透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌中MYBL2表達(dá)及臨床意義

眭怡群，楊 芹，涂 健，楊天宇，謝佳明，張永勝

透明細(xì)胞性腎細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)起源于腎小管上皮細(xì)胞，是腎細(xì)胞癌中最常見(jiàn)且預(yù)后最差的病理類(lèi)型。目前對(duì)其的治療手段有限，主要以根治性腎切除術(shù)為主，但術(shù)后易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，致死率高。因此，探索ccRCC潛在生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的研究越來(lái)越多[1-2]。骨髓母細(xì)胞增生癥病毒癌基因同源物樣2(MYB proto-oncogene like 2, MYBL2)基因又名B-myb，定位于20q13染色體上，與A-myb、C-myb是同源基因，在增殖細(xì)胞中廣泛表達(dá)。MYBL2參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞存活和細(xì)胞分化等多種生理過(guò)程，且其過(guò)表達(dá)與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[3]。已有研究表明，在前列腺癌、肝細(xì)胞肝癌、肺癌、乳腺癌、子宮頸癌、胰腺癌、胃癌和結(jié)直腸癌[4-11]等多種腫瘤中均存在MYBL2過(guò)表達(dá)，且MYBL2過(guò)表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌、胰腺癌和胃癌患者的不良預(yù)后有關(guān)[5-7]。目前，關(guān)于MYBL2基因在ccRCC中的研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析MYBL2 mRNA和蛋白在ccRCC中的表達(dá)，探討ccRCC中MYBL2表達(dá)及臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源收集2009年10月～2019年8月蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院存檔的ccRCC手術(shù)切除標(biāo)本217例及其癌旁正常腎組織185例，所有ccRCC標(biāo)本均經(jīng)兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師復(fù)閱確診。其中位于左腎109例，右腎108例；男性149例，女性68例；患者年齡21～88歲，中位年齡60歲，四分位數(shù)間距16歲；腫瘤直徑<6 cm者167例，≥6 cm者50例。根據(jù)WHO/ISUP分級(jí)系統(tǒng)分為4級(jí)：其中1+2級(jí)155例，3+4級(jí)62例；按AJCC第七版臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期204例，Ⅲ+Ⅳ期13例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者3例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者214例；伴脈管侵犯者15例，無(wú)脈管侵犯者202例；伴遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者5例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者212例。217例中197例獲得隨訪，主要采用門(mén)診復(fù)查及電話回訪等形式，隨訪截至2021年3月，隨訪時(shí)間1～129個(gè)月，中位時(shí)間為51個(gè)月?；颊呖傮w生存時(shí)間為手術(shù)日至末次隨訪或患者死亡時(shí)間。另隨機(jī)收集蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科存檔的新鮮ccRCC組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本各20例。所有患者術(shù)前均未接受任何輔助治療。

1.2 qRT-PCR取出液氮中保存的ccRCC組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織，加入Trizol裂解液(Sangon Biotech公司)提取總RNA，并利用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定其濃度。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)自Tiangen公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后用SYBRGreen試劑盒(購(gòu)自Tiangen公司)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。MYBL2基因引物序列：上游5′-CTTGAGCGAGTCCAAAGACTG-3′，下游5′-AGTTGGTCAGAAGACTTCCCT-3′。內(nèi)參β-actin引物序列：上游5′-CACCATTGGCAATGAGCGGTTCC-3′，下游5′-GTAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3′。每組樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。

1.3 組織芯片構(gòu)建依據(jù)HE染色切片選取存檔組織蠟塊，顯微鏡下觀察切片，并選取具有代表性的病變部位。利用組織芯片構(gòu)建儀制備組織芯片。

1.4 免疫組化和結(jié)果判斷免疫組化采用EnVision兩步法，MYBL2兔抗人單克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)工作濃度為1 ∶100。MYBL2蛋白陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核/質(zhì)。由兩位病理醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行雙盲法閱片，每例鏡下隨機(jī)采集10個(gè)視野。根據(jù)染色細(xì)胞比例評(píng)分：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分；根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)陽(yáng)性染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃或棕褐色為3分。將兩項(xiàng)評(píng)分結(jié)果相乘作為MYBL2蛋白表達(dá)最終評(píng)分：0～5分為低表達(dá)，6～12分為高表達(dá)。

