抗蟲耐除草劑玉米對大鼠的亞慢性毒性研究

周殿明，張大龍，張靜，何寧，高崢，張倩，周曉麗，錢智勇

(天津市疾病預(yù)防控制中心毒理科，天津300011)

玉米已經(jīng)成為僅次于小麥和水稻的第三大谷類作物，是全世界多個國家的重要糧食和經(jīng)濟作物。但是，許多生物或非生物的影響，如害蟲、自然氣候和雜草等，往往會對玉米產(chǎn)業(yè)造成巨大損失。近年來，生物技術(shù)尤其是轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)的發(fā)展為玉米育種在抗除草劑和抗病蟲害方面提供了一條新的解決途徑。

本研究使用的轉(zhuǎn)基因玉米中轉(zhuǎn)入cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT 5個 基 因。cp4epsps基因來自農(nóng)桿菌CP4菌株，能夠編碼產(chǎn)生新的芳香氨基酸生物合成用蛋白，該蛋白對草甘膦的親合力大大降低，從而能使植物產(chǎn)生草甘膦抗性。Cry1Ab和Cry3Bb均屬于Bt類蛋白，Bt蛋白由蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生。Cry1Ab可以抵御歐洲玉米螟，西南玉米螟和亞洲玉米螟等鱗翅目害蟲。Cry3Bb主要作用于玉米雙斑螢葉甲等鞘翅目類昆蟲。但是，Bt蛋白本身對人類沒有任何毒性。ZmHPT來自玉米本身，可以提高植物體內(nèi)的維生素E總含量。ZmTMT同樣來自玉米，可以把低活性的γ-生育酚轉(zhuǎn)化為高活性的α-生育酚。兩個基因的結(jié)合可以顯著提高玉米的α-生育酚含量，滿足動物飼料的需要。本轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)品轉(zhuǎn)入5個基因后，使其具有抗蟲、抗草甘膦以及高維生素E含量的特性，具有重要的食用和經(jīng)濟價值，其安全性評價也就具有重要意義。

但是，轉(zhuǎn)基因生物的安全問題，即是否具有潛在的人體危害已經(jīng)受到全球范圍內(nèi)廣泛關(guān)注，成為社會熱點問題。因此轉(zhuǎn)基因生物的食用安全評價也成為該領(lǐng)域的重要工作。近年來，轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性評價已開展了大量研究工作，主要包括理化實驗和毒理學(xué)實驗。雖然大部分轉(zhuǎn)基因玉米經(jīng)過食用安全性評估表明其不具有不良反應(yīng)，但是每一個新的轉(zhuǎn)化事件的安全性仍需要根據(jù)個案評估的原則進行研究。本研究依據(jù)“實質(zhì)等同性”原則，按照《NY/T 1102—2006轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品食用安全檢測：大鼠90 d喂 養(yǎng) 試 驗 標 準》對 轉(zhuǎn)cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗蟲耐除草劑玉米進行了大鼠90 d喂養(yǎng)實驗，了解分析該轉(zhuǎn)基因玉米是否會對大鼠產(chǎn)生亞慢性毒性作用，為該轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性評價提供一定的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

轉(zhuǎn)cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗蟲耐除草劑品質(zhì)性狀改良玉米和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?親本)玉米樣品2~8℃條件下儲存。

1.2 主要儀器和試劑

Sysmex XT-2000i五分類血球計數(shù)儀，TOSHIBA TBA-40FR全自動生化分析儀，徠卡EG1140H+C包埋機，徠卡2145切片機，徠卡HI1201攤片機，徠卡ASP300脫水機，Olympus BX53DP72病理圖像分析系統(tǒng)，賽多利斯CP323S電子天平，賽多利斯TE6100-L電子天平。全自動血液分析儀專用試劑(天津鼎信醫(yī)療科技有限公司)，血生化檢測試劑盒(北京九強生物技術(shù)有限公司)。

1.3 實驗動物和飼養(yǎng)條件

選取SPF級Wistar大鼠140只，6周齡，雌雄各半。實驗在天津市疾病預(yù)防控制中心SPF級動物房中進行。環(huán)境溫度20～24℃，相對濕度40%～70%，采用人工照明按12 h/12 h明暗交替，換氣次數(shù)15次/h。動物分籠喂養(yǎng)，自由進食和飲水。

