PM2.5對HK-2細胞氧化損傷和凋亡的影響

李柏茹，秦雙建，關嵐，李閏冰，蔡穎，蒲桔寧，曾明，肖芳，徐新云

(1.深圳市疾病預防控制中心，廣東深圳518055；2.中南大學湘雅公共衛(wèi)生學院，湖南長沙410078；3.南華大學公共衛(wèi)生學院，湖南衡陽421001)

隨著經(jīng)濟迅速發(fā)展，環(huán)境污染問題日益突出。在大氣污染物中占主要成分的大氣細顆粒物(fine particulate matter，PM)是指空氣動力學當量直徑≤2.5 μm的顆粒物，因其比表面積大故可以吸附大量的有毒有害物質(zhì)，例如重金屬和有機物等。PM可以通過呼吸作用進入深部呼吸道，利用血液運輸?shù)竭_身體的各個部位，甚至可能對心血管系統(tǒng)和腎臟造成損害。2013年“全球疾病負擔研究”顯示，暴露于環(huán)境可吸入顆粒物在全球殘疾調(diào)整壽命年風險因素中排名第12位。PM可以通過誘導氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應等對機體產(chǎn)生損傷。一項關于PM短期暴露的實驗研究發(fā)現(xiàn)，PM可加重小鼠的氧化應激和炎癥反應從而導致小鼠腎臟損傷。另一項研究發(fā)現(xiàn)PM可能通過p38MAPK和ERK1/2信號通路來誘導細胞發(fā)生氧化應激損傷。短暫的PM暴露與內(nèi)皮細胞凋亡增加、T淋巴細胞水平升高等有關，并且這些變化可能導致動脈粥樣硬化和急性冠狀動脈后遺癥。研究發(fā)現(xiàn)PM暴露不但可誘導活性氧生成還可導致細胞凋亡，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-486可以靶向負調(diào)控PTEN和FOXO1的蛋白水平以減輕PM誘導的細胞凋亡。還有研究指出PM可以激活血管內(nèi)皮細胞中COX-2/PGES/PGE2的炎癥軸，促進細胞凋亡和炎癥反應。盡管當前已經(jīng)進行了很多關于PM和細胞氧化損傷及凋亡的研究，但是鮮有關于PM導致人類正常腎細胞氧化損傷及凋亡的研究報道，因此本文以人腎上皮HK-2細胞為研究對象，探討PM處理后對腎細胞氧化損傷和凋亡的影響及分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Annexin V-APC/7-AAD凋亡試劑盒(APl05)購于聯(lián)科生物公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、微量還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；HK-2細胞購于中國上海細胞庫，0.25% Trpsin-EDTA、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國Gibco公司。

1.2 PM2.5樣品采集與制備

用武漢天虹TH150F中流量采樣器和80 mm直徑的石英濾膜，按100 L/min的流量連續(xù)采樣3 d，每天24 h不間斷，采樣地點在太原山西大學校園和深圳市疾病預防控制中心樓頂。對吸附有PM的濾膜稱質(zhì)量后剪成2 cm×2 cm小塊放于燒杯中，加入超純水完全浸沒濾膜，用一層錫箔紙使燒杯口密封，超聲振蕩30 min后取出濾膜，將PM樣品懸濁液轉(zhuǎn)移到干凈的真空冷凍物料盤中，再次用錫箔紙密封后于-80℃冰箱冷凍24 h；用封口膜替換錫箔紙，并在膜上點密集的小孔，于真空冷凍干燥機中干燥24 h至PM完全干燥；然后在無菌工作臺中用超純水溶解干燥的PM顆粒，混合均勻，將PM混懸液分裝標記后于-20℃保存待用，每次使用前振蕩混勻。

1.3 HK-2細胞培養(yǎng)與PM2.5處理分組

使用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于37℃、CO體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HK-2細胞，待細胞狀態(tài)穩(wěn)定且匯合度達80%時使用DMEM稀釋的PM培養(yǎng)液進行處理，根據(jù)前期CCK-8試驗得到深圳市和太原市PM處理HK-2細胞的IC分別為136和95.98 μg/mL，Cr處理HK-2細胞的IC為16.75 μmol/L，因此本文設置PM濃度為50 μg/mL，陽性對照組Cr濃度為10 μmol/L，在培養(yǎng)箱中處理24 h后收集細胞，進行各指標檢測。

