高效液相色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)瀉白散及其3 種單味藥內(nèi)在質(zhì)量

張會(huì)敏，楊宗統(tǒng)，蘇本正，李曉晶，劉瑾，李群，隋在云

（山東省中醫(yī)藥研究院，濟(jì)南 250014）

瀉白散出自宋代錢乙的《小兒藥證直決》［1］，收錄于2018 年中國(guó)中醫(yī)藥管理局下發(fā)的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》［2］。瀉白散由桑白皮（炒黃）、地骨皮、炙甘草和粳米組成，為煮散劑，具有清泄肺熱，止咳平喘之功效。其中，桑白皮［3］為生長(zhǎng)數(shù)十年的桑樹除去外表粗皮的干燥根皮，其內(nèi)在質(zhì)量受生長(zhǎng)年限影響較大。目前地骨皮［4］主要為野生資源，其內(nèi)在質(zhì)量受生長(zhǎng)環(huán)境影響較大。甘草［5］多為栽培品，生長(zhǎng)時(shí)間多為2～3 年，其內(nèi)在質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。粳米的主要成分為淀粉和蛋白質(zhì)，有無(wú)粳米對(duì)瀉白散的特征圖譜無(wú)影響［6］。鑒于市售桑白皮、地骨皮藥材質(zhì)量受生長(zhǎng)年限等因素影響較大，內(nèi)在質(zhì)量參差不齊，開展經(jīng)典名方瀉白散指紋圖譜研究，以評(píng)估瀉白散組方中來(lái)自全國(guó)不同地區(qū)市售炒桑白皮、地骨皮、炙甘草的內(nèi)在質(zhì)量具有重要意義。

黃夢(mèng)婷等［7］分析了桑白皮炮制前后指紋圖譜和色度值的差異性；曹斯瓊等［8］標(biāo)定了桑白皮14個(gè)共有峰；董丹華等［9］對(duì)不同產(chǎn)地的15 批次地骨皮藥材進(jìn)行研究，確定了4 個(gè)特征峰；陳倩倩等［10］對(duì)47 批次地骨皮飲片進(jìn)行質(zhì)量分析，發(fā)現(xiàn)不同廠家的地骨皮質(zhì)量差異較大；趙曉玲等［11］測(cè)定并比較不同來(lái)源地骨皮藥材（包括野生、栽培和市售）中地骨皮甲素、乙素和阿魏酸的含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地地骨皮各成分差異較大。自2018 年《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》發(fā)布以來(lái)，對(duì)目錄中經(jīng)典名方的研究逐漸增多［12-14］，但對(duì)瀉白散高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的研究相對(duì)較少，王彥帥等［15］在瀉白散的共有峰中指認(rèn)了桑皮苷A、甘草苷、甘草酸銨3 種物質(zhì)；王彥等［16］在瀉白散物質(zhì)基準(zhǔn)的指紋圖譜中，歸屬了10 個(gè)特征峰，其中2 個(gè)來(lái)自炒桑白皮、4 個(gè)來(lái)自焙地骨皮、4 個(gè)來(lái)自炙甘草。為了摸清市售炒桑白皮、地骨皮、炙甘草內(nèi)在質(zhì)量，保證瀉白散臨床用藥質(zhì)量及療效，筆者建立HPLC 指紋圖譜方法并指認(rèn)3 種單味藥的成分，對(duì)全國(guó)不同地區(qū)市售炒桑白皮、地骨皮、炙甘草進(jìn)行內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為瀉白散經(jīng)典名方的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定及臨床用藥提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：2690／5 型，配備2996 DAD檢測(cè)器、全自動(dòng)進(jìn)樣器、高效液相色譜工作站，美國(guó)Waters 公司。

電子分析天平：XS205DU 型，感量為0.000 1 g，瑞士梅特勒-托利多公司。

桑白皮、地骨皮、炙甘草樣品：從全國(guó)各地收集桑白皮、地骨皮、炙甘草各13 批樣品，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源研究室鑒定均為《中國(guó)藥典》正品。桑白皮按照2015 年版《浙江省中藥炮制規(guī)范》照清炒法炮制成炒桑白皮。13 個(gè)瀉白散組方及樣品信息見表1。

表1 瀉白散組方及樣品信息

桑辛素、甘草酸、異甘草素、桑皮苷A、地骨皮乙素、芹糖甘草苷、甘草素、異甘草苷、甘草苷、綠原酸對(duì)照品：含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）均大于96%，批號(hào)分別為P 0 9 J 7 F 8 7 6 7、P 3 1 J 9 F 6 6 9 6 6、Z 0 2 M 3 L 1、P12M9L61177、P22F10F81304、R03A9F67328、Z20J8X40265、R07D8F50056、Z10J8X39611、Y24J7K16726，上海源葉生物科技有限公司。

