RAC1對(duì)惡性腫瘤的調(diào)控作用及其分子機(jī)制研究進(jìn)展

王琛瑤，梁百慧，吳錦源，唐梓涵，許小文，尹梓健，丁雅瓊，方雄釗，李栢芝，文姝佚，程轉(zhuǎn)，詹涵，張粵烽，王泫哲，何仕龍，張可洵，劉雅騏，周飛，熊興東，白春英，許麗艷，李恩民，

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東汕頭515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，廣東汕頭515041；3.赤峰學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古赤峰024076；4.廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523808；5.韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東潮州521041)

RAS相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1)是Ras超家族中Rho亞家族的核心成員。人類的RAC1基因位于7號(hào)染色體短臂2區(qū)2帶1亞帶，含有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本。編碼RAC1蛋白的轉(zhuǎn)錄本長度為2 309 nt(NM_006908.5)，編碼192個(gè)氨基酸；編碼RAC1b蛋白的轉(zhuǎn)錄本長度為2 366 nt(NM_018890.4)，編碼211個(gè)氨基酸。RAC1和RAC1b是高度同源的剪接變體，剪接亞型RAC1b在1999年首次被描述，包括了1個(gè)額外的外顯子3b緊接在開關(guān)II區(qū)域后面，該外顯子中插入了19個(gè)氨基酸，這種插入導(dǎo)致其核苷酸交換率增強(qiáng)并且延遲GTP水解，因此，在大多數(shù)細(xì)胞中，RAC1b處于GTP結(jié)合的活性狀態(tài)，該剪切亞型可能不是肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的直接調(diào)節(jié)因子，因此本文不予詳述。RAC1主要存在于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞偽足處，這是RAC1蛋白參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)控的形態(tài)學(xué)證據(jù)。RAC1是一種結(jié)構(gòu)簡單的GTP酶蛋白，其折疊方式由中心區(qū)域的β片層和周圍是α螺旋組成，RAC1含有1個(gè)核心的結(jié)構(gòu)域，即G結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有5個(gè)一致性元件，主要位于其β片層的C端以及α螺旋的連接處，該位置組成了核苷酸的結(jié)合位點(diǎn)，其前3個(gè)一致性元件(P-loop、開關(guān)Ⅰ、開關(guān)Ⅱ)與GTP和GDP的結(jié)合有關(guān)。RAC1的功能高度依賴于其GTP結(jié)合態(tài)和GDP結(jié)合態(tài)之間的轉(zhuǎn)換。前者是活性態(tài)，相當(dāng)于開關(guān)的開啟狀態(tài)，介導(dǎo)相關(guān)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)；后者是失活態(tài)，相當(dāng)于開關(guān)的關(guān)閉狀態(tài)，阻斷相關(guān)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。RAC1蛋白的GTP結(jié)合態(tài)/活性態(tài)和GDP結(jié)合態(tài)/失活態(tài)之間的循環(huán)切換，受鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTPase激活蛋白(GTPase-activating proteins，GAPs)和GDP解離抑制因子(GDP dissociation inhibitors，GDIs)三者的協(xié)同調(diào)控。通常情況下，RAC1主要處于與GDP結(jié)合的失活態(tài)，而鎖定這種狀態(tài)主要依靠GDIs。當(dāng)接收到激活信號(hào)時(shí)，非蛋白酪氨酸激酶SRC受體(proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src，SRC)催化GDIs與RAC1-GDP之間的解離；而失活態(tài)RAC1-GDP在GEFs的作用下會(huì)生成激活態(tài)RAC1-GTP；激活態(tài)RAC1-GTP在GAPs作用下水解，生成失活態(tài)RAC1-GDP。以上被稱為RAC1/GTPase循環(huán)，詳見圖1。

圖1 RAC1/GTPase循環(huán)

