電針調(diào)節(jié)AKT/NF-κB信號通路炎癥反應(yīng)修復(fù)受損腸黏膜屏障的機(jī)制研究

張玉潔，裴麗霞，周俊靈，吳曉亮，陳璐，郭靜，孫夢珠，孫建華*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210029）

腸易激綜合征（IBS）是一種常見的胃腸疾病，患者往往存在慢性腹痛并伴有腹瀉/便秘和/或腹脹的臨床表現(xiàn)，屬“腹痛”“腹瀉”“便秘”范疇。根據(jù)世界各國的人口研究，腸易激綜合征的患病率為1.1%～45%，全球綜合患病率為11.2%，據(jù)報道，大多數(shù)國家的患病率為5%～10%［1］。患病后嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而IBS 屬于功能性腸病，目前臨床尚未有效果較好的藥物治療方案，因此，明確治療IBS 的有效治療手段是當(dāng)下及未來重要的研究方向。

IBS 發(fā)病原因尚不明確，但有高達(dá)1/4 的患者在感染過程后發(fā)?。?］，與炎癥造成的影響密不可分，IBS 可能是一種炎癥性疾?。?］。部分研究表明，IBS 腹痛、腹瀉的癥狀可能與腸道通透性增加存在聯(lián)系，腸上皮作為外部環(huán)境和受到嚴(yán)密調(diào)控的內(nèi)部環(huán)境之間的屏障的能力至關(guān)重要。

AKT 是三絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員之一［4］，在細(xì)胞存活和凋亡中發(fā)揮重要作用，AKT 相關(guān)通路聚集了炎癥和代謝信號，其中AKT1 水平對炎癥反應(yīng)的激活至關(guān)重要。NF-κB 是參與調(diào)節(jié)腸道通透性的關(guān)鍵信號分子。因此，AKT 磷酸化增加上調(diào)了NFκB 通路，促進(jìn)了NF-κB 的活化，可能是腸道屏障損傷的關(guān)鍵病理因素［5］。

針灸是中醫(yī)學(xué)的一個重要組成部分。針灸作為中醫(yī)的外治法，其作用是通過刺激穴位來達(dá)到相應(yīng)的治療效果。動物實驗研究［6］顯示，電針干預(yù)可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，臨床研究［7］證明針灸在減輕腸易激綜合征癥狀方面療效顯著，而且無明顯的不良反應(yīng)。本團(tuán)隊前期研究也證實了電針能緩解IBS 患者臨床癥狀［8］。因此本研究中，筆者觀察了電針對避水應(yīng)激（WAS）誘導(dǎo)的腸易激小鼠模型結(jié)腸組織炎癥因子AKT、NF-κB 等炎癥因子的變化以及腸屏障蛋白Claudin1、Occludin、ZO-1的變化，并探討了其在炎癥釋放腸黏膜屏障受損中的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

所有動物均為南京中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物實驗中心提供，實驗經(jīng)過動物管理和使用委員會的審查和批準(zhǔn)。實驗動物飼養(yǎng)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗中心SPF級動物操作室，實驗動物使用許可證號：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)環(huán)境為12 h 明暗交替，溫度24～26 ℃，濕度60%～70%，動物自由攝食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表將30只10周齡雄性c57小鼠分為對照組、模型組和治療組，每組10只。

