鎘污染對2種豆科植物葉綠素熒光特性的影響

衛(wèi)丹丹，王丙全，戴 麗

（1.忻州師范學院，山西忻州034000；2.山西農(nóng)業(yè)大學玉米研究所，山西忻州034000）

鎘被廣泛應用于電鍍工業(yè)、電子業(yè)、化工業(yè)等領域，但是由于工業(yè)“三廢”的不合理排放，造成鎘蓄積于工廠周圍的土壤中以及含鎘工業(yè)廢水在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用，使土壤受到鎘污染[1-2]。重金屬鎘由于不能被降解，將長期存在于土壤中，造成土壤鎘污染，對植物光合系統(tǒng)具有破壞性，其中，光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）是比較敏感的部位[3]。逆境脅迫下，葉綠素自發(fā)熒光的變化可以反映葉片葉綠素吸收光能的去路變化，即PSⅡ的反應中心光能轉(zhuǎn)化和電子傳遞的變化情況。

綠豆也稱青小豆，為豆科植物，屬喜溫作物[4]，是一種被廣泛種植的雜糧作物，山西為其主產(chǎn)區(qū)之一。其蛋白含量高、脂肪含量低，經(jīng)濟價值很高[5-6]。赤豆也稱為紅小豆，為1年生豆科作物，喜溫、喜光、抗?jié)常渲饕械鞍踪|(zhì)、糖類等營養(yǎng)成分[7-8]。有研究表明[9]，土壤被重金屬鎘污染后，平邑甜茶根系細胞膜質(zhì)子泵的活性被抑制，根系從土壤中吸收營養(yǎng)元素的動力下降。植物遭受重金屬鎘脅迫后，活性氧（ROS）大量產(chǎn)生，細胞膜脂過氧化，甚至引起細胞早衰，導致植物萎蔫死亡[10]。鎘脅迫不僅會改變細胞膜脂的構成，影響?zhàn)B分吸收，而且還會對不同基因型甘藍幼苗葉片的光合作用產(chǎn)生嚴重抑制[11]。植物葉片PSⅡ反應中心是將光能轉(zhuǎn)換為電能的重要部位，它的活性大小直接影響著光能轉(zhuǎn)換效率的高低。植物葉片的葉綠素熒光特性可以快速反映PSⅡ反應中心、電子供體側(cè)和受體側(cè)的功能變化[9，12]。有研究發(fā)現(xiàn)[13-14]，低溫、鹽堿脅迫等外界環(huán)境因素的變化會嚴重降低植物PSⅡ的活性，土壤重金屬鎘、鉛污染也會破壞楊樹和玉米葉片的PSⅡ光系統(tǒng)的結構[3，15]。前人研究結果表明[16]，重金屬鎘脅迫對綠豆幼苗的生物量、光合作用、微量元素積累等方面都會產(chǎn)生很大的影響，但其具體傷害機制尚未有研究報道。

本研究以2種豆科植物毛綠一號綠豆和大紅袍赤豆為試驗材料，通過測定不同濃度CdCl2處理后綠豆和赤豆幼苗葉片葉綠素熒光誘導動力學曲線和相應參數(shù)的變化，分析CdCl2處理對這2種豆科植物光合機構PSⅡ反應中心、電子傳遞的影響，旨在為進一步揭示豆科植物光合機構鎘傷害機制提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試綠豆品種為毛綠一號綠豆種子，是一種早熟高產(chǎn)抗病性好的春播品種，購自北京中農(nóng)金科種業(yè)科技有限公司；供試赤豆品種為大紅袍赤豆種子，由山西農(nóng)業(yè)大學玉米研究所提供。

