基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究加味柴芍六君湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機制

林澤豪，傅 頤，陳靜怡，莊芬妮，黃安聞，連雄瀚，朱景茹，涂文玲，甘慧娟

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州350122）

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是臨床常見的消化性疾病，為胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵始動環(huán)節(jié)，以胃黏膜固有腺體萎縮為主要病理特點，甚至伴見腸化或上皮內(nèi)瘤變，被世界衛(wèi)生組織定義為癌前狀態(tài)。該病癥狀易反復(fù)發(fā)作，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，其發(fā)病率和檢出率隨年齡增長而增加［1-2］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療CAG主要采取根除幽門螺桿菌（Hp）、胃黏膜保護、抗氧化治療、促進胃黏膜再生、內(nèi)鏡微創(chuàng)技術(shù)等治療方法［3］，臨床取得一定療效，但多以對癥治療為主，遠期療效較差。因此，迫切需要一種替代療法用以防治CAG。中醫(yī)藥治療消化疾病具有獨特的優(yōu)勢和廣闊前景，且因其療效安全，不良反應(yīng)小的特點而備受關(guān)注，臨床上有諸多醫(yī)家運用加味柴芍六君湯治療CAG取得了良好的療效［4-6］，然而其治療CAG的作用機制尚未得到充分揭示。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡的角度闡釋疾病的發(fā)生發(fā)展過程、從改善或恢復(fù)生物網(wǎng)絡(luò)平衡的整體觀角度認識藥物與機體的相互作用并指導(dǎo)新藥發(fā)現(xiàn)［7］，近年來，越來越多科研工作者從系統(tǒng)的角度探討中藥復(fù)方多成分多靶點與疾病的關(guān)系，為現(xiàn)代中醫(yī)藥的研究提供了新的方向。因此，本文以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為切入點，對加味柴芍六君湯治療CAG的靶點作用網(wǎng)絡(luò)進行分析，預(yù)測其治療CAG的可能作用機制。

1 方 法

1.1 加味柴芍六君湯有效活性成分與作用靶點搜集與篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺（簡稱TCMSP，http：／／tcmspw.com／tcmsp.php），分別以“白 芍”“白術(shù)”“半夏”“柴胡”“陳皮”“丹參”“莪術(shù)”“茯苓”“甘草”“人參”為檢索詞進行檢索，設(shè)置口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，搜集加味柴芍六君湯的有效活性成分信息。然后對篩選出的有效活性成分進行蛋白靶標查找，將獲取的蛋白靶標進行基因名稱轉(zhuǎn)換，獲取加味柴芍六君湯的作用靶點信息。

1.2 CAG的疾病作用靶點獲取 用GeneCards數(shù)據(jù)庫對“Chronic at-rophic gastritis”進行檢索，獲取CAG的疾病作用靶點。通過Venny 2.1.0在線工具，獲得CAG與加味柴芍六君湯共同作用靶點，即加味柴芍六君湯治療CAG的作用靶點。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的可視化構(gòu)建與分析 將加味柴芍六君湯的有效活性成分-作用靶點信息、單味藥-有效活性成分信息和CAG-作用靶點信息導(dǎo)入C-ytoscape3.7.2軟件，分別繪制出三者之間的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再利用“Merge”功能將其合并成加味柴芍六君湯治療CAG的有效活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)。將共同作用靶點導(dǎo)入到String數(shù)據(jù)庫“Multiple proteins”檢索框中，以互動得分≥0.900為篩選條件，構(gòu)建加味柴芍六君湯與CAG之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI網(wǎng)絡(luò)），并對PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析。

1.4 GO生物學(xué)過程和KEGG信號通路富集分析利用String數(shù)據(jù)庫分析后的核心靶點進行GO生物學(xué)過程和KEGG信號通路富集分析；利用Bioconductor生物信息軟件包，對所預(yù)測的化學(xué)成分靶點進行富集分析，以P＜0.05為篩選條件進行可視化處理，再將加味柴芍六君湯對應(yīng)的靶蛋白直接映射到通路上，選取既包含藥物靶點又包含疾病靶點的通路做出KEGG信號通路富集分析柱狀圖。

1.5 分子對接 利用PubChem數(shù)據(jù)庫得到加味柴芍六君湯活性成分的結(jié)構(gòu)信息，在PDB數(shù)據(jù)庫檢索得到核心靶點的結(jié)構(gòu)信息，最后利用Vina1.1.2軟件完成加味柴芍六君湯活性成分與靶點受體的分子對接。

2 結(jié) 果

2.1 加味柴芍六君湯靶點信息獲取 共篩選出加味柴芍六君湯有效活性成分195個（其中白芍13個、白術(shù)7個、半夏13個、柴胡17個、陳皮5個、丹參65個、莪術(shù)3個、茯苓15個、甘草92個、人參22個），藥物靶點265個。文中只保留OB值排名第1的有效活性成分，見表1。將經(jīng)過篩選轉(zhuǎn)化的單味中藥主要活性成分及作用靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建加味柴芍六君湯治療CAG的有效活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