1.4 劑量設(shè)計與飼喂方式

普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后，動物按性別、體質(zhì)量隨機分成7組，每組20只，雌雄各半?；A(chǔ)飼料對照組：飼喂基礎(chǔ)維持飼料；對照玉米低劑量組：飼喂含12.5%非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩椎呐渲骑暳?；對照玉米中劑量組：飼喂含25%非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩椎呐渲骑暳希粚φ沼衩赘邉┝拷M：飼喂含50%非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩椎呐渲骑暳?；轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組：飼喂含12.5%轉(zhuǎn)基因玉米的配制飼料；轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組：飼喂含25%轉(zhuǎn)基因玉米的配制飼料；轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組：飼喂含50%轉(zhuǎn)基因玉米的配制飼料。飼喂時長為90 d。

1.5 檢測指標及方法

1.5.1 動物的一般觀察

每日觀察動物的活動情況、毛色、攝食及排泄情況，中毒癥狀及出現(xiàn)時間和死亡情況。觀察大鼠生長發(fā)育情況，記錄每周大鼠進食量和體質(zhì)量，實驗結(jié)束后計算每周進食量、體質(zhì)量、食物利用率及總進食量、總體質(zhì)量增量、總食物利用率。

1.5.2 血常規(guī)檢測

實驗?zāi)┢趧游锝?6 h后按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血。取EDTA·K抗凝全血測定紅細胞壓積、血小板計數(shù)(PLT)、紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、白細胞計數(shù)(WBC)及其分類，凝血酶原時間(PT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)。

1.5.3 血生化檢測

取全血凝集離心后的血清測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、尿 素 氮(BUN)、肌 酐(CREA)、總 膽 固 醇(CHO)、甘油三酯(TG)、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、氯(Cl)、鉀(K)、鈉(Na)生化指標。

1.5.4 解剖臟器及病理組織學(xué)檢查

解剖動物進行大體病理學(xué)檢查，取腦、心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、睪丸、附睪、子宮、卵巢稱量絕對質(zhì)量，計算臟器相對質(zhì)量(臟/體比值)。實驗結(jié)束時解剖取出實驗動物的腦、垂體、心臟、肝、肺、脾、腎、前列腺、腎上腺、胃及十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、甲狀腺、胸腺、睪丸和附睪、卵巢和子宮，各臟器各取一塊組織浸入4%中性甲醛固定液中固定，制作石蠟組織切片，常規(guī)HE染色后，病理組織學(xué)顯微鏡下觀察臟器組織學(xué)病理變化，記錄異常變化。

1.5.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式表示。多組間比較采用方差齊性檢驗，如果方差齊，進行單因素方差分析(one way ANOVA)；如果方差不齊，進行非參數(shù)檢驗。各劑量轉(zhuǎn)基因玉米組分別與對應(yīng)劑量的對照玉米組進行比較，各試驗組再與基礎(chǔ)飼料對照組進行比較，以

P

<0.05判定為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 日常觀察

結(jié)果顯示，試驗期間各組動物活動自如，被毛有光澤，鼻、眼、口腔無異常分泌物，無中毒死亡情況發(fā)生。

2.2 轉(zhuǎn)基因玉米對大鼠體質(zhì)量與進食量的影響

大鼠體質(zhì)量與進食量見表1，雄性動物對照玉米中劑量組和轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組體質(zhì)量增量高于對照組，對照玉米中劑量組總進食量高于對照組，對照玉米低劑量組、轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組和轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組食物利用率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；雌性動物體質(zhì)量增量、總進食量和總食物利用率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。其余各組進食量和體質(zhì)量與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)

表1 大鼠的體質(zhì)量增量、總進食量與總食物利用率(n=10，x±s)

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米對大鼠臟器系數(shù)的影響

轉(zhuǎn)基因玉米對大鼠臟器系數(shù)的影響見表2：雄性動物對照玉米中劑量組腦/體比低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。雌性動物轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組子宮/體高于對照玉米高劑量組，對照玉米低劑量組脾/體高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。但未見其生物學(xué)意義；其余各組臟器系數(shù)與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。

表2 各組大鼠臟器系數(shù)表(%，n=10，x±s)

2.4 轉(zhuǎn)基因玉米對大鼠血液生化指標的影響

轉(zhuǎn)基因玉米對大鼠血液生化指標的影響見表3。實驗?zāi)┢冢坌詣游镛D(zhuǎn)基因玉米高劑量組ALB高于對照玉米高劑量組；對照玉米中劑量組GGT和BUN高于對照組，對照玉米高劑量組CRE和CHO低于對照組，轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組CRE低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；但未見生物學(xué)意義。雌性動物對照玉米低劑量組AST低于對照組，對照玉米中劑量組ALP高于對照組，對照玉米高劑量組CHO低于對照組，轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組CHO低于對照組，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組ALP低于對照玉米中劑量組，BUN高于對照組，CHO低于對照組，CRE低于對照玉米中劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組BUN高于對照玉米高劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；雄性動物中，對照玉米中劑量組、對照玉米低劑量組和轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組Na低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組Na高于對照玉米中劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組K高于對照玉米低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；對照玉米中劑量組和對照玉米高劑量組Cl低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組Cl高于對照玉米高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；雌性動物中，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組Na高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；對照玉米高劑量組K高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組Cl高于對照玉米低劑量組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；但未見生物學(xué)意義。其余各組各項生化指標與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。