1.2 試驗方法

試驗于2019年在忻州師范學院實驗室完成。分別選取大小一致的毛綠一號綠豆種子和大紅袍赤豆種子，經(jīng)水浸泡24 h后播種在裝有石英砂的花盆中（高10 cm，長8 cm，寬8 cm），每個品種播種15盆，每盆播種5顆種子；每天澆灌等量的Hoagland營養(yǎng)液，30 d后，對2種豆科植物綠豆和赤豆開始進行外源鎘脅迫處理；每天用等體積的不同濃度CdCl2溶液澆灌1月齡的2種豆科植物幼苗，CdCl2溶液的質(zhì)量濃度分別設置為0（CK）、0.2、0.5、1.0、5.0 mg/L，每處理5株，重復3次。不同質(zhì)量濃度CdCl2溶液用1/2 Hoagland營養(yǎng)液進行配制，CK為等量的1/2 Hoagland營養(yǎng)液。于每天9：00測定毛綠一號綠豆和大紅袍赤豆幼苗葉片的葉綠素熒光參數(shù)，直到幼苗出現(xiàn)明顯的表型特征。鎘脅迫處理10 d后，剪下0.5 g幼苗葉片，進行超氧陰離子（O2·-）和H2O2檢測。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 超氧陰離子（O2·-）檢測和H2O2檢測 葉片超氧陰離子（O2·-）釋放速率測定參考ELSTNER等[17]的方法進行；葉片H2O2含量的測定參照ELSTNER等[17]的方法進行；葉片H2O2含量的測定參照MUKHERJEE等[18]的方法進行。

1.3.2 快速葉綠素熒光誘導動力學曲線的測定2種豆科植物葉綠素熒光動力學曲線的測定參考李鵬民[13]的方法進行。自下往上選擇毛綠一號綠豆和大紅袍赤豆幼苗植株的第2片真葉（避開葉脈），用葉夾夾住葉片，暗適應25 min；之后在飽和脈沖光（3 500 μmol/（m2·s））下暴露1 s，用便攜式葉綠素熒光儀Pocket-PEA測定毛綠一號和大紅袍幼苗葉片的快速葉綠素熒光誘導動力學曲線，即O-J-I-P曲線。并對所測得的各熒光參數(shù)進行JIP-test分析[19]。

式中，F(xiàn)v/Fm為最大光化學效率，F(xiàn)o為最小熒光，是熒光誘導動力學曲線O相（50 μs）的熒光強度；Fm為最大熒光，是熒光曲線P相（0.3～1.0 s）所對應的熒光強度；Fv為最大可變熒光。

式中，Vt為t時間時的相對可變熒光，F(xiàn)t為t時間的熒光強度。在K相（300 μs）、J相（2 ms）、I相（30 ms）的相對可變熒光分別為VK、VJ、VI。

式中，φEo為用于電子傳遞的量子產(chǎn)額，φPo表示最大光化學效率；Ψo表示電子傳遞到QA-下游電子受體的概率（1－VJ）。

式中，PIabs為光合性能指數(shù)，RC/ABS表示以光能吸收為基礎的反應中心數(shù)量。

式中，Wk為在K點的可變熒光FK占FJ－Fo振幅的比例，F(xiàn)J為J點的熒光強度，Sm為直線F＝Fm和P相之間的標準化的互補面積，Area為直線F＝Fm和J－P相之間的面積。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2010、SigmaPlot 12.5和SPSS Statistics 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理和統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 超氧陰離子（O2·-）和H2O2檢測分析

CdCl2脅迫會增加植物體內(nèi)的活性氧（ROS）的含量，引起氧化脅迫，在光照條件下，葉綠素光合系統(tǒng)中的線性電子傳遞鏈通常是ROS產(chǎn)生的主要來源，O2·-和H2O2是ROS的2種主要形式。由圖1可知，CdCl2處理會引起O2·-和H2O2在葉片中大量積累，且隨著CdCl2濃度的增加，活性氧在幼苗葉片中的積累增加；在0.5、1.0、5.0 mg/L的CdCl2處理下，毛綠一號和大紅袍葉片中O2·-和H2O2的積累量顯著大于CK（0 mg/L）。

