以樹鼩為微核試驗(yàn)新型動物模型的初步研究

蔡綺，高德煜，史建峰，于浩，韓妍，楊柳，趙蕾，王召旭，

(1.云南省醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，云南昆明650106；2.中國食品藥品檢定研究院，北京100050；3.煙臺大學(xué)，山東煙臺264005)

樹鼩作為一種新型靈長類試驗(yàn)動物，正逐步引起國內(nèi)外科學(xué)家們的關(guān)注。樹鼩是一種類似松鼠的小型哺乳動物，屬于攀鼩目樹鼩科，廣泛分布于東南亞的熱帶、亞熱帶地區(qū)，我國主要分布在貴州、云南等省份。攀鼩目共2科5屬，分為晝行性樹鼩科和夜行性筆尾樹鼩科。我國的唯一代表樹鼩種類是樹鼩屬中的北樹鼩，又叫中緬樹鼩，而北樹鼩中的滇西亞種是目前全世界研究最廣泛的一種樹鼩類型。相比于嚙齒類，樹鼩在進(jìn)化分類、基因組解析上更接近靈長類，而相比于與人類更相似的非人類靈長類動物，具有體型小、易飼養(yǎng)、成本低、繁殖時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。研究表明，樹鼩具有與人相似的代謝過程，在代謝性疾病、神經(jīng)疾病、腫瘤等疾病中具有明顯的優(yōu)勢，在模擬人類疾病模型方面較嚙齒類與人類親緣性更揚(yáng)近，樹鼩內(nèi)分泌器官的總體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與靈長類更近似。樹鼩的全基因組測序表明樹鼩有93.4%與靈長動物相似，并且通過建立系統(tǒng)發(fā)育樹、估算分歧時(shí)間，均支持樹鼩與靈長類的親緣關(guān)系更近。樹鼩的晝夜節(jié)律與人類更接近及對壓力的敏感性均提示樹鼩能更好的模擬人類的心理疾?。徊⑶乙曈X系統(tǒng)與人類更近似，是進(jìn)行視覺系統(tǒng)疾病研究的理想模型。近年來樹鼩的基因組數(shù)據(jù)庫在不斷地豐富，在醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中許多人類病毒感染的樹鼩模型成功建立，均顯示樹鼩未來廣闊的應(yīng)用前景。最近轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成功應(yīng)用，為樹鼩模型的未來發(fā)展提供了廣闊的空間。

遺傳物質(zhì)改變引起DNA損傷的固定，被認(rèn)為具有可遺傳性，并且是惡性腫瘤發(fā)展的環(huán)節(jié)之一。遺傳毒性試驗(yàn)主要是通過一系列體內(nèi)體外試驗(yàn)來檢測樣品是否會引起基因突變、染色體結(jié)構(gòu)畸變等遺傳物質(zhì)變化的試驗(yàn)。根據(jù)檢測的遺傳學(xué)終點(diǎn)將遺傳毒性試驗(yàn)分為檢測基因突變、染色體畸變、染色體組畸變、DNA原始損傷4種類型。檢測染色體畸變的體內(nèi)微核試驗(yàn)(OECD474)中微核的形成是細(xì)胞受遺傳毒物影響的遺傳學(xué)終點(diǎn)。微核試驗(yàn)是一種可以快速檢測導(dǎo)致染色體損傷和干擾細(xì)胞有絲分裂的遺傳毒物的檢測方法，根據(jù)骨髓細(xì)胞中染色體斷裂形成微核的數(shù)量來鑒定某物質(zhì)遺傳毒性大小。

目前，國內(nèi)外樹鼩的研究主要集中于疾病模型的建立，在醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)領(lǐng)域中樹鼩還未得到應(yīng)用。因?yàn)闃潼毰c人類親緣性較近，兼具體積小、繁殖時(shí)間短、易于實(shí)驗(yàn)操作等優(yōu)勢，應(yīng)用前景廣闊。本研究以樹鼩為動物模型，建立微核試驗(yàn)體系，將樹鼩作為新型模式動物應(yīng)用于醫(yī)療器械生物相容性評價(jià)進(jìn)行初探。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物選擇

