冬凌草葉提取物對不同菌種生長抑制作用研究

陽 霞，韋露萍，陳子豪，陳婉婷，趙永清，2

（1.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730124）

冬凌草（Rabdosia rubescens）又名冰凌草、延命草、彩花草等，唇形科香茶菜屬植物，陽性耐陰植物，略喜陰，抗寒性強，能耐-20 ℃低溫，10～40 ℃適宜生長，溫度低于5 ℃基本停止生長。萌蘗力強，耐干旱、瘠薄，即使夏季土壤含水量低于4%，冬凌草仍能夠生長。適應性強，對土壤要求不高，土層深厚、土壤肥沃、砂質(zhì)壤土[1-2]、pH值 6.5～8.0，冬凌草生長最佳。花期8—10月，盛花期9月。在我國河南、山西、河北、湖南、湖北、四川、貴州、廣西、云南、陜西等地均有分布，主產(chǎn)地在河南濟源太行山一帶，最早收載于《救荒本草》[3-4]。冬凌草味甘苦、性微寒，具有清熱解毒、消炎止痛及抗腫瘤等作用[4-9]。冬凌草中含有二萜類、三萜類、多糖、生物堿類、黃酮、揮發(fā)油、內(nèi)酯、有機酸等化學成分，二萜類成分中冬凌草甲素和冬凌草乙素研究最多。冬凌草甲素呈淡黃色針狀結(jié)晶，熔點248~250 ℃，微溶于水，溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮等。冬凌草乙素在常溫常壓下呈白色結(jié)晶粉末狀，溶于甲醇、乙醇，微溶于石油醚，幾乎不溶于水，在室溫下穩(wěn)定性較好。藥理試驗表明，冬凌草具有清熱、解毒、消炎等作用，如冬凌草醇劑對金黃色葡萄球菌、甲型溶血性鏈球菌有明顯的抑制作用以及抗炎、免疫增強作用；冬凌草對治療咽喉腫痛、扁桃體炎、蛇蟲咬傷等具有很好的作用，此外具有較好的抗癌、抗腫瘤活性，對食管癌、賁門癌有很好的療效，且毒性較低[10-11]。

目前，國內(nèi)外關(guān)于冬凌草的抗菌活性研究范圍并不廣泛，主要集中在提取物[3，12]方面，關(guān)于抗菌活性成分的研究很少，主要研究了冬凌草甲素、冬凌草乙素和水楊酸等對細菌及植物源真菌的抑制作用。李小霞[13]以7種植物源真菌為研究對象，對冬凌草提取物抑菌活性及抑菌機制進行初步研究，發(fā)現(xiàn)冬凌草提取物可能是通過破壞細胞膜通透性，同時導致細胞代謝紊亂，從而使菌體生長受到抑制。李高申等[14]通過體外抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素、阿魏酸和水楊酸對3種金黃色葡萄球菌均具有良好的抑菌活性?？娪窦训萚15]對冬凌草甲素對嗜水氣單胞菌體外抑菌效果及作用機制進行研究，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素對嗜水氣單胞菌具有較強的抑制作用，抑菌機制主要是通過增加細胞膜的通透性以及干擾蛋白質(zhì)代謝進而抑制細菌的生長繁殖。糾敏等[16]對冬凌草甲素對金黃色葡萄球菌的抑菌作用機制進行研究，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素是通過改變菌體細胞膜的通透性、抑制菌體蛋白質(zhì)合成及代謝酶的活性從而發(fā)揮抑制作用。王大海等[17]研究表明，冬凌草甲素能夠抑制植物病原真菌的生長，主要是通過對菌絲生長和孢子的抑制來實現(xiàn)的；冬凌草甲素對革蘭氏陽性菌有很好的抑制作用，其對革蘭氏陰性菌的作用比革蘭氏陽性菌的作用弱。許美秋[18]研究了冬凌草提取物對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲醇提取物對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用，其MIC為125 μg/mL，當冬凌草提取物質(zhì)量濃度大于1 MIC時，能顯著抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成和胞外多糖的合成。冬凌草提取物的亞抑制質(zhì)量濃度可通過抑制菌體蛋白質(zhì)的表達從而降低其蛋白質(zhì)的表達量。宋發(fā)軍等[19]對巴東冬凌草水提物抑菌效果進行研究，發(fā)現(xiàn)巴東冬凌草水提物有廣譜抑菌活性，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均抑制，但對革蘭氏陽性菌的抑制作用強于革蘭氏陰性菌。前期研究主要集中在金黃色葡萄球菌，鑒于此，為綜合利用冬凌草的藥效價值，以河南省濟源市冬凌草葉提取物為試樣，分析其對葵腸桿菌、地衣芽孢桿菌等幾種常見細菌的抑菌活性，為冬凌草葉提取物制備成抑菌制劑提供試驗依據(jù)和理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