2.2 CdCl2處理下綠豆和赤豆幼苗葉片葉綠素熒光誘導動力學曲線

不同濃度的CdCl2對毛綠一號和大紅袍處理10 d后，利用便攜式葉綠素熒光儀Pocket-PEA獲得鎘脅迫后2種豆科植物葉片的葉綠素熒光變化情況，繪制毛綠一號和大紅袍的葉綠素熒光誘導動力學曲線（O-J-I-P曲線，圖2），不同濃度CdCl2脅迫后，2種豆科植物的OJIP曲線形狀都發(fā)生了一定的改變。毛綠一號幼苗在50 μs的熒光強度（Fo）和300 μs的熒光強度（FK）隨著CdCl2處理濃度的增加而逐漸增加，2 ms的熒光強度（FJ，J點）和30 ms的熒光強度（FI，I點）及P相的熒光強度（Fm，P點）則隨脅迫濃度增加而逐漸減??；大紅袍的最小熒光（Fo）則沒有明顯變化，且隨CdCl2質(zhì)量濃度升高，I點和P點熒光強度下降。

2.3 CdCl2處理對葉綠素熒光動力學參數(shù)的影響

2.3.1 CdCl2處理對PIabs、Fv/Fm（φPo）、Fv/Fo、Ψo、φEo和Sm的影響 不同濃度CdCl2脅迫使2種豆科植物幼苗的各熒光參數(shù)呈規(guī)律性的變化。大紅袍赤豆的光合性能指數(shù)PIabs隨CdCl2質(zhì)量濃度的增加而顯著減小，0.5 mg/L的CdCl2脅迫就能顯著降低赤豆葉片的光合能力，而鎘對毛綠一號光合能力的傷害比大紅袍小，5 mg/L的CdCl2才對PIabs造成顯著影響（圖3）。葉片的最大光化學效率Fv/Fm反映光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的最大活性，但是Fv/Fm參數(shù)對鎘脅迫不敏感；Fv/Fo是反映PSⅡ反應中心光能潛在活性的指標。從圖3可以看出，不同濃度的CdCl2處理后，大紅袍的熒光參數(shù)Fv/Fo隨Cd濃度增加而顯著下降，0.2、0.5、1.0、5.0 mg/L的CdCl2處理的毛綠一號分別比CK降低20.27%、29.67%、30.78%、34.71%；大紅袍分別比CK降低29.73%、37.18%、44.83%、47.35%，大紅袍Fv/Fo降低的程度比毛綠一號Fv/Fo大，說明Cd脅迫對大紅袍赤豆PSⅡ反應中心的傷害比毛綠一號綠豆大。鎘處理后，2種豆科植物的Ψo、φEo值都下降，且0.2 mg/L的CdCl2對大紅袍的電子傳遞鏈造成極大傷害，此時光合系統(tǒng)中進入電子傳遞的能量減少；而鎘脅迫對毛綠一號電子傳遞的傷害比赤豆小，在5 mg/L的CdCl2處理時才會有顯著傷害。隨處理濃度增大，PSⅡ受體側(cè)的電子傳遞體（Sm）減少。以上結果表明，鎘污染越嚴重，豆科植物毛綠一號綠豆和大紅袍赤豆PSⅡ的潛在活性下降越大，且鎘污染對大紅袍PSⅡ反應中心的傷害比對綠豆大。

2.3.2 CdCl2處理對PSⅡ電子供體側(cè)、受體側(cè)和PQ庫的影響OJIP曲線中K點的變化可以反映PSⅡ電子供體側(cè)放氧復合體（OEC）的變化情況。VJ的升高表示PSⅡ電子傳遞鏈中QA到QB的傳遞發(fā)生改變[20]。隨著CdCl2處理濃度增大，毛綠一號和大紅袍的Wk值呈增大的趨勢，且赤豆的Wk大于綠豆的Wk，說明鎘脅迫下，這2種豆科植物的放氧復合體都發(fā)生損傷，且大紅袍的放氧復合體受損傷更嚴重。鎘脅迫后，VJ的升高表示PSⅡ上的電子不能從QA傳遞到QB，赤豆的VJ顯著升高，而毛綠一號的VJ變化則不明顯，說明鎘脅迫阻斷了大紅袍的線性電子傳遞，且這種阻斷程度隨鎘脅迫濃度增加而增大。VI的升高表示PQ庫出現(xiàn)了異質(zhì)化，2種豆科植物的VI都呈升高趨勢，且顯著高于CK，說明2種豆科植物的PQ庫都發(fā)生明顯異質(zhì)化（圖4）。由以上結果可知，鎘脅迫同時傷害大紅袍PSⅡ電子的供體側(cè)和受體側(cè)，對毛綠一號的電子供體側(cè)也有很大傷害，而對其受體側(cè)影響較小。