樹鼩來自中國科學(xué)院動物研究所，選擇健康、未產(chǎn)、未孕、未進(jìn)行過試驗(yàn)的樹鼩30只，雌雄各半，體質(zhì)量120~150 g，試驗(yàn)前7 d適應(yīng)環(huán)境。小鼠30只來自中國食品藥品檢定研究院試驗(yàn)動物資源研究所(SPF級)，雌雄各半，體質(zhì)量18~20 g，6~8周齡，試驗(yàn)前3 d適應(yīng)環(huán)境。

1.1.2 樣品和試劑

樣品為膠原蛋白植入劑，由山西錦波生物醫(yī)藥股份公司生產(chǎn)，批號20180101，型號III型。陽性對照品為環(huán)磷酰胺，購自阿拉丁。陰性對照品為氯化鈉，購自昆明南疆制藥有限公司。胎牛血清，購自天航生物科技有限公司；氯胺酮，購自江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 微核試驗(yàn)

將樹鼩和小鼠按照體質(zhì)量隨機(jī)分為3個(gè)組，分別是陰性對照組、樣品組和陽性對照組，每組10只，雌雄各半。樹鼩適應(yīng)環(huán)境7 d后，當(dāng)天稱量體質(zhì)量，計(jì)算給藥量進(jìn)行腹腔注射給藥。陰性對照組給予生理鹽水，樣品組給予膠原蛋白Ⅲ原液，劑量為10 mL/kg，陽性對照組給予環(huán)磷酰胺，劑量為40 mg/kg。選擇30 h兩次給藥法，第1次給藥24 h后進(jìn)行第2次給藥，給藥6 h后腹腔注射氯胺酮麻醉，腹腔主靜脈取血并放血處死樹鼩后立即解剖。股骨用75%乙醇浸泡過的紗布剔除殘余肌肉，剪斷肌骨。在載玻片上滴加10~20 μL胎牛血清，用止血鉗擠壓股骨使骨髓與血清混合，制備骨髓涂片，對樹鼩骨髓紅細(xì)胞微核進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。自然晾干后，用甲醇固定10 min，然后進(jìn)行Gimesa染色，每只樹鼩在油鏡下計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(polychromatic erythrocytes，PCE)中的微核細(xì)胞數(shù)(micronuclei，MN)，并計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞中PCE與正染紅細(xì)胞(normochromatic erythrocyte，NCE)的比值，使用Leica CTR6500顯微鏡配合圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖片采集。

小鼠陰性對照、樣品注射劑量為50 mL/kg，每只小鼠注射1 mL。陽性對照組劑量為40 mg/kg。第1次給藥24 h后進(jìn)行第2次給藥，第2次給藥6 h后測量體質(zhì)量，取血后脫頸椎致死。取股骨制備骨髓涂片，對小鼠骨髓紅細(xì)胞微核進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)，步驟同樹鼩。

1.2.2 組織病理學(xué)檢測

樹鼩注射氯胺酮麻醉后，腹腔主靜脈取血并放血，處死后立即解剖，剝離組織取肝、脾、腎，測量臟器濕質(zhì)量并立即放入10%中性甲醛固定液中固定。1周后將臟器取出做石蠟切片及蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色并通過普通光學(xué)顯微鏡觀察各器官組織的病理學(xué)特征，記錄病變程度。所采血液進(jìn)行血常規(guī)、血生化和電解質(zhì)檢測。小鼠在第2次給藥6 h后測量體質(zhì)量，取血后脫頸椎致死。取肝、脾、腎，固定、切片及染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將樣品組和陽性對照組的微核率、PCE/NCE比值和臟器系數(shù)，分別與陰性對照組進(jìn)行比較，采用雙側(cè)

t

檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠和樹鼩微核試驗(yàn)結(jié)果

在小鼠微核試驗(yàn)參考體系中，陽性對照組細(xì)胞的微核率顯著高于陰性對照組，樣品組微核率與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，根據(jù)哺乳動物紅細(xì)胞微核試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(OECD474 Mammalian Erythocyte Micronucleus Test)要求，該試驗(yàn)系統(tǒng)成立。供試樣品組小鼠微核率與陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，試驗(yàn)結(jié)果為陰性。在樹鼩的微核試驗(yàn)體系中，參考小鼠模型，試驗(yàn)系統(tǒng)成立(表2)，供試樣品組微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性，得到與小鼠微核試驗(yàn)一致的結(jié)果。