1.5 生物信息學(xué)方法從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//cancergenome.nih.gov/)中獲取原發(fā)性ccRCC數(shù)據(jù)集中經(jīng)RSEM標(biāo)準(zhǔn)化后的RNA-Seq數(shù)據(jù)和相應(yīng)的臨床隨訪數(shù)據(jù)，最終共納入正常腎組織標(biāo)本72例，ccRCC組織標(biāo)本534例，比較ccRCC組織及正常腎組織中MYBL2 mRNA的表達(dá)情況，并以534例ccRCC組織中MYBL2 mRNA表達(dá)均值作為cut-off值繪制生存曲線。通過(guò)計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)獲得與MYBL2表達(dá)顯著相關(guān)的基因，且利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)這些基因進(jìn)行GO分析，并通過(guò)氣泡圖展示結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，20對(duì)新鮮ccRCC組織及癌旁組織中MYBL2 mRNA的表達(dá)水平采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。MYBL2蛋白表達(dá)在正常腎組織和ccRCC組織之間，及在ccRCC臨床病理特征之間的差異性比較用χ2檢驗(yàn)(或Fisher概率法)。采用Cox回歸模型進(jìn)行單因素及多因素分析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ccRCC組織和正常腎組織中MYBL2 mRNA表達(dá)20對(duì)ccRCC組織和癌旁正常腎組織的qRT-PCR結(jié)果顯示，MYBL2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在ccRCC組織中為(188.60%±31.67%)，在癌旁正常組織中為(100.00%±17.29%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.532，P=0.020)。

2.2 ccRCC組織和正常腎組織中MYBL2蛋白表達(dá)ccRCC腫瘤細(xì)胞呈泡巢狀生長(zhǎng)，胞質(zhì)豐富且透明，間質(zhì)富含毛細(xì)血管網(wǎng)(圖1)。MYBL2蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞核/質(zhì)，呈淡黃色至棕褐色顆粒狀或團(tuán)霧狀(圖2)。217例ccRCC中57例(26.3%)MYBL2蛋白高表達(dá)；185例正常腎臟組織中27例(14.6%)MYBL2蛋白高表達(dá)。兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.232，P=0.004，表1)。

表1 ccRCC及癌旁正常腎臟組織中MYBL2蛋白的表達(dá)

圖1 正常腎臟組織和ccRCC組織HE染色：A.正常腎臟組織，可見(jiàn)腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)；B.ccRCC組織，胞質(zhì)透亮的腫瘤細(xì)胞呈泡巢狀生長(zhǎng) 圖2 ccRCC組織及正常腎臟組織中MYBL2蛋白的表達(dá)，EnVision兩步法：A.MYBL2蛋白在ccRCC組織中呈陽(yáng)性；B.MYBL2蛋白在正常腎臟組織中呈陰性

2.3 MYBL2蛋白表達(dá)與ccRCC臨床病理特征的關(guān)系MYBL2蛋白表達(dá)與ccRCC臨床病理特征的相關(guān)性分析表明，MYBL2蛋白表達(dá)與ccRCC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(χ2=5.054，P<0.05，表2)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、部位、病理學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓等臨床病理特征無(wú)關(guān)(P>0.05)。

表2 ccRCC中MYBL2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4 預(yù)后的相關(guān)性分析單因素分析結(jié)果顯示，患者年齡、腫瘤大小、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、AJCC分期及MYBL2蛋白表達(dá)與ccRCC患者預(yù)后相關(guān)(P<0.05，表3)。多因素分析結(jié)果顯示，患者年齡、腫瘤大小及MYBL2蛋白表達(dá)是ccRCC獨(dú)立的預(yù)后因素(P<0.05，表4)。Kaplan-Meier生存分析顯示，MYBL2蛋白高表達(dá)患者的總生存期(overall survival, OS)顯著縮短(P=0.011，圖3)。

圖3 ccRCC組織中MYBL2蛋白表達(dá)與患者生存的關(guān)系

表3 影響ccRCC患者預(yù)后的單因素分析

表4 影響ccRCC患者預(yù)后的多因素分析

2.5 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果進(jìn)一步顯示，534例ccRCC組織中MYBL2 mRNA表達(dá)(151.70±245.19)高于正常腎組織(20.84±89.20)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。MYBL2 mRNA表達(dá)與ccRCC患者生存分析表明(圖4)，與MYBL2 mRNA低表達(dá)者相比，高表達(dá)者的OS顯著縮短(P<0.000 1)。

圖4 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)ccRCC組織中MYBL2 mRNA表達(dá)的預(yù)后分析：以534例ccRCC中MYBL2 mRNA表達(dá)均值為cut-off值繪制生存曲線