甘草酸銨、東莨菪內(nèi)酯、大黃素對(duì)照品：含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）均大于96%，批號(hào)分別為110731-201720、110768-200504、110756-201913，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

乙腈、甲醇：均為色譜純，美國(guó)BCL 公司。

磷酸：分析純，天津市科密歐試劑公司。

中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件：2004A 版，國(guó)家藥典委員會(huì)。

實(shí)驗(yàn)用水：純凈水，屈臣氏集團(tuán)（香港）有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18柱（250 nm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司），填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠；檢測(cè)器：二級(jí)管陣列檢測(cè)器；柱溫：30 ℃；流量：1 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，進(jìn)樣體積：5 μL；分析時(shí)間：120 min；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

1.3 溶液制備

1.3.1 對(duì)照品溶液

精密稱取桑辛素、甘草酸、異甘草素、桑皮苷A、地骨皮乙素、芹糖甘草苷、甘草素、異甘草苷、甘草苷、綠原酸、甘草酸銨、東莨菪內(nèi)酯、大黃素對(duì)照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為30、82、53、65、60、20、95、100、77、85、80、165、38 μg／mL 的 對(duì) 照品溶液。

1.3.2 供試品溶液

按照《小兒藥證直訣》中瀉白散配比，取適量炒桑白皮、地骨皮、炙甘草，粉碎，過(guò)孔徑為（250±9.9）μm（65 目）篩，混合均勻，制成試驗(yàn)用瀉白散粉末。精密稱取1.00 g 瀉白散粉末，加水至30 mL，回流提取1 h，放冷，補(bǔ)重，以3 000 r／min 離心5 min，過(guò)濾上清液，取續(xù)濾液10 mL，按照體積比為1∶1 加入甲醇，混勻，靜置過(guò)夜，過(guò)濾上清液，濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得瀉白散供試品溶液，備用。同法分別制備不同批次的瀉白散、炒桑白皮、地骨皮、炙甘草供試品溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

采用高效液相色譜法，按1.2 色譜條件測(cè)定瀉白散及其3 種單味藥飲片樣品溶液，得到各批瀉白散、單味藥高效液相色譜指紋圖譜，計(jì)算各批瀉白散樣品之間、單味藥樣品之間、對(duì)照品與瀉白散樣品之間指紋圖譜的相似度，對(duì)瀉白散中的共有色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

分別考察了甲醇-甲酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液系統(tǒng)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%甲酸水溶液條件下色譜峰分離度較好，基線穩(wěn)定，故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液進(jìn)行優(yōu)化梯度洗脫條件；分別比較60、100、120、150 min 的檢測(cè)時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)120、150 min 均可檢測(cè)出瀉白散中所有的色譜峰，為節(jié)省時(shí)間，選擇檢測(cè)時(shí)間為120 min；采用DAD-UV 檢測(cè)器對(duì)200～400 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)在254 nm 波長(zhǎng)下，色譜峰最多，瀉白散信息量最大，最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

2.2 料液比的優(yōu)化

《小兒藥證直訣》記載瀉白散制法［5］及用法“上銼散，入粳米一撮，水二小盞，煎七分，食前服”，依據(jù)《浙江省中藥炮制規(guī)范》（2015 年版）確定炒桑白皮工藝為取桑白皮飲片，照清炒法炒至表面微黃，微具焦斑時(shí)，取出攤涼。參考王彥帥等［6］確定的經(jīng)典名方瀉白散物質(zhì)基準(zhǔn)制備工藝：取炒桑白皮3.93 g，焙地骨皮3.93 g，炙甘草0.39 g，粳米1.50 g，加水360 mL 煎煮，料液比約為1∶37。遵循古代經(jīng)方制法、煎煮原則，分別將炒桑白皮、地骨皮、炙甘草粉碎，過(guò)孔徑為（250±9.9） μm 篩，進(jìn)行加熱回流提取，最終確定料液比為1∶30，較為接近古代煎煮工藝。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 精密度試驗(yàn)

取桑皮苷A 對(duì)照品溶液，在1.2 色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取瀉白散組方X10 樣品，按1.3.2 制備樣品溶液，在1.2 色譜條件下，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣6 次，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%～1.02%，其中各主要色譜峰保留時(shí)間無(wú)明顯變化，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01%～1.21%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取瀉白散組方X10 樣品，按1.3.2 制備樣品溶液6 份，在1.2 色譜條件下各進(jìn)1 次，記錄色譜峰面積。結(jié)果顯示，色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.25%～2.85%，其中各主要色譜峰的保留時(shí)間無(wú)明顯變化，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.13%～1.56%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜的建立