1 RAC1對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控及其分子機(jī)制

細(xì)胞增殖是生命活動(dòng)的基本特征。正常細(xì)胞的周期分為4期，G1期為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備，S期進(jìn)行DNA復(fù)制，G2期為有絲分裂做準(zhǔn)備，M期為有絲分裂期。在細(xì)胞周期中，G1期的啟動(dòng)是關(guān)鍵。G1晚期有決定細(xì)胞周期的限制點(diǎn)，細(xì)胞需要接受生長因子的持續(xù)刺激，才能通過該限制點(diǎn)進(jìn)入S期，否則進(jìn)入相對(duì)靜止的G0期。這些生長因子的刺激信號(hào)會(huì)通過活化細(xì)胞膜酪氨酸激酶受體(receptor protein tyrosine kinase，RTKs)、RAC1/PI3K/AKT、RAC1-PAKs以及RAC1/JNK/c-Jun等信號(hào)通路將細(xì)胞增殖信號(hào)傳至細(xì)胞內(nèi)部。而腫瘤惡性增殖的核心事件是正常的細(xì)胞周期進(jìn)程被破壞，上述相關(guān)調(diào)控蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生改變，使腫瘤細(xì)胞接收一系列異常信號(hào)，順利通過細(xì)胞周期限制點(diǎn)，進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)程，失去分化能力，發(fā)生惡性增殖。因此，長期以來有關(guān)細(xì)胞周期信號(hào)通路的研究，一直是腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。2018年發(fā)表的一項(xiàng)研究表明，激活胃癌細(xì)胞中的RAC1/PI3K/AKT通路可以通過影響細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖活力。2020年發(fā)表的研究表明，RAC1可以促進(jìn)食管癌細(xì)胞的生存能力，在食管癌細(xì)胞中下調(diào)RAC1可以通過阻斷phosphoinositide 3-kinase/AKT/mTOR通路來抑制食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。最新研究報(bào)道，轉(zhuǎn)移性前列腺癌相關(guān)基因編碼蛋白DEPDC1B能通過與RAC1結(jié)合，激活PAK1通路，誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)和促進(jìn)細(xì)胞增殖，這種DEPDC1B介導(dǎo)的致癌作用可被RAC1-GTP抑制劑或

RAC1

基因沉默所逆轉(zhuǎn)，該研究提示RAC1可能作為臨床干預(yù)轉(zhuǎn)移性前列腺癌的重要靶點(diǎn)。另有研究發(fā)現(xiàn)，c-Jun能對(duì)組織發(fā)育和疾病的不同信號(hào)進(jìn)行串?dāng)_、放大和整合。在細(xì)胞內(nèi)，c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控可通過RAC1/SAPK/JNK對(duì)c-Jun的Ser63/Ser73磷酸化實(shí)現(xiàn)，RAC1會(huì)通過干擾RAC1/SAPK/JNK/c-Jun信號(hào)的傳遞，阻斷正常細(xì)胞周期的進(jìn)行，影響細(xì)胞的增殖。上述研究表明，抑制RAC1在腫瘤細(xì)胞中的異常過表達(dá)，能夠阻斷腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。