表1 加味柴芍六君湯有效活性成分

圖1 加味柴芍六君湯治療CAG的有效活性成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)

2.2 加味柴芍六君子湯治療CAG的作用靶點獲取 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索得到CAG作用靶點613個，將加味柴芍六君子湯的作用靶點和CAG的作用靶點分別輸入Venny 2.1.0在線工具分析，得到共同靶點89個。見圖2。

圖2 疾病-藥物-靶點（DDT）韋恩圖

2.3 相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將89個共同作用靶點輸入到String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建出這89個共同作用靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)模型。見圖3。該網(wǎng)絡(luò)包含89個共同作用靶點，336條連接線，平均度值為35.8，其中NFKBIA、SPP1、CASP9、TIMP1、MMP1、MCL1、CDKN1A、HIF1A、SERPINE1、STAT1、MPO、VCAM1、PPARG、AR、CASP8、IFNG、ERBB2、ICAM1、BCL2L1、MMP2、CAT、MAPK14、FOS、CCL2、IL1B、CCND1、EGFR、MYC、MAPK1、CXCLB、MMP9、EGF、STAT3、MAPK3、CASP3、VEGFA、MAPK8、PTGS2、JUN、TP53、AKT1的度值高于平均度值即為相對核心靶點。見圖3。

圖3 共同作用靶點互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO生物學(xué)過程富集分析 通過R軟件運行腳本對89個共同作用靶點進行GO生物學(xué)過程富集分析，獲得P＜0.05的GO條目117個，結(jié)果表明加味柴芍六君湯治療CAG過程主要涉及磷酸酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、蛋白磷酸酶結(jié)合等生物學(xué)過程，文中共列出排名前20的GO富集氣泡圖。見圖4。

圖4 前20名GO富集氣泡圖

2.5 KEGG信號通路富集分析 通過R軟件運行腳本對89個共同作用靶點進行KEGG信號通路富集分析，根據(jù)P＜0.05篩選到152條信號通路，涉及到的信號通路類型主要有病毒感染（卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、乙型肝炎病毒感染、丙型肝炎病毒感染、人類巨細胞病毒感染等）、癌癥（前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等）、信號傳導(dǎo)（PI3K-Akt信號、AGE-RAGE信號、MAPK信號、HIF-1信號、JAK-STAT信號、RIG-I樣受體信號、B細胞受體信號、幽門螺桿菌感染中的上皮細胞信號等）、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、麻疹等。見圖5。

圖5 KEGG信號通路富集分析柱狀圖

2.6分子對接 為了進一步驗證“有效活性成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測結(jié)果，將前5位核心靶點AKT1、TP53、JUN、PTGS2、MAPK8與其對應(yīng)的主要活性成分kaempferol、baicalein、beta-sitosterol、Cavidine、nobiletin進行分子對接，獲得的相關(guān)對接參數(shù)以及相應(yīng)的計算結(jié)果，見表2。一般認為配體與受體結(jié)合的自由能越低，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生作用的可能性越大，加味柴芍六君湯的主要活性成分與核心靶點結(jié)合自由能均＜-5 kcal／mol，提示篩選出的核心靶點與其對應(yīng)的活性成分具有良好的親和力，證明結(jié)果具有一定的可信度。前5位核心靶點與其對應(yīng)的活性成分對接結(jié)果，見圖6。

表2 活性成分與核心靶點對接參數(shù)及計算結(jié)果

圖6 對接結(jié)果圖

3 討 論

近年來，CAG的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，且逐漸趨于年輕化，發(fā)病機制尚未明確，由于內(nèi)外多重因素刺激導(dǎo)致胃黏膜腺體遭受破壞，從而出現(xiàn)萎縮、腸上皮化生甚至異型增生等難以逆轉(zhuǎn)的病理學(xué)改變，長期反復(fù)發(fā)作容易誘發(fā)癌變，是許多科研工作者廣泛關(guān)注的熱點問題之一［8］。課題組前期研究證實，肝郁脾虛是CAG重要病理特點，肝郁、脾虛常相互影響，氣郁、脾虛導(dǎo)致水液代謝障礙，產(chǎn)生痰濕，痰濕反過來影響了肝、脾功能，加重病情［9］。加味柴芍六君湯方中柴胡疏肝行氣；白芍養(yǎng)血柔肝；人參、茯苓、白術(shù)健脾益氣；半夏、陳皮理氣燥濕化痰，和胃降逆；丹參活血祛瘀，通經(jīng)止痛；莪術(shù)辛溫，破血止痛；甘草調(diào)和諸藥。全方共奏健脾和胃、活血祛瘀、疏肝理氣之功。現(xiàn)代藥理研究表明，白術(shù)能雙向調(diào)節(jié)胃腸道，保護胃黏膜，提高免疫功能；白芍具有調(diào)節(jié)免疫，解除平滑肌痙攣作用，其中芍藥甙能抗炎、保護胃黏膜；甘草具有抗?jié)?、抗痙攣、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤及解毒功效［10］。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討加味柴芍六君湯治療CAG的可能作用機制。通過對加味柴芍六君湯有效活性成分、作用靶點搜集與篩選，獲取195個有效活性成分，包含槲皮素、常春藤皂苷元、甘草甜素、蓽澄茄素、米橘素等。槲皮素能逆轉(zhuǎn)DKK3啟動子甲基化恢復(fù)其表達將有助于抑制胃癌的惡性轉(zhuǎn)化。槲皮素逆轉(zhuǎn)MSX1基因的甲基化狀態(tài)后，恢復(fù)MSX1基因的功能則可誘導(dǎo)DKK3等基因的表達，理論上也可間接抑制胃癌的發(fā)生［11］。常春藤皂苷元能抑制胃癌MGC803增殖，對胃癌細胞侵襲、黏附、遷移能力有著明顯的影響，是一種良好的抗腫瘤藥物［12］。在對炎癥趨化因子和促炎癥因子的表達方面，甘草甜素能夠抑制結(jié)腸髓過氧化物酶，減少活性氧化物質(zhì)導(dǎo)致的脂質(zhì)蛋白變性和器官損傷，改善炎癥癥狀［13］。