表1 小鼠微核試驗(yàn)結(jié)果

表2 樹鼩微核試驗(yàn)結(jié)果

小鼠微核試驗(yàn)中，供試樣品組PCE/NCE的比值未低于陰性對照組的20%；陰性對照組、供試樣品組的微核率<5‰，供試樣品組與陰性對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)；而陽性對照組與陰性對照組間的差異顯著(

P

<0.01)。雌性小鼠和雄性小鼠微核試驗(yàn)PCE/NCE比值和微核率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 微核試驗(yàn)骨髓細(xì)胞涂片

參考小鼠微核試驗(yàn)體系，樹鼩的微核試驗(yàn)中，供試樣品組PCE/NCE的比值未低于陰性對照組的20%；陰性對照組、供試樣品組的微核率<5‰，供試樣品組與陰性對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)；陽性對照組與陰性對照組間的差異極顯著(

P

<0.01)，雌性樹鼩和雄性樹鼩微核試驗(yàn)PCE/NCE比值和微核率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 小鼠和樹鼩血常規(guī)、血生化和電解質(zhì)檢測結(jié)果

該試驗(yàn)通過血常規(guī)、血生化和電解質(zhì)檢測，與組織病理學(xué)、臟器系數(shù)一起分析供試樣品的毒性及試驗(yàn)體系的可行性。由于小鼠血量較少，只進(jìn)行血常規(guī)檢測。

小鼠的血常規(guī)檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，樣品和陽性對照組的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、平均血小板體積等血常規(guī)生理指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)；樹鼩的血常規(guī)檢測結(jié)果顯示，陽性對照組淋巴細(xì)胞數(shù)量和百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；樹鼩的血生化指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，樣品組雌性樹鼩的谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)；樹鼩電解質(zhì)檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，樣品組的電解質(zhì)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，陽性對照組鈣離子的濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。

2.3 小鼠和樹鼩臟器系數(shù)

與陰性對照組比較，小鼠的臟器系數(shù)結(jié)果中，供試樣品結(jié)果為陰性，陽性對照組脾系數(shù)差異極顯著(

P

<0.01)，見表3。樹鼩的臟器系數(shù)與陰性對照組相比，樣品組雄性的腎系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05)，陽性對照組的脾系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

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<0.05)，見表4。

表3 小鼠臟器系數(shù)

表4 樹鼩臟器系數(shù)

2.4 小鼠和樹鼩的肝、脾、腎組織病理學(xué)檢測

觀察小鼠組織病理學(xué)切片(圖2)，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組相比，樣品組和陽性對照組的肝、脾、腎均無顯著病理學(xué)改變，脾淋巴濾泡和腎小球、腎小管均未見異常。觀察樹鼩組織病理學(xué)切片，結(jié)果顯示陰性對照組、樣品組與陽性對照組3組臟器均無顯著病理學(xué)改變，脾和腎內(nèi)部結(jié)構(gòu)也均無異常。

圖2 小鼠和樹鼩臟器組織病理學(xué)切片觀察結(jié)果

3 討論

本研究參考小鼠微核試驗(yàn)方法，建立了以樹鼩為實(shí)驗(yàn)動物的醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)模型。在樹鼩微核試驗(yàn)中，陽性對照組的骨髓紅細(xì)胞微核率顯著高于陰性對照組，該試驗(yàn)體系成立。樹鼩微核試驗(yàn)供試品的檢驗(yàn)結(jié)果與小鼠的檢驗(yàn)結(jié)果一致，綜合上述結(jié)果，證明樹鼩可以作為模式動物進(jìn)行微核試驗(yàn)評價(jià)。