2 RAC1對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞遷移的調(diào)控及其分子機(jī)制

腫瘤細(xì)胞的遷移由4個(gè)步驟組成：頭部細(xì)胞絲狀偽足的形成和延伸以探測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方向，緊接著細(xì)胞形成片狀偽足并建立新黏附位點(diǎn)提供細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng)所需的黏附力，最后胞體的收縮，以及細(xì)胞尾部的退縮完成一個(gè)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)周期。腫瘤細(xì)胞通過重復(fù)此4個(gè)過程不斷向前遷移。在多條信號(hào)通路中，RAC1是關(guān)鍵的調(diào)控因子，處于中樞位置，主要參與對(duì)細(xì)胞骨架重組和細(xì)胞黏附基質(zhì)的調(diào)控，進(jìn)而控制細(xì)胞的遷移過程。細(xì)胞形態(tài)改變和細(xì)胞偽足的形成是細(xì)胞侵襲遷移的起始步驟，RAC1可通過調(diào)控其下游效應(yīng)因子WASP(wiskott-aldrich syndrome protein，WASP)蛋白家族，誘發(fā)膜皺褶，促進(jìn)片狀偽足形成。新形成的片狀偽足能與周圍基質(zhì)形成黏附連接，產(chǎn)生細(xì)胞向前運(yùn)動(dòng)的錨著位點(diǎn)。細(xì)胞遷移頭部高度動(dòng)態(tài)性偽足結(jié)構(gòu)的形成依賴肌動(dòng)蛋白單體聚合和肌動(dòng)蛋白纖維的延長，WASP家族不同成員通過不同的結(jié)構(gòu)域與RAC1結(jié)合而被活化。細(xì)胞偽足的形成還依賴另一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Cofilin，Cofilin可使肌動(dòng)蛋白絲被切割，產(chǎn)生新的肌動(dòng)蛋白絲末端。RAC1通過與二聚化的PAKs(p21 activated kinases)分子的結(jié)合域PBD結(jié)合，恢復(fù)PAKs活性。見圖2，激活下游的效應(yīng)分子LIMK1/2(LIM domain kinase 1/2)，進(jìn)一步磷酸化Cofilin，使Cofilin失活，抑制肌動(dòng)蛋白絲被切割，穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白絲細(xì)胞骨架。新黏附位點(diǎn)的建立是細(xì)胞遷移的第2個(gè)步驟，細(xì)胞持續(xù)的遷移需依賴細(xì)胞偽足與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular metrax，ECM)的穩(wěn)定黏附，提供細(xì)胞向前遷移的牽引支點(diǎn)。遷移的細(xì)胞頭部與ECM的黏附，以及尾部與ECM的去黏附不斷交替使得細(xì)胞向前遷移，RAC1對(duì)這一過程發(fā)揮精確的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞表面的整合素受體與ECM中特異的配體結(jié)合，通過整合素聚集成簇而形成黏著斑復(fù)合物(focal adhesion complex，F(xiàn)AC)，并與細(xì)胞骨架相連，提供細(xì)胞遷移的錨著位點(diǎn)。活化的RAC1能激活PAK1，而PAK1能進(jìn)一步磷酸化下游的黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)，促進(jìn)新的FAC的形成。細(xì)胞胞體的收縮和細(xì)胞尾部的退縮是遷移最后的兩個(gè)環(huán)節(jié)，這兩個(gè)環(huán)節(jié)需要依靠張力纖維收縮和肌動(dòng)蛋白絲的延長提供動(dòng)力，RAC1可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，為細(xì)胞遷移提供動(dòng)力。文獻(xiàn)報(bào)道，抑制RAC1/PAK1/LIMK1通路的激活可衰減EMT，從而抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲。一項(xiàng)2018年發(fā)表的研究表明，細(xì)胞內(nèi)成熟的抗炎因子IL-37直接與RAC1的C端高變區(qū)CAAX基序結(jié)合，進(jìn)而抑制RAC1膜易位及隨后的下游信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)一步抑制細(xì)胞的遷移。目前，已經(jīng)明確RAC1在腫瘤的侵襲遷移中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用，RAC1可能作為評(píng)價(jià)腫瘤惡性程度與預(yù)測(cè)腫瘤侵襲遷移的新型標(biāo)志物。有理由相信，隨著相關(guān)研究的不斷深入，RAC1在腫瘤侵襲遷移中的作用機(jī)制會(huì)愈加明確。

圖2 RAC1-GTP激活下游效應(yīng)蛋白PAKs機(jī)制示意圖

3 RAC1對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞代謝的調(diào)控及其分子機(jī)制

糖酵解信號(hào)通路由調(diào)控糖酵解代謝的關(guān)鍵酶組成，主要包括己糖激酶(hexokinase，HK)、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PKM1/2)、丙酮酸脫氫酶和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)等。有氧情況下，丙酮酸脫氫酶復(fù)合體在NAD存在下催化丙酮酸和CoA轉(zhuǎn)化成乙酰-CoA和CO。在缺氧條件下，癌細(xì)胞或其他高度增殖的細(xì)胞，糖酵解產(chǎn)生的大部分的丙酮酸離開線粒體，通過乳酸脫氫酶的作用產(chǎn)生乳酸。一項(xiàng)2019年發(fā)表的研究表明，乳酸脫氫酶B第162位絲氨酸磷酸化會(huì)顯著增加其將丙酮酸還原為乳酸的活性，解除了丙酮酸對(duì)底物的抑制作用，導(dǎo)致丙酮酸和NADH轉(zhuǎn)化為乳酸和NAD的顯著升高，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解和腫瘤生長。缺氧條件下，糖酵解產(chǎn)物乳酸可以激活癌細(xì)胞中許多信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的存活、侵襲、遷移、免疫逃逸和血管生成。乳酸脫氫酶的啟動(dòng)子含有HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)，缺氧條件能誘導(dǎo)乳酸脫氫酶的表達(dá)，相關(guān)研究表明RAC1是HIF-1激活所必需的。2020年發(fā)表的一項(xiàng)研究結(jié)果表明，激活RAC1可以通過上調(diào)糖酵解，特別是非氧化磷酸戊糖途徑，增加核苷酸代謝，引起乳腺癌細(xì)胞的化療耐藥；該研究提示，靶向RAC1是一種克服乳腺癌獲得性化療耐藥的潛在策略。2019年發(fā)表的一項(xiàng)研究表明，在有氧條件下，抑制RAC1活性會(huì)通過抑制AKT/FOXO3a的磷酸化，影響糖酵解的關(guān)鍵酶PKM、LDHA和HK1的表達(dá)，進(jìn)一步影響細(xì)胞代謝重編程。深入研究腫瘤細(xì)胞的代謝重編程相關(guān)分子機(jī)制對(duì)腫瘤的靶向治療具有重要指導(dǎo)意義。