將加味柴芍六君湯的作用靶點和CAG的作用靶點分別輸入Venny2.1.0在線工具分析，得到共同作用靶點89個。通過構(gòu)建共同作用靶點互作網(wǎng)絡(luò)，分析得出IL1B、AKT1、TP53、JUN、MAPK8、VEGFA、MAPK3、STAT3、MAPK1等41個相對核心靶點。其中IL-1β是典型的促炎性細胞因子，炎性信號可通過激活炎癥小體而刺激分泌IL-1β，過量分泌的IL-1β會引起廣泛的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致炎性損傷［14］。IL-1β還是目前發(fā)現(xiàn)的最強的胃酸分泌抑制劑，持續(xù)的低酸分泌會促進萎縮的發(fā)生發(fā)展，增加胃癌的發(fā)生危險［15-16］。IL-6是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子，是發(fā)動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性因子，可以誘導(dǎo)內(nèi)皮發(fā)生細胞活化，刺激中性粒細胞產(chǎn)生趨化作用，并產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)［17］。有研究表明，IL-6在胃黏膜炎癥反應(yīng)過程中具有極其明顯的指示作用，但是達到了一定的范圍就可能會對胃黏膜產(chǎn)生損傷作用［18］。

通過GO生物學(xué)過程富集分析可知，加味柴芍六君湯對CAG的治療作用主要通過參與以下生物學(xué)過程而發(fā)揮療效：磷酸酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、受體配體活性、蛋白磷酸酶結(jié)合等生物學(xué)過程。進一步的KEGG信號通路富集分析提示，加味柴芍六君湯主要通過調(diào)控HIF-1、PI3K-Akt、MAPK等多種信號通路而達到治療CAG的作用。HIF-1α與慢性炎性反應(yīng)的關(guān)系密切，是廣泛存在于機體細胞中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，該基因由低氧誘導(dǎo)并介導(dǎo)細胞對缺氧微環(huán)境進行適性反應(yīng)，缺氧時HIF-1α表達顯著上調(diào)，由此啟動60余種下游因子的轉(zhuǎn)錄以使細胞逐漸適應(yīng)有氧到缺氧的轉(zhuǎn)變［19］。PI3K／Akt途徑信號傳導(dǎo)與異常細胞增殖和凋亡有關(guān)，這兩者都與腫瘤發(fā)生直接相關(guān)，PI3K／Akt通路在胃癌細胞增殖和存活中發(fā)揮著重要作用［20］。MAP-K途徑可以將細胞表面信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細胞核，對多數(shù)細胞的增生和程序化死亡等的調(diào)節(jié)起到重要意義［21］。分子對接結(jié)果顯示，加味柴芍六君湯活性成分與相應(yīng)核心靶點對接親和力良好，對接體系穩(wěn)定，進一步證明了本研究關(guān)于加味柴芍六君湯治療CAG機制的有效性與可靠性。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從整體和系統(tǒng)的角度初步預(yù)測了加味柴芍六君湯治療CAG的作用機制，其可能是通過抗炎，降低炎性因子IL-1β、IL-6的水平來減輕CAG黏膜細胞的缺氧狀態(tài)，調(diào)節(jié)HIF-1α等細胞轉(zhuǎn)錄因子和蛋白的表達，或通過調(diào)控HIF-1、PI3K-Akt、MAPK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而改善胃黏膜瘀血狀態(tài)，起到抗胃黏膜萎縮的作用，具有一定的研究價值。為進一步驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性，后期有必要開展相應(yīng)的基礎(chǔ)實驗進一步闡述加味柴芍六君湯治療CAG的作用機制。