1.2 主要儀器與試劑

勻漿器JJ-2B（金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；漩渦振蕩儀（上海雷磁漩渦混勻儀HY-1）；Loading Buffer（北京雷根生物技術(shù)有限公司，NA0007）；電熱恒溫水槽（上海銳析儀器設(shè)備有限公司，DKZ-2B）；玻璃板（美國伯樂，1653308）；電泳梳子（美國伯樂，1653354）；電泳緩沖液（美國伯樂，1610737）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司，DYCP-32C）；轉(zhuǎn)膜緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，P0021）；甲醇（國藥集團(tuán)，100141190）；1×TBST（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，p0231）；凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司，WD-9413C）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA，RR047A）；qRT-PCR 試劑盒（TA?KARA，RR420A）；Trizol life（155960181）；-80 ℃低溫冰箱（美國紐艾爾公司，型號Nu-6511）；液氮罐（美國CBS公司，型號2001）；徠卡倒置熒光顯微鏡（德國徠卡公司，型號DM1L）；微量離心機(jī)（美國Beckman 公司，型號MSD97K49）；純水儀（美國Spring 公司，型號S/N 020579）；制冰機(jī)（SCORTSMAN，型號AF10）；電子天平（德國賽多利斯有限公司，型號BT323S）；冰箱（德國西門子公司，型號KG18V21TI）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號KA1000）；酶標(biāo)儀（美國Biotek，型號Synergy2）；核酸蛋白分析儀（美國BECKMAN 公司，型號DU640）；實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad，型號IQ5TM）；電泳槽（美國Bio-Rad 公司，型號525BR027843）；搖床（南京大學(xué)南達(dá)生物技術(shù)開發(fā)公司，型號TY-80S）；封口機(jī)（上海麥爾多機(jī)械有限公司，型號FP-300）；凝膠成像系統(tǒng)（美國Protein Simple 公司）；0.19 mm×10 mm 毫針（蘇州華佗醫(yī)療器械廠）；HANS-200A電針儀（南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）。

1.3 干預(yù)方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，采用避水應(yīng)激法（WAS）造模2周。造模成功后，于每日上午10∶00電針治療。治療組選雙側(cè)“天樞”和“足三里”，針刺深度5 mm，接HANS-200A 電針儀，示波監(jiān)視器檢測電流強(qiáng)度為0.5～1.0 mA，疏密波，2 Hz/15 Hz，電針15 min，每日1 次，連續(xù)治療10 d。模型組和對照組用同樣鼠夾固定但不予電針。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 腹壁回撤反射

腹壁回撤反射（AWR）是用腹部退縮反射來評估大鼠的內(nèi)臟敏感性的一種方法。大鼠在評估前禁食12 h，用異氟烷短暫麻醉小鼠，將球囊導(dǎo)管（6-Fr，2 mm外徑）經(jīng)直腸插入小鼠結(jié)腸。醒來后適應(yīng)1 h 后，逐步進(jìn)行結(jié)腸直腸擴(kuò)張。每20 s 的擴(kuò)張后休息30 s。擴(kuò)張程度依次為20、40、60、80 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa），重復(fù)3次，并在評估AWR后將氣球放氣和收回。為了提高準(zhǔn)確性，兩名對隨機(jī)分組不知情的研究人員記錄每種壓力下的AWR評分，當(dāng)達(dá)到兩次最高評分即停止擴(kuò)張。

AWR 評分：對結(jié)腸直腸擴(kuò)張無行為反應(yīng)計0 分；短暫的頭部運(yùn)動后不動計1 分；腹肌收縮計2 分；提腹計3分；身體拱起和骨盆結(jié)構(gòu)抬升計4分。

1.4.2 HE染色

取材：石蠟切片、脫蠟覆水，依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ10 min、無水乙醇Ⅱ10 min、95%酒精5 min、90%酒精5 min、80%酒精5 min、70%酒精5 min、蒸餾水洗。蘇木素染細(xì)胞核：切片入Harris 蘇木素染3～8 min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗。伊紅染細(xì)胞質(zhì)：切片入伊紅染液中染色1～3 min。脫水封片：將切片依次放入95%酒精I(xiàn) 5 min、95%酒精Ⅱ5 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min 中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片。顯微鏡鏡檢，進(jìn)行圖像采集分析。染色結(jié)果：細(xì)胞核藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)紅色。

1.4.3 ELISA法檢測IL-6α、TNF-α和IL-1β水平

小鼠摘眼球取血后離心分離血漿，保存于-80 ℃，待分析。嚴(yán)格按照廠家（研發(fā)系統(tǒng)）的說明書進(jìn)行IL-1β、IL-6α 和TNF-α 的ELISA 檢測。稀釋后的樣品首先用生物素化單克隆抗體孵育，然后用鏈霉親和素-hrp 和底物孵育，最后用完成液孵育。使用ELISA酶標(biāo)儀檢測每個樣品的光密度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-6α、TNF-α和IL-1β的濃度。