2.3.3 CdCl2處理對PSⅡ反應中心能量分配的影響JIP-test分析[19]中，單位面積光能吸收（ABS/CSm）。有活性的反應中心的密度（RC/CSm）、熱耗散掉的能量（DIo/CSm）及捕獲（TRo/CSm）、用于電子傳遞的能量（ETo/CSm）等反映PSⅡ能量分配的參數(shù)也能被檢測。

由圖5可知，鎘脅迫對2種豆科植物綠豆和赤 豆ABS/CSm并沒有顯著的影響，而不同濃度的CdCl2處理對毛綠一號和大紅袍幼苗葉片ETo/CSm、DIo/CSm和RC/CSm有一定差異。隨著CdCl2處理濃度的增加，毛綠一號和大紅袍葉片ETo/CSm和RC/CSm呈下降趨勢，且處理濃度越大處理時間越長，其下降幅度越大；而DIo/CSm隨處理濃度增大而升高。CdCl2處理10 d后，0.2、0.5、1.0、5.0 mg/L的CdCl2處理綠豆的ETo/CSm分別比處理前降低6.73%、17.36%、28.03%、39.13%；而大紅袍分別比處理前降低24.24%、37.81%、47.20%、59.36%。0.2、0.5、1.0、5.0 mg/L的CdCl2處理毛綠一號的DIo/CSm分別比處理前增加10.32%、16.25%、21.32%、29.55%；而大紅袍分別比處理前增加27.85%、46.08%、61.14%、76.65%。RC/CSm隨著CdCl2處理濃度的增加而下降，其中，0.2、0.5、1.0、5.0 mg/L的CdCl2處理綠豆的RC/CSm分別比處理前降低29.67%、38.49%、43.21%、52.19%；而大紅袍分別比處理前降低36.47%、45.72%、52.35%、59.14%。由此可知，在同一濃度下，處理相同時間的毛綠一號和大紅袍幼苗，毛綠一號幼苗葉片熒光參數(shù)ETo/CSm、DIo/CSm、RC/Sm的變化程度比大紅袍幼苗小，說明鎘脅迫雖然不影響毛綠一號和大紅袍單位葉面積能量的吸收，但是與CK相比，鎘脅迫顯著影響進入電子傳遞的能量，降低有活性的反應中心數(shù)量，說明鎘污染破壞了豆科植物毛綠一號綠豆和大紅袍赤豆的反應中心，影響PSⅡ的能量分配方式。

3 結論與討論

土壤鎘污染會影響植物種子萌發(fā)[21]和植株生長。有研究表明，低劑量鎘能促進蓖麻植株生長，而高劑量則對會對其產(chǎn)生抑制作用[22]。為了研究土壤中重金屬鎘的積累對豆科植物光合機構的影響，本試驗對2種豆科植物毛綠一號綠豆和大紅袍赤豆幼苗葉片的葉綠素熒光動力學曲線進行了JIP-test分析，結果表明，綠豆和赤豆的PIabs、Fv/Fo、Ψo、φEo等均隨著CdCl2脅迫濃度的增加而呈下降趨勢。PIabs是光合性能指數(shù)，其大小可以反映葉片的光合能力。CdCl2脅迫導致葉片的PIabs下降，降低毛綠一號綠豆和大紅袍赤豆的光合能力，這與油菜的光合機構對重金屬鎘脅迫的響應一致[23]。但是這2種豆科植物光合能力下降程度卻不同，大紅袍的光合能力強于毛綠一號，但是毛綠一號對重金屬鎘的抗性卻比大紅袍強。研究鎘對大紅袍赤豆光合能力造成傷害的原因有助于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提高赤豆的抗鎘能力及其為分子育種提供理論依據(jù)。