1.4 檢測細胞氧化損傷

PM處理細胞24 h后，吸出培養(yǎng)液，用冷PBS洗3次，加入免疫沉淀(immunol precipitation，IP)細胞裂解 液(碧 云 天，P0013)400 μL對25 cm培 養(yǎng) 瓶(Corning，430639)中細胞裂解30 min，用細胞刮將細胞從培養(yǎng)瓶刮下，細胞混合物移入1.5 mL EP管中并在冰上超聲破碎5 s，間斷3 s，重復5次，于14 000 r/min在4℃離心20 min，取上清液于-80℃冰箱保存；用二辛可寧酸法(BCA法)進行樣品蛋白定量；嚴格按照試劑盒說明書進行MDA含量、SOD活性、GSH含量和GSH-PX活性的檢測和計算。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集PM處理24 h的細胞于1.5 mL EP管中，加入l mL預冷的PBS，離心3 min后棄去上清(重復兩次)；將試劑盒中的5×結(jié)合緩沖液用去離子水稀釋為工作液(1×)，取適量預冷的工作液加入到EP管中并吹打重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×10~1×10個/mL。每組取100 μL細胞懸液到1.5 mL EP管中，分別加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-AAD，輕微混勻后室溫避光孵育15 min；無需洗滌，每管再加380 μL預冷的工作液并充分吹打混勻；上流式細胞儀檢測分析。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，所有實驗重復3次；應用SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用方差分析進行組間比較，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞氧化損傷檢測結(jié)果

PM處理HK-2細胞24 h后，結(jié)果顯示：與陰性對照組相比，深圳PM樣品組、太原PM樣品組和陽性對照組中MDA的濃度依次升高，分別升高8.16%、34.51%和72.23%(圖1A)；SOD活性依次降低，分別降低7.49%、19.67%和29.55%(圖1B)；GSH的濃度依次降低，分別降低10.43%、16.39%和37.43%(圖1C)。太原PM樣品組與陰性對照組的差異均有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05或

P

<0.01)；GSH-PX的活性分別降低42.70%、61.62%和60.98%，3組與陰性對照組間的差異均有統(tǒng)計學意義(

P

<0.01，圖1D)。

圖1 PM2.5處理HK-2細胞后MDA、SOD、GSH和GSH-PX的變化

2.2 細胞凋亡情況的變化

如圖2所示，HK-2細胞經(jīng)過24 h處理后，流式細胞術結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，深圳PM樣品組、太原PM樣品組和陽性對照組的細胞凋亡率分別升高197.25%、301.22%和399.08%，差異均有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05或

P

<0.01)。

圖2 PM2.5處理HK-2細胞對細胞凋亡率的影響

3 討論

根據(jù)全球疾病負擔研究，2015年環(huán)境PM的暴露導致了全球420萬人死亡。在中國，100多萬人的死亡可歸因于PM的暴露。Huang等在一項國家橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)長期暴露于濃度范圍較廣的PM與慢性腎臟疾病患病率增加存在相關性。也有學者研究發(fā)現(xiàn)室外空氣污染與腎癌的發(fā)生有著密切聯(lián)系。以往關于PM對腎臟毒性的研究大多為對大鼠進行急性或亞急性染毒，很少有低濃度PM對腎細胞進行處理探討氧化損傷和凋亡的研究，因此本研究針對HK-2細胞PM處理前后氧化損傷和凋亡情況進行了測定。