1.4.4 Western Blot 法檢測遠(yuǎn)端結(jié)腸中AKT、p-AKT、NF- κBp65、p-NF- κBp65、IKKα、IKKβ、Claudin1、Occludin、ZO-1轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白

取-80 ℃凍存的各組小鼠30 mg 組織剪碎后研磨3 min，以16 100×g4 ℃離心15 min 后取上清，按BCA法測定蛋白濃度，計算并配置上樣蛋白混合液再以112×g低溫離心1 min 后行10 min 95 ℃水浴，加到配好的凝膠中，繼續(xù)70 V 預(yù)電泳和120 V 分離膠電泳；切膠后行250 V 轉(zhuǎn)膜；將條帶放入5%脫脂奶粉溶液后進(jìn)行2 h 室溫封閉；清洗3 次后加入一抗AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000）、NF-κBp65（1∶1 000）、p-NF-κBp65（1∶1 000）、IKKα（1∶1 000）、IKKβ（1∶1 000）、Claudin1（1∶1 000）、Occludin（1∶1 000）、ZO-1（1∶1 000）在4 ℃冰箱里孵育13 h；清洗3次后加入二抗室溫孵育1 h；清洗3次后，每個條帶加發(fā)光液后進(jìn)行暗室發(fā)光彩圖，以GAPDH為內(nèi)參，用Image-Pro Plus6.0軟件分析并計算目的條帶與內(nèi)參的灰度值比值代表目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.4.5 熒光定量PCR 法檢測遠(yuǎn)端結(jié)腸中AKT、p-AKT、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKKα、IKKβ、Claudin1、Occludin、ZO-1 mRNA的表達(dá)

各組小鼠取30 g 結(jié)腸組織剪碎研磨后使用Trizol法提取總RNA，測定樣本總RNA 濃度，純度和污染值。篩選合格RNA后按RR037A反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟配置RNA 的反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，37 ℃15 min，85 ℃5 s，降至4 ℃后取出。96 孔板加樣，標(biāo)板，上機(jī)行PCR反應(yīng)：90 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃1 min，共40 個循環(huán)。用CFX manager 3.1 軟件獲取Ct值。以2－△△Ct法計算目的mRNA 的相對表達(dá)量。實驗中使用的引物見表1。

表1 熒光定量PCR法引物序列

1.4.6 免疫熒光單標(biāo)法檢測結(jié)腸上皮組織Claudin1、Occludin和ZO-1的表達(dá)

普通石蠟切片3% H2O2室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS 浸泡2 次，每次5 min；5%～10% 山羊血清封閉，室溫孵育10 min，一抗4 ℃過夜，熒光二抗37 ℃孵育10～30 min，沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 版統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。如果各組數(shù)據(jù)正常且方差齊次，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行分析，然后采用LSD進(jìn)行組間比較；若各組不服從正態(tài)檢驗，采用非參數(shù)檢驗，再進(jìn)行兩組間比較。P<0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AWR評分比較

造模后，模型組與對照組相比，AWR 評分明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；治療組與模型組相比，AWR 評分降低（P<0.05）。電針治療結(jié)束后，與模型組比較，治療組AWR 評分明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

圖1 各組小鼠不同時段AWR評分比較

2.2 HE染色

顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組結(jié)腸組織形態(tài)大致正常，腸絨毛排列整齊，腸屏障完整；模型組和治療組可見結(jié)腸細(xì)胞組織形態(tài)嚴(yán)重改變，隱窩不同程度的消失，細(xì)胞排列不整齊，腸屏障損傷。與模型組相比，治療組隱窩消失情況減少，炎癥浸潤程度減輕。見圖2。

圖2 各組小鼠結(jié)腸病理形態(tài)學(xué)變化（HE染色，×400）

2.3 各組小鼠結(jié)腸細(xì)胞Western Blot結(jié)果

小鼠結(jié)腸組織Western Blot 結(jié)果顯示，模型組與對照組相比，AKT（P<0.001）、p-AKT（P<0.001）、NFκBp65（P<0.001）、p-NF- κBp65（P<0.001）、IKKα（P<0.001）、IKKβ（P<0.01）、Claudin1（P<0.001）、Occludin（P<0.001）、ZO-1（P<0.001）蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；治療組與模型組相比，AKT（P<0.01）、p-AKT（P<0.001）、NF-κBp65（P<0.001）、p-NF-κBp65（P<0.001）、IKKα（P<0.01）、IKKβ（P<0.05）、Claudin1（P<0.05）、Occludin（P<0.05）蛋白表達(dá)有所降低。Western Blot 蛋白表達(dá)條帶和Claudin1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)見圖3；AKT、p-AKT、NF-κBp65、IKKα、IKKβ蛋白表達(dá)見圖4。