冬凌草葉樣品采于河南濟源；大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠 膿 桿 菌（Pseudomonas aeruginosa）、枯 草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏菌（Salmonella）、地 衣 芽 孢 桿 菌（Bacillus licheniformis）、葵 腸 桿 菌（Enterobacter cepacius）由西北民族大學生命科學與工程學院實驗室提供。

1.2 儀器與設備

試驗儀器及設備相關(guān)信息見表1。

表1 試驗儀器及設備

1.3 試驗方法

1.3.1 冬凌草葉提取物制備 冬凌草葉提取物采用回流提取法[20-24]制備。將干燥冬凌草葉粉碎，稱取粉碎的冬凌草葉20 g，放入回流裝置的提取瓶中，加入95%的乙醇500 mL，在78 ℃下回流提取1 h，過濾。以45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮濾液回收乙醇，制得浸膏。浸膏經(jīng)電熱恒溫水浴鍋蒸發(fā)制成固體粉末。提取工藝流程如圖1所示。

圖1 冬凌草葉提取物制備工業(yè)流程

1.3.2 濾紙片制備 用打孔器將濾紙打成直徑8 mm的圓紙片，分裝為2組，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽鍋滅菌30 min，置37 ℃恒溫烘干備用。

1.3.3 LB培養(yǎng)基制備 稱取蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、瓊脂粉15 g于950 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值至7.0。加蒸餾水定容至1 L，加熱溶解瓊脂粉，121 ℃高壓蒸汽鍋滅菌30 min。

1.3.4 抑菌活性測定

1.3.4.1 菌懸液的制備 取出-80 ℃冰箱下凍存的7 種菌株，解凍，分別劃線接種在LB培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃倒置培養(yǎng)24 h。待長出單菌落，用滅菌牙簽挑取生長較好的菌落于液體LB培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)12 h（120 r/min、37 ℃），制得懸液，備用。

1.3.4.2 涂菌 取制備的供試金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、葵腸桿菌、地衣芽孢桿菌和綠膿桿菌懸液，接種100 μL于平板培養(yǎng)基，涂布棒涂勻。

1.3.4.3 抑菌圈直徑測定 采用濾紙片法[25-27]測定抑菌圈直徑。取冬凌草葉乙醇提取物，用無菌純水復溶為0.161 g/mL。將滅菌干燥的濾紙片放入溶液中浸泡24 h，用無菌鑷取出，放置于含菌平板中心。同時以浸泡在蒸餾水中的濾紙片為空白對照組，恒溫培養(yǎng)箱37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，取出觀察，測量抑菌圈直徑。

1.4 冬凌草葉乙醇提取率計算

對得到的試樣品進行稱質(zhì)量，通過下式計算提取率：

2 結(jié)果與分析

2.1 冬凌草葉提取率

冬凌草葉提取率按照1.4中的公式進行計算：

冬凌草葉提取率為8.05%。

2.2 冬凌草葉提取物對細菌活性的抑制

冬凌草葉乙醇提取物的抑菌活性定性分析是利用浸過冬凌草葉提取物的濾紙片，在含菌平板中擴散，使其周圍細菌的生長受到抑制，進而形成透明的抑菌圈，根據(jù)抑菌圈直徑判定提取物的抑菌效果，結(jié)果如圖2—8及表2所示。

圖2 冬凌草葉提取物對大腸桿菌的抑菌作用

圖3 冬凌草葉提取物對葵腸桿菌的抑菌作用

圖4 冬凌草葉提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌作用

圖5 冬凌草葉提取物對沙門氏菌的抑菌作用

圖6 冬凌草葉提取物對地衣芽孢桿菌的抑菌作用

圖7 冬凌草葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

圖8 冬凌草葉提取物對綠膿桿菌的抑菌作用

與空白組相比，冬凌草葉提取物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌5 種供試菌均有一定的抑菌作用，含菌平板均形成了明顯的透明圈，其中金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的透明圈相對較大，菌體生長均勻；枯草芽孢桿菌和沙門氏菌所形成的透明圈大小其次，菌體生長較為均勻；綠膿桿菌形成的透明圈較小，菌體生長不均勻；葵腸桿菌和地衣芽孢桿菌沒有明顯透明圈形成。綜上，冬凌草葉提取物對大多數(shù)細菌有較明顯的生長抑制作用，有望開發(fā)成天然抑菌制劑。

