療效果顯著，但其作用機制未明。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)炎癥誘發(fā)的小膠質(zhì)細(xì)胞（MG）活化損傷海馬神經(jīng)元與RAD 的發(fā)生密切相關(guān)，而TNF－α 是破壞血腦屏障完整性并誘發(fā)RAD 神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵因素，高水平的TNF－α 可通過促進趨化因子Fractalkine（FKN）的釋放，導(dǎo)致FKN 受體CX3CR1 異常表達(dá)介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生［4－5］。因此，本研究觀察了壯骨止痛解郁方對RAD 模型大鼠TNF－α、FKN 及CX3CR1 的影響，以期為RAD 的有效防治提供新的思路和靶點。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠40 只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2016－002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 實驗動物中心，飼養(yǎng)溫度22～26 ℃，濕度50%～60%。

1.2 實驗藥物

壯骨止痛解郁方由補骨脂15 g，淫羊藿10 g，枸杞子15 g，女貞子15 g，狗脊10 g，骨碎補10 g，牛膝10 g，姜黃10 g，貫葉連翹15 g，人參10 g 和柴胡10 g 組成。中藥飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，其湯劑按傳統(tǒng)方法煎煮后濃縮成生藥含量為2.64 g/mL 的藥液備用。甲氨蝶呤片（2.5 mg/片，上海信誼藥廠有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020644），用純凈水配制成0.1 mg/mL的藥液備用。鹽酸氟西汀膠囊（20 mg/粒，禮來蘇州制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20170022），用純凈水配制成0.2 mg/mL濃度的藥液備用。

1.3 主要試劑與儀器

弗氏完全佐劑、牛Ⅱ型膠原蛋白（Sigma，BJ－012－0392、C7806）；大鼠TNF－α、FKN ELISA 試劑盒（Abcam，ab46070、ab229890）；CX3CR1 兔抗多克隆抗體（Abcam，ab8021）；高速冷凍離心機（Z32HK，賀默）；多功能酶標(biāo)儀（Enspire，Perkinelmer）；輪轉(zhuǎn)式切片機（BIOCUT，Leica）；熒光顯微鏡（BX43，奧林巴斯）。

2 方法

2.1 動物分組與模型制備

大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)3 d后，隨機分為空白組、模型組、西藥組和中藥組。除空白組外，其余各組參考相關(guān)文獻(xiàn)［6］在第1 天給右后足底皮內(nèi)注射Ⅱ型膠原蛋白－弗氏完全佐劑乳劑（0.1 mL/只）進行初次免疫，第7 天在尾根部再次注射建立RA 模型。然后再給予4 周慢性不可預(yù)知的應(yīng)激加孤養(yǎng)建立RAD 模型，應(yīng)激因素包括夾尾1 min、4 ℃冰水浴5 min、45 ℃熱刺激5 min、超聲波噪音8 h、潮濕墊料24 h、傾籠45° 24 h、晝夜顛倒24 h 共7 種刺激方法（每天采用一種，同種刺激兩天不連續(xù)出現(xiàn)）［7］。

2.2 給藥方法與標(biāo)本取材

中藥組大鼠按26.4 g/（kg·d）劑量（2 倍成人等效劑量）每天灌胃壯骨止痛解郁方藥液1 次，西藥組按1.0 mg/（kg·d）劑量每3 天灌胃甲氨蝶呤藥液1 次、2.0 mg/（kg·d）劑量每天灌胃氟西汀藥液1 次（成人等效劑量），模型組給予蒸餾水，空白組常規(guī)飼養(yǎng)。各組灌胃體積量均為10 mL/kg，在應(yīng)激造模的同時連續(xù)給藥28 d。大鼠在最后一次灌胃后麻醉，冰盒上心臟采血，離心后取上層血清放置－80 ℃冰箱保存；斷頭取腦，生理鹽水漂洗后放入多聚甲醛中固定。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 動物行為學(xué)檢測

糖水偏好實驗評價大鼠的快感缺失情況。參照文獻(xiàn)［8］，實驗開始前3天訓(xùn)練大鼠適應(yīng)1%的蔗糖水，前1天禁水24 h，觀測時給予每只大鼠100 mL的1%蔗糖水和純凈水各1 瓶，1 h 后記錄大鼠的蔗糖水消耗量和純凈水消耗量，計算糖水偏好率。

