基于特征圖譜及主要成分含量比例特征鑒別制草烏及其偽品

高妍，過(guò)立農(nóng)，劉杰，馬雙成，鄭健，昝珂

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

草烏是一種常用中藥材，味辛、苦，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效。2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）收載草烏為毛茛科植物北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥塊根，主要用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛［1］。草烏主要分布于山西、河北、內(nèi)蒙古和東北三省等地［2］，有大毒，含有烏頭堿等雙酯型生物堿等劇毒成分，需炮制后使用［3-5］。

制草烏屬于草烏的加工炮制品，功效同草烏，是104 個(gè)中藥成方制劑的處方藥味?？偵飰A為制草烏的有效成分和毒性成分。草烏經(jīng)炮制后，毒性強(qiáng)的雙酯型生物堿水解為單酯型生物堿。研究表明，雖然單酯型生物堿的毒性是雙酯型生物堿毒性的1／150～1／500，但毒性依然較強(qiáng)，長(zhǎng)期或超量使用會(huì)引起中毒癥狀，如口唇和四肢麻痹等，嚴(yán)重者可危及生命［6-8］。2020 年版《中國(guó)藥典》中制草烏含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定，制草烏中含苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的總量應(yīng)為0.020%～0.070%［1］。

在近幾年開(kāi)展的藥材市場(chǎng)抽樣檢驗(yàn)工作中，發(fā)現(xiàn)一種制草烏偽品，該偽品經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院鑒定為毛茛科植物準(zhǔn)噶爾烏頭Aconitum soongaricum (Regel)Stapf 干燥根的炮制品。對(duì)收集的制草烏偽品按照2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）相關(guān)規(guī)定進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)樣品中苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿的總量結(jié)果均不符合規(guī)定，若制劑投料中混有該偽品，將造成安全隱患。

采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定制草烏藥材中的生物堿已有報(bào)道［9-15］，但制草烏的特征圖譜以及3 種指標(biāo)性成分的含量比例特征，特別是結(jié)合偽品進(jìn)行分析，尚未有報(bào)道。筆者采用HPLC 法建立了制草烏和偽品的特征圖譜，并對(duì)苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿3 種有效成分開(kāi)展含量測(cè)定，分析并探討制草烏及其偽品的含量特征，建立制草烏準(zhǔn)確、快速的鑒別方法，為規(guī)范制草烏藥材的使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Agilent 1260 型，配備二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技公司。

電子天平：（1）QUINTIX313-1CN 型，感量為0.1 mg；（2）MSE125 s 型，感量為0.01 mg，德國(guó)賽多利斯公司。

色譜柱： XBridge C18柱（250×4.6 mm，5 μm），填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠，沃特世科技（上海）有限公司。

苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為97.5%，批號(hào)為111794-201304，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為96.3%，批號(hào)為111795-201303，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為94.6%，批號(hào)為111796-201304，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈、冰乙酸、乙酸銨和異丙醇：均為色譜純，美國(guó)Fisher 公司。

三氯甲烷：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

氨水：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

草烏藥材樣品：共收集30 批制草烏藥材樣品。其中20 批正品藥材（編號(hào)為1#～20#），經(jīng)中國(guó)食品藥品檢定研究院鑒定為毛茛科北烏頭干燥塊根的加工炮制品；10 批偽品（編號(hào)為21#～30#）鑒定為毛茛科植物準(zhǔn)噶爾烏頭根的加工炮制品。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱(chēng)取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品適量于10 mL 容量瓶中，以異丙醇-三氯甲烷（體積比為1∶1）混合溶液定容至標(biāo)線(xiàn)，即得各對(duì)照品儲(chǔ)備液。再分別取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于容量瓶中，用異丙醇-三氯甲烷（體積比為1∶1）混合溶液定容至標(biāo)線(xiàn)，即得苯甲酰新烏頭原堿質(zhì)量濃度為68 μg／mL、苯甲酰烏頭原堿質(zhì)量濃度為16 μg／mL、苯甲酰次烏頭原堿質(zhì)量濃度為79 μg／mL 的對(duì)照品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 供試品溶液的制備

取樣品過(guò)355±13 μm 的篩（三號(hào)篩），取約2 g粉末，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，加氨水3 mL，精密加入異丙醇-乙酸乙酯（體積比為1∶1）混合溶液50 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率為250 W，頻率為33 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液25 mL，于40 ℃以下減壓回收溶劑至干，向殘?jiān)芯芗尤氘惐?三氯甲烷混合溶液3 mL 溶解，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.4 液相色譜條件