2.4.1 炒桑白皮指紋圖譜測(cè)定

將13 批全國(guó)不同飲片企業(yè)市售桑白皮炒制品（S1～S13）按照1.3.2 制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下測(cè)定，將色譜圖導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A 版），HPLC 指紋圖譜匹配結(jié)果見圖1。由圖1 可知，13 個(gè)批次之間的相似度為0.024～0.975，差別非常大，炒桑白皮樣品S8 中，各成分的含量非常低，雖然外觀性狀符合炒桑白皮正品特征，但內(nèi)在質(zhì)量非常差，推測(cè)該樣品可能存放時(shí)間太久所致。除S8 炒桑白皮樣品外，其它12 批炒桑白皮僅有7 個(gè)共有峰。

圖1 13 批炒桑白皮指紋圖譜匹配圖

2.4.2 地骨皮指紋圖譜

將13 批全國(guó)不同飲片企業(yè)市售地骨皮（D1～D13）按照1.3.2 制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下測(cè)定，將色譜圖導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A 版），HPLC 指紋圖譜匹配結(jié)果見圖2。由圖2 可知，13 個(gè)批次之間的相似度為0.061～0.983，差別非常大，地骨皮樣品D11、D12、D13 與其它樣品的相似度非常低，D12、D13 色譜峰數(shù)量及分布與其它地骨皮樣品差別較大，雖然外觀性狀均符合地骨皮正品特征，但內(nèi)在質(zhì)量差異較大。13 批地骨皮僅有4 個(gè)共有峰。

圖2 13 批地骨皮指紋圖譜匹配圖

2.4.3 炙甘草指紋圖譜

將13 批全國(guó)不同飲片企業(yè)市售炙甘草（G1～G13）按照1.3.2 制備供試品溶液，在1.2 色譜條件下測(cè)定，將色譜圖導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2004A 版），HPLC 指紋圖譜匹配結(jié)果見圖3。由圖3 可知，結(jié)果顯示，13 個(gè)批次之間的相似度為0.978～0.998，相似度非常高，13 批炙甘草共有37 個(gè)共有峰，表明13 批全國(guó)不同飲片企業(yè)市售炙甘草質(zhì)量穩(wěn)定、可控。

圖3 13 批炙甘草指紋圖譜匹配圖

2.4.4 瀉白散指紋圖譜及特征峰指認(rèn)

通過(guò)與對(duì)照藥材比對(duì)，單味藥炒桑白皮S10、地骨皮D10、炙甘草G11 與各對(duì)照品相似度較高、且外觀性狀較佳，故將單味藥（S10、D10、G11）組合成瀉白散樣品X14。按照1.3.2 制備瀉白散供試品溶液，在1.2 色譜條件下測(cè)定，一并對(duì)14 批瀉白散組方（X1～X13）進(jìn)行指紋圖譜研究，結(jié)果見圖4。

圖4 14 批瀉白散組方指紋圖譜匹配圖

將瀉白散與桑辛素、甘草酸、異甘草素、桑皮苷A、地骨皮乙素、芹糖甘草苷、甘草素、異甘草苷、甘草苷、綠原酸、甘草酸銨、東莨菪內(nèi)酯、大黃素13 種對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)地骨皮乙素、綠原酸、甘草苷、芹糖甘草苷、異甘草苷、甘草酸、甘草酸銨7 種對(duì)照品在瀉白散指紋圖譜中有對(duì)應(yīng)峰，匹配情況見表3。由表3 可知，甘草苷與芹糖甘草苷、甘草酸與甘草酸銨對(duì)應(yīng)同一個(gè)色譜峰，推測(cè)原因可能是甘草苷與芹糖甘草苷極性相似導(dǎo)致此色譜條件下不能完全分離；甘草酸銨在酸性溶液中游離，實(shí)際上測(cè)定的都是甘草酸對(duì)應(yīng)的色譜峰。通過(guò)對(duì)14 個(gè)瀉白散組方的水煎液進(jìn)行HPLC 指紋圖譜分析，共有峰匹配情況見表4。由表4 可知，14 個(gè)瀉白散組方的水煎液有9 個(gè)共有峰，其中可指認(rèn)地骨皮乙素、異甘草苷、甘草酸3 個(gè)共有峰。

表3 瀉白散與對(duì)照品匹配情況

表4 瀉白散14 個(gè)組方共有峰匹配情況

3 結(jié)語(yǔ)

采用HPLC 指紋圖譜方法對(duì)瀉白散中3 種單味藥飲片及瀉白散進(jìn)行了內(nèi)在質(zhì)量整體評(píng)價(jià)。所建立的HPLC 指紋圖譜方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。所收集的樣品遍布全國(guó)各大中藥材市場(chǎng)及醫(yī)院藥店，代表性廣，能夠較真實(shí)的反應(yīng)市售瀉白散及三種單味藥的內(nèi)在質(zhì)量情況，由研究結(jié)果可知市售桑白皮、地骨皮飲片質(zhì)量參差不齊，質(zhì)量不穩(wěn)定，應(yīng)該提升瀉白散質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，保證經(jīng)典名方瀉白散臨床療效的發(fā)揮。