2.6 與MYBL2表達(dá)顯著相關(guān)的基因及其GO分析采用相關(guān)系數(shù)熱圖展示了ccRCC組織中，與MYBL2表達(dá)顯著相關(guān)的排名前100個(gè)基因，包括CDC20、PLK1、KIF20A、CENPA、KIF2C、CCNB1、PK-MYT1、CDCA8、CDCA3、CEP55等基因(圖5)。對(duì)這100個(gè)基因進(jìn)行了GO富集分析，包括了分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組成，并通過(guò)氣泡圖展示結(jié)果。ccRCC組織中MYBL2表達(dá)主要與ATP酶活性、微管結(jié)合、解旋酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、組蛋白激酶活性、有絲分裂細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變調(diào)控、細(xì)胞周期中后期轉(zhuǎn)換等的調(diào)控相關(guān)聯(lián)(圖6)。

圖5 ccRCC組織中MYBL2與100個(gè)基因的相關(guān)性熱圖：從左到右關(guān)聯(lián)減弱

圖6 ccRCC組織中相關(guān)基因的GO分析：A.生物過(guò)程；B.分子功能；C.細(xì)胞組成

3 討論

MYBL2作為轉(zhuǎn)錄因子參與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡與自噬等多種生理過(guò)程[3,12]。目前認(rèn)為，MYBL2可通過(guò)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、介導(dǎo)化療藥物耐藥性和促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移擴(kuò)散等方式，參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展。Parikh等[13]報(bào)道MYBL2在許多p53突變型癌癥中過(guò)度上調(diào)，通過(guò)與p53協(xié)同作用，促進(jìn)癌細(xì)胞的周期進(jìn)展和細(xì)胞存活。此外，Tao等[14]研究表明，在乳腺癌中敲除MYBL2基因，能上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，而MYBL2過(guò)表達(dá)則下調(diào)E-cadherin表達(dá)，且增加間充質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，提示MYBL2可能通過(guò)上調(diào)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)相關(guān)調(diào)控因子SNAIL的表達(dá)，從而介導(dǎo)EMT的激活和癌細(xì)胞的侵襲。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ccRCC組織中MYBL2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁正常腎組織，ccRCC組織中MYBL2蛋白高表達(dá)率也顯著高于正常腎組織，提示ccRCC組織中存在MYBL2過(guò)表達(dá)。MYBL2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析表明，MYBL2蛋白高表達(dá)與ccRCC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與其它臨床病理參數(shù)無(wú)相關(guān)性。Sun等[15]利用生物信息學(xué)分析表明，MYBL2蛋白高表達(dá)與ccRCC患者性別、高組織學(xué)分級(jí)、臨床晚期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。Nientiedt等[16]研究表明MYBL2在高組織學(xué)分級(jí)、臨床晚期ccRCC患者中高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，盡管MYBL2蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓及AJCC分期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，但在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有脈管內(nèi)癌栓及AJCC分期(Ⅲ+Ⅳ期)ccRCC患者中，MYBL2蛋白高表達(dá)率有升高的趨勢(shì)，分析其可能由于本組病例總體分期較早，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管內(nèi)癌栓者較少，樣本內(nèi)部參數(shù)可能存在一定偏差，故MYBL2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性可能仍需更多的研究驗(yàn)證。本組預(yù)后分析顯示，MYBL2蛋白表達(dá)與ccRCC患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。此外，利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步證實(shí)，與正常腎組織相比，ccRCC中MYBL2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，且MYBL2 mRNA的高表達(dá)與ccRCC患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。上述研究結(jié)果提示，MYBL2過(guò)表達(dá)可能參與了ccRCC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。

相關(guān)系數(shù)熱圖顯示，在ccRCC組織中，MYBL2與CDC20、PLK1、KIF20A等基因明顯相關(guān)。已有研究[17-21]表明，上述MYBL2相關(guān)基因與細(xì)胞周期進(jìn)展及多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。GO富集分析表明，ccRCC組織中MYBL2相關(guān)基因明顯富集在ATP酶活性、微管結(jié)合、解旋酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、組蛋白激酶活性等分子功能，染色體、著絲粒、紡錘體、微管等細(xì)胞組分，進(jìn)而調(diào)控有絲分裂細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換。因此，推測(cè)MYBL2基因與其顯著相關(guān)基因可能通過(guò)上述功能簇，參與ccRCC的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，MYBL2在ccRCC中高表達(dá)，其可能成為ccRCC的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物及潛在治療靶點(diǎn)，但其在應(yīng)用于臨床前仍需進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)研究。