糖水偏好率=蔗糖水消耗量/（蔗糖水消耗量+純凈水消耗量）×100%

曠場實驗評價大鼠的自主活動行為。參照文獻(xiàn)［9］，將黑色敞箱（80 cm × 80 cm × 40 cm）底部平均分為25 個方格，把大鼠放入敞箱中央?yún)^(qū)域，適應(yīng)1 min后，記錄4 min 內(nèi)大鼠水平與垂直得分（四肢每次全部經(jīng)過方格則水平得分加1；前兩肢每次騰空或攀附在箱壁上則垂直得分加1），以水平和垂直總得分為最后得分。

2.3.2 ELISA法檢測血清TNF－α、FKN含量

取每組的10 個血清樣本按ELISA 試劑盒說明進行稀釋、加樣、溫育、洗滌、顯色、中止等操作，酶標(biāo)儀450 nm 波長測量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各樣本TNF－α、FKN的含量。

2.3.3 免疫組化法檢測腦內(nèi)CX3CR1的陽性表達(dá)

每組隨機取出5 個腦組織樣本，按免疫組化操作步驟進行脫水，石蠟包埋，切片，一抗（CX3CR1 抗體）、二抗孵育，DAB 顯色，復(fù)染，透明，封片。顯微鏡選取陽性表達(dá)不重復(fù)的3 個視野拍片，用圖像分析系統(tǒng)計算CX3CR1免疫陽性表達(dá)的平均光密度值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 大鼠糖水偏好和曠場實驗

與空白組比較，模型組大鼠糖水偏好率和自主活動得分均顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠糖水偏好率和自主活動得分均明顯升高（P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠自主行為學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠自主行為學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：與空白組比較，＃P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01。

組別空白組模型組西藥組中藥組n 10 10 10 10糖水偏好率（%）76.37±6.28 50.69±5.07＃73.82±6.11▲69.23±5.85▲自主活動得分（分）42.23±7.41 12.69±3.12＃28.78±5.23▲25.07±5.80▲

3.2 大鼠血清TNF－α、FKN含量

與空白組比較，模型組大鼠血清TNF－α、FKN 含量均明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠血清TNF－α、FKN 含量均顯著減少（P<0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF－α、FKN含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠血清TNF－α、FKN含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，＃P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01。

組別空白組模型組西藥組中藥組n 10 10 10 10 TNF－α 110.29±21.46 216.72±36.18＃142.66±27.04▲159.84±28.37▲FKN 101.16±19.08 175.43±32.25＃132.09±21.24▲141.22±26.83▲

3.3 大鼠腦內(nèi)CX3CR1陽性表達(dá)

與空白組比較，模型組大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)域CX3CR1 免疫陽性細(xì)胞表達(dá)呈棕黃色染色，主要表達(dá)于胞質(zhì)中，其平均光密度值明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥組和西藥組大鼠腦內(nèi)CX3CR1 免疫陽性細(xì)胞表達(dá)的平均光密度值均顯著降低（P< 0.01）。見表3、圖1。

圖1 各組大鼠腦內(nèi)CX3CR1蛋白陽性表達(dá)（DAB，×200）

表3 各組大鼠腦內(nèi)CX3CR1蛋白陽性表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠腦內(nèi)CX3CR1蛋白陽性表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，＃P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01。

組別空白組模型組西藥組中藥組n5 5 5 5 CX3CR1 0.21±0.04 0.65±0.13＃0.37±0.05▲0.41±0.08▲

4 討論

在RA 前期過程中，激活的T細(xì)胞可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的TNF－α 等致炎因子，促使成纖維滑膜細(xì)胞過度增殖而損傷骨關(guān)節(jié)［10］。實驗研究也已證實，RA模型大鼠血清中TNF－α 含量明顯高于正常大鼠［11］。隨著研究的深入則發(fā)現(xiàn)，小鼠腦室內(nèi)給予TNF－α 后，在懸尾實驗和強迫游泳中均可產(chǎn)生抑郁樣行為，而給予抗TNF－α 抗體后則產(chǎn)生了抗抑郁效應(yīng)［12］。更為重要的是，TNF－α 作為RA 滑膜炎癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，可提升FKN 的表達(dá)［13］。臨床研究顯示，隨著RA 患者外周血和滑膜中TNF－α 含量的增高，F(xiàn)KN 也明顯升高［14］；RA 患者經(jīng)治療后血清中FKN 水平較其治療前明顯下降［15］。MG 在抑郁癥患者海馬內(nèi)明顯活化，RA狀態(tài)下海馬內(nèi)皮血管破壞，血腦屏障通透性增加，外源性FKN 可誘導(dǎo)MG 增殖和趨化來擴大炎癥損傷，進而影響神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能以誘發(fā)抑郁癥［16］。FKN的唯一受體CX3CR1 是一種跨膜高親和力受體，可介導(dǎo)FKN 的黏附和遷移，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要表達(dá)于MG 和神經(jīng)元上。研究發(fā)現(xiàn)，正常小鼠滑膜組織內(nèi)FKN 和CX3CR1的表達(dá)均較低，但RA 小鼠滑膜內(nèi)出現(xiàn)大量CX3CR1+的巨噬細(xì)胞，F(xiàn)KN 的表達(dá)也被明顯上調(diào)［17］。筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠海馬中TNF－α 含量和小膠質(zhì)細(xì)胞CX3CR1 蛋白表達(dá)均顯著升高［7］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清TNF－α、FKN 含量增加，腦內(nèi)海馬區(qū)域CX3CR1 免疫陽性表達(dá)升高，提示Ⅱ型膠原蛋白－弗氏完全佐劑乳劑和慢性不可預(yù)知的應(yīng)激加孤養(yǎng)建立的RAD 模型可以誘發(fā)FKN/CX3CR1信號通路的激活。