由表2可知，當冬凌草葉提取物質(zhì)量濃度為0.161 g/mL時，對大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有抑制作用，抑菌圈直徑分別為21、16、13、23、17 mm。判定標準：抑菌圈直徑大于15 mm為高度敏感；10～15 mm為中度敏感；7～9 mm為低度敏感；小于7 mm為不敏感[28]。因此，本研究中上述5株供試菌對冬凌草葉乙醇提取物均呈現(xiàn)出中高度敏感性，葵腸桿菌、地衣芽孢桿菌對冬凌草葉提取物均不敏感。冬凌草葉提取物可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌5株供試菌的生長，且對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果最佳。綜上，冬凌草葉提取物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑菌效果，且對革蘭氏陽性菌的抗菌活性整體上高于革蘭氏陰性菌，這與參考文獻[17]、[19]的報道一致。

表2 冬凌草葉提取物對7種菌的抑菌圈大小

3 結(jié)論與討論

隨著抗生素和磺酰胺及其他抗菌藥物的廣泛使用，細菌對藥物的抵抗力不斷提高。因此，研發(fā)高效、廣譜和低副作用的藥物將成為預防和治療細菌感染類疾病的重中之重。研究發(fā)現(xiàn)，中藥或天然植物提取物可抑制或直接殺滅病原菌而不產(chǎn)生耐藥性，因此，抗菌中藥逐步成為研究熱點[29]。前期研究發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素藥理作用廣泛，可以抑制多種細菌如金黃色葡萄球菌的生長繁殖[3，30-32]。本研究主要對冬凌草葉活性物質(zhì)的抑菌效果進行探索，以促進冬凌草葉更為全面的開發(fā)利用。

本研究探索了冬凌草葉提取物對7種細菌生長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)冬凌草葉提取物作用質(zhì)量濃度為0.161 g/mL時，對大腸桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的生長抑制作用，對葵腸桿菌和地衣芽孢桿菌沒有抑菌活性。冬凌草葉提取物對不同細菌的抑制效果有較明顯差異。冬凌草葉提取物對革蘭氏陽性菌的生長抑制程度整體上高于革蘭氏陰性菌，這主要是由于不同細菌細胞壁化學組成和結(jié)構(gòu)上的差異。革蘭氏陽性菌的細胞壁是由多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的肽聚糖和磷壁酸組成，胞外沒有脂膜，冬凌草葉提取物的有效成分可以相對容易地滲透進入，對生物膜發(fā)揮清除和形成抑制作用，致使膜壁分離，形成空腔，破壞細胞結(jié)構(gòu)，從而抑制細菌的生長和繁殖。而革蘭氏陰性菌的細胞壁不含磷壁酸，只含單層肽聚糖，且肽聚糖外覆著1 層脂膜，由于脂膜的存在，冬凌草葉提取物水溶性成分相對不易進入。因此，冬凌草葉提取物對革蘭氏陽性菌有更顯著的抑制作用。冬凌草葉提取物對多種細菌有顯著的生長抑制作用，可作為植物源天然抑菌劑，安全性高，而且抑菌效果佳，可以考慮逐步取代抗生素類藥物，減少抗生素濫用現(xiàn)象。

細胞膜保護細胞內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定，可與外界環(huán)境進行物質(zhì)、能量和信息交換。冬凌草提取物使細胞膜的形成受到抑制，通透性增加，細胞質(zhì)外流，嚴重影響菌體的新陳代謝活動[33]。有研究表明，冬凌草甲素的抑菌機制主要通過破壞菌體形態(tài)，改變細胞膜的通透性以及引起細菌的代謝紊亂來抑制細菌生長[13，15]。冬凌草葉提取物對細菌的生物膜有清除和抑制形成作用，可抑制胞外多糖合成[18]。目前，對于冬凌草葉提取物抑菌機制的研究尚不充分，下一步將探明冬凌草葉提取物對不同病原菌的抑菌活性和抑菌機制。