鎘污染對不同植物的影響不同，斑茅可以很好地吸收、轉(zhuǎn)移累積鎘，其可以作為鎘污染土壤的修復植物[24]。但是鎘對甘薯的生長卻有傷害，生長于鎘污染土壤中的甘薯植株，鎘在根中的積累量大于葉片[25]。Cd離子積累不僅會引起蜀葵和二月蘭根芽損傷，而且還會抑制葉片的光合作用和蒸騰作用[26]。本研究中，CdCl2脅迫破壞豆科植物光合機構，導致其光合能力下降。光系統(tǒng)II（PSⅡ）的最大光化學效率Fv/Fm（φPo）是對CdCl2影響最不敏感的參數(shù)，毛綠一號與大紅袍的Fv/Fm并沒有差異，且隨著CdCl2濃度增加，F(xiàn)v/Fm的下降并不明顯。2005年，JANECZKO等[23]對油菜幼苗的研究表明，鎘似乎不會影響光合色素的含量，油菜幼苗被Cd脅迫14 d后，類胡蘿卜素、葉綠素a和葉綠素b的含量沒有顯著變化。色素是光能吸收的主要來源，在本研究中，毛綠一號綠豆和大紅袍赤豆在鎘脅迫前后單位面積光能的吸收量（ABS/CSm）并無顯著差異，也表明Cd脅迫對植物葉片的光合色素不造成傷害。

Cd脅迫會導致受體側(cè)捕光色素復合體Ⅱ（LHCⅡ）解離，從而導致電子傳遞紊亂[27]。在本研究中，鎘對大紅袍葉片PSⅡ電子傳遞的能量分配造成很大影響。隨著CdCl2濃度的增大，大紅袍幼苗葉片PSⅡ的電子供體側(cè)和受體側(cè)都受到嚴重傷害，放氧復合體（OEC）發(fā)生損傷，電子從QA傳遞到QB的傳遞產(chǎn)生破壞，同時PSⅡ受體側(cè)傳遞體減少，QA-積累增加，受體側(cè)的電子傳遞能力下降，這些都是鎘脅迫下赤豆PSⅡ電子傳遞能力下降的原因。但是鎘對毛綠一號的傷害僅限于電子的供體側(cè)，即放氧復合體（OEC），而對其電子受體側(cè)傷害較小。

Cd脅迫會引發(fā)非光化學淬滅或熱耗散的升高。對油菜葉片PSⅡ進行葉綠素熒光分析表明，Cd脅迫下，油菜葉片橫截面的PSⅡ有活性的反應中心數(shù)量（RC/CSm）、單位葉面積用于電子傳遞的能量（ETo/CSm）下降，放氧復合體活性也下降[23]。本研究表明，隨著CdCl2處理濃度的增加，毛綠一號和大紅袍單位面積的光能吸收（ABS/CSm）都沒有顯著變化，表明鎘對這2種豆科植物的光合能量吸收沒有產(chǎn)生影響。從不同濃度Cd處理的第2天開始，綠豆的ETo/CSm、RC/CSm下降程度明顯大于赤豆，單位面積用于熱耗散的能量（DIo/CSm）則增大，說明此時毛綠一號通過增加熱耗散、關閉反應中心來提高抗性。由此可見，Cd脅迫降低豆科植物光合機構對光能的轉(zhuǎn)化效率，增加熱耗散，影響光合系統(tǒng)線性電子傳遞鏈中電子的正常傳遞，抑制光合作用。

綜上所述，0.2～5.0 mg/L的CdCl2處理改變了2種豆科植物毛綠一號綠豆和大紅袍赤豆幼苗葉片的葉綠素熒光誘導動力學曲線形狀，并且它們?nèi)~綠素熒光參數(shù)的改變說明鎘脅迫使豆科植物赤豆的光合能力下降的主要原因是Cd對大紅袍赤豆PSⅡ供體側(cè)、受體側(cè)和反應中心造成傷害，降低PSⅡ活性；而毛綠一號綠豆通過增加熱耗散、關閉反應中心，減輕鎘對PSⅡ電子受體側(cè)的傷害，從而減輕Cd對其光合能力的影響。