RAD 屬痹病合并郁證的范疇。痹病雖有行痹、痛痹、著痹之分，但RA 出現(xiàn)的關(guān)節(jié)腫大、僵硬、變形等與中醫(yī)的尪痹相符，為虛實夾雜之證。以正虛為內(nèi)在條件，其中又以腎虛為要?！蹲C治準(zhǔn)繩》明確指出：“痹病有風(fēng)、有濕、有寒、有熱……皆標(biāo)也；腎虛，其本也”。在腎虛基礎(chǔ)上，氣血不運、瘀血留滯又為痹病的病理關(guān)鍵［18］。因此，RA 發(fā)病機制多為腎虛血瘀，其基本病機可用“虛、瘀”概括。郁證病始在肝，與腦相關(guān)。若情志不遂，肝郁失疏，氣血運行不暢，則瘀結(jié)于內(nèi)，不得宣泄，上犯清竅，神明失用，發(fā)為抑郁。因此，郁證的基本病機可用“瘀、郁”來概括［19］。而肝腎同源、腎通于腦，尪痹之腎虛血瘀可致元神失養(yǎng)，郁證產(chǎn)生；郁證之肝郁氣滯又可加重尪痹之腎虛血瘀。故尪痹與郁證互為因果，相兼為病。因此，RAD 的基本病機可用“虛、瘀、郁”概括。筆者基于該病機特點，創(chuàng)壯骨止痛解郁方療效顯著。該方以壯骨止痛方合百事樂方加柴胡而成，其中，壯骨止痛方是湖南省名老中醫(yī)的臨床經(jīng)驗方，已獲得國家新藥證書（國藥準(zhǔn)字Z20050125）［20］，而百事樂方是本課題組研發(fā)的具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的抗抑郁中藥復(fù)方（專利號CN101816766A）［21］。方中補骨脂溫腎助陽為君。臣以淫羊藿，助君藥溫補腎陽，又有強筋健骨之功；柴胡疏肝理氣；姜黃活血行氣，主治血瘀氣滯諸證；狗脊補肝腎、強腰膝。佐以枸杞子、女貞子，滋補肝腎之陰精，助肝腎之陽以化生［22］；貫葉連翹活血解郁；骨碎補續(xù)傷止痛、通經(jīng)活絡(luò)、補中寓通、補而不滯。人參功善補氣、安神，用為佐使；伍以川牛膝，亦逐瘀通經(jīng)，且引藥下行增強藥效，為引經(jīng)使藥。全方共奏補腎祛寒、活血通絡(luò)、疏肝解郁之功效。

本研究結(jié)果顯示，中藥組大鼠糖水偏好率和自主活動得分均明顯升高，表明壯骨止痛解郁方可改善RAD 模型大鼠的抑郁樣行為。與模型組比較，中藥組大鼠血清TNF－α 的水平明顯降低，說明壯骨止痛解郁方的抗抑郁作用可能與其抗炎作用有關(guān)；而中藥組大鼠血清FKN 的含量減少，以及腦內(nèi)CX3CR1 免疫陽性表達(dá)的降低，表明壯骨止痛解郁方對RAD 大鼠FKN/CX3CR1信號通路具有明顯的抑制作用。以上研究可為壯骨止痛解郁方臨床防治RAD 提供實驗依據(jù)，但其抗神經(jīng)炎癥治療RAD 的作用機制仍有待深入研究。