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織Western Blot蛋白表達(dá)條帶和Claudin1、Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織AKT、p-AKT、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKKα、IKKβ蛋白表達(dá)

2.4 各組小鼠結(jié)腸細(xì)胞PCR結(jié)果

小鼠結(jié)腸組織PCR 結(jié)果顯示，模型組與對照組相比，AKT（P<0.001）、p-AKT（P<0.001）、NF-κBp65（P<0.001）、p-NF-κBp65（P<0.001）、IKKα（P<0.001）、IKKβ（P<0.001）、Claudin1（P<0.001）、Occludin（P<0.001）、ZO-1（P<0.001）mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；治療組與模型組相比，AKT（P<0.01）、p-AKT（P<0.01）、NF-κBp65（P<0.001）、p-NF-κBp65（P<0.001）、IKKα（P<0.001）、IKKβ（P<0.001）、Claudin1（P<0.05）、Occludin（P<0.01）mRNA表達(dá)降低。見圖5。

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織中AKT、p-AKT、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKKα、IKKβ、Claudin1、Occludin、p-NF-κB、ZO-1 mRNA表達(dá)

2.5 各組小鼠血清ELISA結(jié)果

小鼠結(jié)腸組織ELISA 結(jié)果顯示，模型組與對照組相比，IL-6α（P<0.001）、IL-1β（P<0.001）、TNF-α（P<0.001）表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；治療組與模型組相比，IL-6α（P<0.001）、IL-1β（P<0.001）、TNF-α（P<0.001）表達(dá)有所降低。見圖6。

圖6 各組小鼠血清Elisa中IL-6α、IL-1β、TNF-α表達(dá)

2.6 各組小鼠免疫熒光顯微鏡圖片結(jié)果

免疫熒光檢測小鼠結(jié)腸組織AKT、p-AKT、NFκBp65、p-NF-κBp65、IKKα、IKKβ、Claudin1、Occludin、ZO-1的表達(dá)，通過免疫熒光觀察小鼠肺組織上述因子的定位表達(dá)。與對照組相比，模型組AKT、p-AKT、NF-κBp65、p-NF-κBp65、IKKα、IKKβ 定位表達(dá)明顯增強(qiáng)，電針降低了其表達(dá)。與對照組相比，模型組Clau?din1、Occludin、ZO-1定位表達(dá)明顯降低，但電針組該指標(biāo)表達(dá)升高。見圖7。

圖7 各組小鼠免疫熒光顯微鏡圖像

3 討論

腸易激綜合征的發(fā)生與腸道運(yùn)動障礙、內(nèi)臟超敏反應(yīng)、腦腸互作以及免疫失調(diào)密切相關(guān)［9-11］，但生理機(jī)制目前尚不明確，在以往的研究中發(fā)現(xiàn)IBS 患者中炎癥因子上升是重要的指征之一，而炎癥也是腸屏障破壞的關(guān)鍵因素，腸屏障破壞同時也是加重IBS 的重要因素之一［12］，AKT 屬于三絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞存活和凋亡中發(fā)揮重要作用。AKT相關(guān)通路聚集了炎癥和代謝信號，其中AKT1 水平對炎癥反應(yīng)的激活至關(guān)重要［4］。已有研究表明AKT與炎癥的關(guān)系聯(lián)系密切，AKT 磷酸化的增加會使AKT1 下調(diào)，IκB 激酶（Ikkα/β）被激活，然后使IκB 蛋白磷酸化、泛素化，IκB蛋白被降解，NF-κB 二聚體得到釋放，激活，繼而導(dǎo)致下游炎癥因子TNF-α、IL-1β 和IL-6α 釋放，從而破壞腸屏障。