色 譜 柱：Waters XBridge C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，沃特世科技（上海）有限公司]；流動(dòng)相：A 為乙腈-四氫呋喃（體積比為25∶15），B 為0.1 mol／L 乙酸銨水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）；梯度洗脫條件：0～48 min，15%～26%A；流量：1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm。

1.5 制草烏和偽品的特征圖譜的建立

在上述條件下取得制草烏正、偽品色譜圖，采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件分析采集得到的數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰對(duì)齊處理，并指認(rèn)特征峰。通過(guò)精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性考察，對(duì)建立的特征圖譜進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)一步計(jì)算特征圖譜與制草烏正品、偽品的相似度以及聚類(lèi)結(jié)果，分析建立的特征圖譜是否能夠成功鑒別制草烏正、偽品。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜流動(dòng)相選擇

考察了乙腈-水、乙腈-0.1 mol／L 乙酸銨水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）以及2020 年版《中國(guó)藥典》（一部）制草烏項(xiàng)下［1］采用的A 相為乙腈-四氫呋喃（體積比為25∶15），B 相為0.1 mol／L乙酸銨水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）的流動(dòng)相體系下主成分的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水、乙腈-0.1 mol／L 乙酸銨水溶液（每1 000 mL 加冰乙酸0.5 mL）條件下主成分的色譜峰形不理想且分離度差，因此，最終按照2020 年版《中國(guó)藥典》 （一部）制草烏項(xiàng)下“含量測(cè)定”的方法進(jìn)行測(cè)定，也因此不再進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

2.2 制草烏特征圖譜

分別精密稱(chēng)量制草烏樣品（樣品1#～20#），按1.3方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)量，記錄25 min的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1 所示。采用Chempattern化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件分析采集所得數(shù)據(jù)，將樣品1#設(shè)定為參照?qǐng)D譜，自動(dòng)匹配其它樣品，生成制草烏正品的特征圖譜見(jiàn)圖2 所示。對(duì)建立的特征圖譜中的3 個(gè)特征峰進(jìn)行指認(rèn)，采用對(duì)照品比對(duì)法及DAD 光譜分析法，指認(rèn)苯甲酰新烏頭原堿為1 號(hào)峰，苯甲酰烏頭原堿為2 號(hào)峰，苯甲酰次烏頭原堿為3 號(hào)峰。

圖2 制草烏HPLC 特征圖譜

2.2.1 系統(tǒng)適用性

在1.4 色譜條件下，分別對(duì)制草烏（樣品4#）、偽品（樣品23#）、對(duì)照品溶液進(jìn)行檢測(cè)，以苯甲酰烏頭原堿數(shù)據(jù)計(jì)算理論塔板數(shù)大于6 000，分離度大于1.5。對(duì)照品溶液及供試品溶液的色譜圖如圖3所示。

圖3 制草烏、偽品與對(duì)照品的HPLC 色譜圖

2.2.2 儀器精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（樣品1#），在1.4色譜條件下，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄色譜圖，采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件（科邁恩科技有限公司）評(píng)價(jià)，相似度為0.99?？疾焯卣鞣逑鄬?duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，以苯甲酰烏頭原堿為參照峰，結(jié)果各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對(duì)峰面積RSD 小于2%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別于0、2、4、6、8、12、24 h，在1.4 色譜條件下測(cè)定同一的供試品（樣品1#）溶液，記錄色譜圖。采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度為0.99。進(jìn)一步考察特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，以苯甲酰烏頭原堿為參照峰，發(fā)現(xiàn)各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 小于1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對(duì)峰面積RSD 小于2%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)定同一批樣品（樣品1#）6 份，按2.2.2方法分別制備供試品溶液并測(cè)定，記錄色譜圖。采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)，相似度為0.99。進(jìn)一步考察特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，以苯甲酰烏頭原堿為參照峰，發(fā)現(xiàn)各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 小于1%，單峰面積占總峰面積大于2%的特征峰的相對(duì)峰面積RSD 小于2%，表明該方法重復(fù)性好。