表3 大鼠血液生化指標(n=10，x±s)

2.5 轉(zhuǎn)基因玉米對大鼠血常規(guī)指標的影響

轉(zhuǎn)基因玉米對大鼠血常規(guī)指標的影響見表4，實驗?zāi)┢?，雄性動物轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組中性粒細胞百分比高于對照組和對照玉米低劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組中性粒細胞百分比高于對照組和對照玉米中劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組淋巴細胞百分比低于對照組和對照玉米中劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組單核細胞百分比高于對照玉米中劑量組，對照玉米低劑量組和轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組紅細胞壓積百分比低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；雌性動物對照玉米低劑量組血小板計數(shù)和單核細胞百分比均低于對照組，對照玉米高劑量組血小板計數(shù)低于對照組，嗜酸細胞百分比高于對照組，轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組單核細胞百分比高于對照玉米低劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組單核細胞百分比高于對照玉米中劑量組，轉(zhuǎn)基因玉米高劑量組嗜酸細胞百分比低于對照玉米高劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；但未見生物學(xué)意義。雄性動物轉(zhuǎn)基因玉米低劑量組和轉(zhuǎn)基因玉米中劑量組凝血酶原時間低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。上述指標均在本檢測單位正常值范圍內(nèi)，無劑量反應(yīng)關(guān)系，無生物學(xué)意義。其余各組各項指標與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。

表4 大鼠血常規(guī)指標(n=10，x±s)

2.6 病理組織學(xué)檢查結(jié)果

試驗結(jié)束后，解剖大體觀察各組主要臟器未見明顯病變。通過鏡下觀察，轉(zhuǎn)基因高劑量組、親本高劑量組與對照組比較，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因樣品引起實驗動物典型病理組織學(xué)改變和特異性損傷改變。

3 討論

將轉(zhuǎn)

cry1Ab

、

cry3Bb

、

cp4epsps

、

ZmHPT

和

ZmTMT

基因抗蟲耐除草劑品質(zhì)性狀改良玉米和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩追謩e摻入飼料(比例分別為50%、25%、12.5%)喂飼大鼠90 d，試驗期間各組動物活動自如，被毛有光澤，鼻、眼、口腔無異常分泌物，無中毒死亡情況發(fā)生。試驗期間，部分對照玉米組和轉(zhuǎn)基因玉米組動物體質(zhì)量、進食量與常規(guī)基礎(chǔ)飼料對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，部分轉(zhuǎn)基因玉米組動物體質(zhì)量、進食量與對照玉米組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，但均未見其生物學(xué)意義；其余各組動物體質(zhì)量增量、總進食量和總食物利用率與相應(yīng)對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。個別轉(zhuǎn)基因玉米組和對照玉米組動物臟體比與常規(guī)基礎(chǔ)飼料對照組比較有顯著性差異(

P

<0.05)，個別轉(zhuǎn)基因玉米組動物臟體比與對照玉米組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，但無生物學(xué)意義；其余各組動物臟體比值與相應(yīng)對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。

實驗?zāi)┢趯φ沼衩捉M和轉(zhuǎn)基因玉米組部分血液學(xué)指標、血生化指標與常規(guī)基礎(chǔ)飼料組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)基因玉米組部分血液學(xué)指標、血生化指標與對照玉米組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但均在本檢測單位正常值范圍內(nèi)，無劑量反應(yīng)關(guān)系，無生物學(xué)意義。動物解剖時，大體觀察未發(fā)現(xiàn)異常。病理組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因樣品引起實驗動物有典型病理組織學(xué)改變和特異性損傷改變。

綜上所述，采用轉(zhuǎn)cry1Ab、cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT基因抗蟲耐除草劑品質(zhì)性狀改良玉米進行大鼠90 d毒性實驗未發(fā)現(xiàn)明顯的生物學(xué)意義。本研究還將結(jié)合理化檢測實驗、轉(zhuǎn)基因表達蛋白的急性毒性實驗等研究，綜合評價該轉(zhuǎn)基因玉米的食用安全性，為進一步的安全性評價提供重要實驗依據(jù)。