NF-κB 是存在于細(xì)胞內(nèi)的一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，其活化后與細(xì)胞DNA 結(jié)合，調(diào)控炎癥反應(yīng)［4］。NF-κB 的活化對腸黏膜屏障有破壞作用，是參與調(diào)節(jié)腸道通透性的關(guān)鍵信號分子。

腸上皮是腸黏膜屏障關(guān)鍵的部分，腸上皮細(xì)胞通過頂端連接復(fù)合體（包括貼壁連接和TJ）和橋粒連接在一起，黏附連接和橋粒提供了腸上皮細(xì)胞intestinal epithelial cells（IECs）之間的機(jī)械粘合強(qiáng)度。位于IECs 側(cè)膜頂端的多蛋白復(fù)合物緊密連接蛋白tight junction（TJ）通過允許水、離子和溶質(zhì)通過孔隙來調(diào)節(jié)對溶質(zhì)的選擇性細(xì)胞旁滲透性［13］。TJ 由跨膜蛋白Claudins、Occluddin、連接黏附分子（JAM）和tricellulin及胞漿支架蛋白（ZO1-3、AF-6 和扣帶蛋白）組成［14］。而炎癥狀態(tài)下TJ改變腸上皮功能出現(xiàn)明顯紊亂，TNFα 可降低腸上皮屏障的跨上皮電阻（TER），INF-γ 能下調(diào)緊密連接蛋白Occludin、ZO-1 的高表達(dá)，增加腸上皮細(xì)胞旁的通透性，引起腸屏障功能的改變。

針灸是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，作為中醫(yī)的外治療法，通過刺激穴位來疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)節(jié)氣血功能，改善機(jī)體狀態(tài)。到目前為止，大量的研究已經(jīng)證明了針灸在減輕IBS 癥狀方面的有效性，同時不良反應(yīng)小，經(jīng)濟(jì)成本低。一些Meta 分析表明，針刺加艾灸治療IBS的療效優(yōu)于西藥［15-18］。另一項臨床研究還表明，針刺增強(qiáng)并延長了規(guī)定方案治療IBS［19］的療效。天樞穴屬足陽明胃經(jīng)，為大腸募穴，具有健脾和胃、調(diào)和腸腑之功；足三里為足陽明胃經(jīng)穴，其經(jīng)脈循行“屬胃絡(luò)脾，循腹里”，可調(diào)理脾胃、通調(diào)腸腑。在IBS 治療中常選針刺天樞和足三里穴。

本團(tuán)隊先前探討IBS發(fā)生的可能機(jī)制與NF-κB密切相關(guān)［20］。同時在另一研究中表明電針可調(diào)節(jié)腸黏膜屏障黏蛋白2（Mucoprotein2，MUC2），在修復(fù)腸黏膜機(jī)械屏障損傷方面有積極作用［21］。

根據(jù)上述探討，已知NF-κB 是多種基因的多效性調(diào)節(jié)因子，參與多種促炎因子和炎癥過程相關(guān)酶的產(chǎn)生。因此在本研究中，觀察AKT 的磷酸化狀態(tài)以及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果正常小鼠通過WAS 造模后AKT、NF-κB及相關(guān)炎癥因子均表達(dá)升高，電針后上述指標(biāo)明顯下調(diào)，即說明電針天樞、足三里可以下調(diào)IBS模型相關(guān)炎癥因子，緩解IBS 炎癥反應(yīng)。檢測各組小鼠Cluadin、Occludin、ZO-1 發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠屏障蛋白表達(dá)與空白組比較明顯下降，電針治療后蛋白表達(dá)較模型組增加，但仍未恢復(fù)到空白組水平。由此可以證明，電針可以下調(diào)IBS 模型小鼠炎癥因子，主要發(fā)揮作用的位點(diǎn)是AKT。

綜上所述，電針可以顯著改善IBS 小鼠的內(nèi)臟高敏感程度，其作用機(jī)制可能是通過降低AKT 的磷酸化，下調(diào)NF-κB 表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，修復(fù)已受損的腸黏膜緊密連接蛋白，上調(diào)Cluadin1、Occludin、ZO-1 表達(dá)完成的。AKT/NF-κB 信號通路在修復(fù)腸黏膜屏障中起著至關(guān)重要的作用。