4 持續(xù)激活型RAC1與永久失活型RAC1

所謂的持續(xù)激活型RAC1，即RAC1蛋白能持續(xù)結(jié)合GTP，可持續(xù)向效應(yīng)器發(fā)出信號(hào)產(chǎn)生激活效果，其經(jīng)典的突變形式有RAC1V12，該突變型是RAC1蛋白的第12位氨基酸殘基由甘氨酸G突變?yōu)槔i氨酸V，詳見圖3(自繪模式圖)，該位點(diǎn)突變后，可導(dǎo)致GAPs無法水解與RAC1結(jié)合的GTP，使RAC1處于持續(xù)的激活狀態(tài)。所謂的永久失活型RAC1，即RAC1蛋白無法與GTP結(jié)合，阻止RAC1與相應(yīng)效應(yīng)物結(jié)合發(fā)揮作用，阻斷該基因調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。其經(jīng)典的突變形式有RAC1N17，該突變型是RAC1蛋白的第17位氨基酸殘基由蘇氨酸T突變?yōu)樘於０種，詳見圖3，該位點(diǎn)突變后，可阻止RAC1與GTP結(jié)合，抑制RAC1蛋白向下游效應(yīng)器發(fā)出信號(hào)產(chǎn)生失活的效果，RAC1V12和RAC1N17是對(duì)比研究RAC1蛋白功能最常用的工具。RAC1在多種腫瘤中廣泛存在著突變，激活型RAC1是驅(qū)動(dòng)腫瘤惡性演進(jìn)的重要因素。一項(xiàng)新近的研究闡述了RAC1在多種惡性腫瘤中存在的不同形式突變，在頭頸癌中發(fā)現(xiàn)RAC1C18Y/C18F突變，在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)RAC1C18Y突變，在睪丸癌中發(fā)現(xiàn)RAC1G12V突變，在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)RAC1Q61R突變，在黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)RAC1P29S突變，這些常見的突變大多發(fā)生在RAC1蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域上，通過影響RAC1蛋白中P-loop、開關(guān)Ⅰ、開關(guān)Ⅱ的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響RAC1蛋白與GTP/GDP的結(jié)合。Zeiz等報(bào)道在人體內(nèi)RAC1P29S激活型突變與惡性黑色素瘤的耐藥性和不良預(yù)后有關(guān)，該文提示，深入研究RAC1突變體調(diào)控細(xì)胞的分子機(jī)制，將有助于綜合考慮RAC1信號(hào)通路的上游與下游諸環(huán)節(jié)，為開展腫瘤的聯(lián)合分子靶向治療研究提供理論依據(jù)。

圖3 RAC1蛋白氨基酸殘基位點(diǎn)G12V和T17N突變示意圖

5 總結(jié)與展望

RAC1作為一個(gè)重要的小G蛋白，在腫瘤細(xì)胞通訊中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。RAC1通過對(duì)PAKs激酶、JNK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路和糖酵解信號(hào)通路等通路中重要靶標(biāo)分子的調(diào)控，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和代謝，進(jìn)一步影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。深入研究RAC1在惡性腫瘤演進(jìn)中的分子作用機(jī)制，可為以RAC1為靶點(diǎn)，開展惡性腫瘤分子靶向抑制劑開發(fā)提供理論依據(jù)；同時(shí)也可為以RAC1及其信號(hào)通路上下游的效應(yīng)物環(huán)節(jié)為分子靶點(diǎn)，開展惡性腫瘤聯(lián)合分子靶向治療研究提供理論指導(dǎo)。