2.3 比較分析制草烏特征圖譜與偽品色譜圖

精密稱(chēng)定不同批次的制草烏偽品（樣品21#～30#），按2.2.2 方法制備供試品溶液，測(cè)定并記錄色譜圖如圖4 所示。采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件分析采集得到的數(shù)據(jù)，計(jì)算特征圖譜與制草烏正、偽品相似度如圖5 所示。結(jié)果表明，制草烏正品和特征圖譜之間的相似度均大于0.90，說(shuō)明相似度良好；偽品和特征圖譜之間的相似度均小于0.25，可見(jiàn)偽品和特征圖譜差異大，存在顯著不同。建立的制草烏特征圖譜可用于制草烏的鑒別和質(zhì)量控制。

圖4 10 批制草烏偽品準(zhǔn)噶爾烏頭HPLC 色譜圖

圖5 制草烏及其偽品相似度分析

2.4 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

采用Chempattern 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件處理采集的數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)為AIA 格式），對(duì)相應(yīng)的色譜峰進(jìn)行積分，按照樣品的標(biāo)準(zhǔn)化處理峰面積，聚類(lèi)分析和主成分分析的結(jié)果如圖6 和圖7 所示。

圖6 制草烏及其偽品聚類(lèi)分析結(jié)果

圖7 制草烏及其偽品主成分分析結(jié)果

由圖6、圖7 可知，兩種方法均能將制草烏及其偽品分成兩組，進(jìn)而準(zhǔn)確地區(qū)分制草烏的正、偽品。

建立的制草烏特征圖譜，20 批制草烏色譜圖與特征圖譜之間的相似度均大于0.90，相似度良好，說(shuō)明不同批次制草烏成分種類(lèi)及含量比例相似。而10 批偽品色譜圖與特征圖譜之間相似度均小于0.25，相似度較低，表明偽品與正品的化學(xué)成分存在差異。采用聚類(lèi)分析和主成分分析均能準(zhǔn)確區(qū)分正、偽品，因此，基于特征圖譜可以有效區(qū)分制草烏及其偽品。

2.5 制草烏3 個(gè)成分含量測(cè)定

樣品按照1.4 方法制備供試品溶液，在1.5 色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法對(duì)20 批正品和10 批偽品中3 種主成分的含量進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果分別見(jiàn)表1 和表2。由表1 和表2 可知，20 批正品制草烏和10 批偽品中均含有3 種單酯型生物堿，即苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿，但是制草烏和偽品中3 種成分的比例顯著不同。

表1 20 批正品中3 種成分含量測(cè)定結(jié)果 %

表2 10 批偽品中3 種成分含量測(cè)定結(jié)果 %

制草烏中含量最高的是苯甲酰新烏頭原堿，苯甲酰新烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為6.80%～13.67%，平均值為10.08%；苯甲酰次烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為0.71%～1.50%，平均值為1.00%。從含量上看，20 批正品制草烏中，有13 批的含量超過(guò)《中國(guó)藥典》中0.020%～0.070%的規(guī)定，超標(biāo)1.1～7.9 倍，推測(cè)為炮制不規(guī)范所致。

偽品中含量最高的是苯甲酰烏頭原堿，與正品明顯不同。偽品中苯甲酰新烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為0.01%～0.06%，平均值為0.03%；苯甲酰次烏頭原堿與苯甲酰烏頭原堿含量比值為0.02%～0.05%，平均值為0.03%。由此可見(jiàn)，制草烏正、偽品中3 種主要成分的含量比例差異較大，依據(jù)主要成分的含量比例特征可以鑒別制草烏正、偽品。同時(shí)，從含量上看，10 批偽品中3 種單酯型生物堿的總量均高于《中國(guó)藥典》中含量0.020%～0.070%的規(guī)定，按最高限度計(jì)算，超標(biāo)4.2～26.1 倍。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制草烏偽品與正品中3 種有效成分的含量比例差異較大，偽品中3 種單酯型生物堿的含量超標(biāo)嚴(yán)重，且制草烏正偽品存在差異化學(xué)成分，若混用偽品，將直接影響制草烏的療效和用藥安全，應(yīng)引起注意。

3 結(jié)語(yǔ)

建立了制草烏的特征圖譜，同時(shí)探討了3 種有效成分的含量比例特征，可以準(zhǔn)確、快速地鑒別制草烏正、偽品。該方法可同時(shí)定性、定量，將為制草烏的質(zhì)量控制提供科學(xué)有力的支持。