在正常生理情況下，機體內(nèi)的氧化和抗氧化防御系統(tǒng)處于動態(tài)平衡，當外界有害因素作用于機體時，平衡遭到破壞，ROS產(chǎn)生過多、脂質(zhì)過氧化，并最終對機體細胞、組織造成損傷，激活促腫瘤原性信號傳導，增強細胞存活和增殖并造成DNA損傷。機體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物，其中的MDA含量可以反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，即受自由基攻擊的嚴重程度，MDA含量越高可以間接反映出細胞損傷程度越大。SOD能清除超氧陰離子自由基保護細胞免受損傷，對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關重要的作用，SOD活性的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，SOD的活性越低代表細胞的抗氧化能力越差。GSH是機體內(nèi)最重要的非酶性抗氧化物，具有清除自由基、解毒、促進鐵質(zhì)吸收及維持紅細胞膜的完整性、維持脫氧核糖核酸的生物合成、細胞的正常生長發(fā)育及細胞免疫等多種重要生理功能，GSH含量是衡量機體抗氧化能力的重要因素，GSH含量越低同樣代表機體抗氧化能力越差。GSH-PX可以起到保護細胞膜結(jié)構和功能完整的作用，如果GSH-PX含量降低，將無法正常消除氧自由基及保護機體免受氧化損傷。此前鮮有關于PM處理HK-2細胞發(fā)生氧化損傷以及誘導細胞凋亡的相關研究報道，而Cr已經(jīng)被證實可以誘導細胞產(chǎn)生氧化損傷和凋亡，因此本研究中選擇Cr處理的HK-2細胞作為陽性對照組來幫助我們了解PM是否可以誘導HK-2細胞產(chǎn)生氧化損傷和細胞凋亡。查閱文獻后我們選取了4個可以反映細胞氧化損傷情況的經(jīng)典指標即MDA、SOD、GSH和GSH-PX，各處理組與對照組相應指標進行比較，若指標變化情況同陽性對照組變化情況類似，我們則認為PM可以導致細胞發(fā)生氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)：與陰性對照組相比，深圳、太原市PM樣品組和陽性對照組MDA含量依次升高，SOD活性、GSH含量和GSH-PX活性依次降低，該結(jié)果種變化情況與PM致其他細胞系氧化損傷的結(jié)果相同。本研究結(jié)果顯示Cr具有導致HK-2細胞發(fā)生氧化損傷的作用，深圳市和太原市PM均可引起HK-2氧化損傷指標發(fā)生與Cr處理后相類似的變化，說明兩市PM都可以導致HK-2細胞發(fā)生氧化損傷，且太原市PM的作用強于深圳市PM。

細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的自主有序的細胞死亡。它涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等作用，是細胞適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。細胞凋亡和細胞增殖都是生命的基本現(xiàn)象，在胚胎發(fā)育階段細胞凋亡可以清除多余的和已完成使命的細胞，保證胚胎正常發(fā)育；在成年階段細胞凋亡可以清除衰老和病變的細胞，保證機體健康。迄今為止凋亡過程確切機制尚不完全清楚，但當射線、藥物或者發(fā)生腫瘤、自身免疫性疾病時凋亡過程會發(fā)生紊亂。本研究發(fā)現(xiàn)，兩市PM樣品組細胞相較于陰性對照組凋亡率均增加，說明深圳和太原市PM可以誘導正常腎細胞發(fā)生凋亡。氧化應激不僅與疾病的發(fā)生發(fā)展有關，并且與細胞凋亡有密切關系。PM可以通過引起腎小管上皮細胞氧化應激反應加重進而產(chǎn)生細胞損傷并且導致細胞發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，在致氧化損傷和致凋亡兩個方面，太原市PM作用均強于深圳市PM。細顆粒物含有多種危害人體健康的物質(zhì)，其中包括部分具有致突變和致癌作用的重金屬和多環(huán)芳烴類(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)有機污染物。本實驗室前期對PM成分進行了檢測分析，利用氣相色譜-質(zhì)譜法測定深圳市(南方城市)和太原市(北方城市)在2018—2019年間PM中16種多環(huán)芳烴的含量，發(fā)現(xiàn)太原PM多種PAHs濃度均高于深圳，特別是苯并(b)熒蒽、苯并(a)芘等顯著高于深圳(P<0.01)。PAHs進入人體會經(jīng)過代謝產(chǎn)生可與DNA共價結(jié)合形成DNA加合物的代謝物，之后在人體進行生物轉(zhuǎn)化形成大量活性氧，造成DNA氧化性損傷進而誘導癌癥的發(fā)生。本實驗室前期測定2017—2018年深圳和太原市PM中的金屬元素，發(fā)現(xiàn)深圳市和太原市PM中排名靠前的金屬元素有Al、Pb、Mn、Cr、Cu、V、Ce、As、Ni等，其中太原市PM中的Pb、Al、As、Ni和Mn含量均高于深圳市PM(P<0.05)。As、Ni、Cr與多種癌癥有關，并且具有明顯致癌致突變作用，這提示持續(xù)暴露于空氣中低濃度的PM可對人體健康產(chǎn)生危害。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PM處理后可引起腎HK-2細胞發(fā)生氧化損傷以及凋亡，PM可能通過致細胞氧化損傷和凋亡的方式發(fā)揮細胞毒性。本研究結(jié)果為今后深入探討PM對腎臟的損傷提供了基礎數(shù)據(jù)。