在微核試驗(yàn)中，PCE/NCE的比值是表征供試品細(xì)胞毒性的重要指標(biāo)，在評價(jià)遺傳毒性前，應(yīng)首先排除細(xì)胞毒性的影響。在本研究中，樹鼩的PCE/NCE的比值雖然在可接受范圍內(nèi)，但是數(shù)值與小鼠差異明顯，推測原因可能是由于動物種屬差異和發(fā)育階段不同。另外，根據(jù)研究報(bào)道，按體質(zhì)量/體表面積折算等效劑量系數(shù)，20 g小鼠與130 g樹鼩的等效劑量系數(shù)為0.636，在試驗(yàn)中兩種動物采用的環(huán)磷酰胺劑量體積相同，造成樹鼩相對給藥量更高，也可能導(dǎo)致PCE/NCE的比值不同，需要更深入的研究和大量的試驗(yàn)樣本數(shù)值積累，為樹鼩的PCE/NCE可接受范圍提供數(shù)據(jù)參考。在微核試驗(yàn)中，環(huán)磷酰胺是一種常用的陽性劑，在本研究中，兩種動物的陽性對照組微核率均顯著升高，樹鼩不同性別的微核率差異更小。本研究旨在建立新模式動物的試驗(yàn)體系，由于兩種動物在遺傳背景、微生物控制及飼養(yǎng)條件等方面存在較大差異，我們并未對兩種動物的反應(yīng)敏感性進(jìn)行比較。

環(huán)磷酰胺作為免疫抑制劑對血液系統(tǒng)、肝、電解質(zhì)代謝等具有毒副作用，樹鼩部分指標(biāo)變化明顯。由于樹鼩的藥物注射劑量更多，導(dǎo)致樹鼩脾的臟器系數(shù)和血液、電解質(zhì)部分指標(biāo)變化比小鼠明顯。環(huán)磷酰胺會改變脾組織結(jié)構(gòu)，抑制淋巴細(xì)胞增殖；導(dǎo)致肝組織結(jié)構(gòu)損傷和急性腎損傷。因此我們對外周免疫器官脾，環(huán)磷酰胺的主要蓄積器官肝和腎進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，但是未發(fā)現(xiàn)有病理意義的結(jié)果。環(huán)磷酰胺對脾等免疫器官有明顯的抑制作用，并且由于其自身毒性會導(dǎo)致機(jī)體肝、腎出現(xiàn)水腫，與該試驗(yàn)結(jié)果兩個(gè)動物模型的臟器系數(shù)脾下降，而肝和腎升高一致。樹鼩陰性樣品發(fā)現(xiàn)雄性脾的臟器系數(shù)略高于雌性，雌性肝、腎系數(shù)略高于雄性，與相關(guān)研究結(jié)果一致。結(jié)合樹鼩的微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果，雄性比雌性變化大，推測雄性樹鼩比雌性更敏感，該猜測需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，我們發(fā)現(xiàn)相比于小鼠的臟器系數(shù)，樹鼩的臟器系數(shù)與人類更接近。以中國男性的臟器系數(shù)(脾0.28%、肝2.35%、腎0.48%)為例，陰性對照組樹鼩臟器系數(shù)(脾0.14%、肝3.28%、腎0.81%)對比陰性對照組小鼠的臟器系數(shù)(脾0.48%、肝5.14%、腎1.02%)更加接近于人類。

本研究將樹鼩作為動物模型，進(jìn)行了醫(yī)療器械生物相容性評價(jià)的首次探索。在本試驗(yàn)體系下，相較于小鼠，樹鼩需要單籠單只飼養(yǎng)，動物飼養(yǎng)成本更高，樹鼩在動物質(zhì)量控制相關(guān)條件和標(biāo)準(zhǔn)方面與小鼠仍具有很大差距，但是樹鼩的應(yīng)用潛力已經(jīng)引起越來越多的關(guān)注，相關(guān)質(zhì)量控制方法和標(biāo)準(zhǔn)正在研究和制定，樹鼩在動物模型中的缺點(diǎn)在逐步解決。未來，樹鼩在試驗(yàn)動物領(lǐng)域?qū)⒌玫礁訌V泛的應(yīng)用。

(感謝中國科學(xué)院昆明動物研究所靈長類研究中心和中國科學(xué)院昆明動物研究所藥物安全評價(jià)中心各位老師對本研究工作的協(xié)助)