冬季發(fā)熱門診患者咽拭子13項呼吸道病原體分析*

趙一琳，許曄瓊，陳潔，俞建峰，宛傳丹

(常熟市醫(yī)學檢驗所分子生物學實驗室，江蘇常熟 215500)

以發(fā)熱、咳嗽、呼吸急促等呼吸系統(tǒng)癥狀為主要臨床特征的急性呼吸道感染(acute respiratory infection, ARI)，一直威脅著人類健康。新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情發(fā)生之初，我國即采取強有力的封閉隔離措施，通過強化個人防護、加強人口流動管理、大力提升核酸檢測能力等一系列策略，及時切斷病毒傳播途徑[1]。目前，因新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)變異，境外部分地區(qū)COVID-19疫情嚴重。國內(nèi)采取嚴格的“內(nèi)防反彈，外防輸入”的策略，雖存在較少散發(fā)病例，但不會形成大規(guī)模流行感染之勢。各級醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)重點管控好發(fā)熱門診就診患者，及時發(fā)現(xiàn)散發(fā)病例有利于從源頭控制住病毒傳播。本研究針對疫情常態(tài)化防控背景下冬季發(fā)熱門診疑似COVID-19患者咽拭子中可能存在的13種常見呼吸道病原體進行核酸檢測分析，以研究COVID-19疫情防控形勢下其他常見病原體的存在與分布特征。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集2020年12月至2021年3月根據(jù)疫情防控要求，因發(fā)熱癥狀而分診至常熟市第一人民醫(yī)院、常熟市第二人民醫(yī)院與常熟市中醫(yī)院發(fā)熱門診的患者368例，其中成年組(≥18歲)291例，年齡(37.8±5.9)歲；未成年組(<18歲)77例，年齡(12.3±3.5)歲。按照SARS-CoV-2采集要求進行咽拭子的采集、保存與送檢。所有標本先經(jīng)SARS-CoV-2核酸檢測(RT-PCR法)。呼吸道感染疾病診斷標準參考《內(nèi)科學》第3版相關標準[2]。

1.2儀器與試劑 SARS-CoV-2核酸快速提取試劑盒(磁珠法)(批號：20201121)、新型冠狀病毒核酸擴增檢測試劑盒(貨號：JC102233-1N)、SAW-96全自動核酸提取儀(江蘇碩世公司)。13種呼吸道病原體多重RT-PCR檢測試劑盒(寧波海爾施公司)，微量分光度計Onedrop(美國熱電公司)，普通PCR儀(13項病原體多重RT-PCR用)、QuantStudio5實時熒光定量PCR儀(SARS-CoV-2核酸檢測用)、3500 Dx基因測序儀(美國ABI公司)。

1.3多重RT-PCR毛細管電泳法 用13種呼吸道病原體檢測試劑盒檢測甲型流感病毒(influenza A virus, InfA)、腺病毒(human adenovirus,HADV)、博卡病毒(bocavirus,Boca)、鼻病毒(human rhinovirus,HRV)、甲型H1N1流感病毒、副流感病毒(human parainfluenza virus, HPIV)、衣原體(chlamydia, Ch)、偏肺病毒(human metapneumovirus, HMPV)、乙型流感病毒(influenza B virus, InfB)、肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae, Mp)、甲型H3N2流感病毒(influenza A virus H3N2)、冠狀病毒(human coronavirus, HCoV)、呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, HRSV)。將臨床咽拭子標本、陰性對照和陽性對照(廠家試劑盒中提供)充分混勻，各吸取200 μL，加入核酸快提深孔板(預分裝試劑)，上全自動核酸提取儀按標準提取方案進行核酸萃取。用微量分光光度計進行核酸純度驗證。取5 μL核酸提取物作為擴增模板，加入預配的15 μL混合反應體系中。多重RT-PCR反應參數(shù)為：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，95 ℃ 2 min。第一次循環(huán)：94 ℃ 30 s，65～60 ℃ 30 s(每次循環(huán)遞減1 ℃)，72 ℃ 60 s，共6個循環(huán)。第二次循環(huán)：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共29個循環(huán)。最后72 ℃ 10 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。吸? μL產(chǎn)物加至電泳上樣液，與標準品(熒光標記DNA片段，廠家試劑盒提供)配成混合液9 μL，在ABI 3500 Dx上導入設置好的參數(shù)文件，毛細管電泳55 min檢測分析。結(jié)果判讀標準[3]：擴增產(chǎn)物中目的位點峰高度低于該道毛細管標準品低峰(NegS)的，判該位點陰性；擴增產(chǎn)物中目的位點峰高度高于該道毛細管標準品高峰(PosS)的，判該位點陽性；擴增產(chǎn)物中目的位點峰高度高于該道毛細管標準品低峰但低于標準品高峰的，判該位點灰區(qū)，重新進行核酸提取、擴增并電泳分析。若該位點若仍落在灰區(qū)的，判陽性；若落在陽性區(qū)域的，判陽性；若落在陰性區(qū)域的，判陰性。

1.4統(tǒng)計學分析 采用GraphPad 8.0作圖，SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。率的比較用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1SARS-CoV-2核酸檢測 經(jīng)雙重熒光RT-PCR檢測，所有標本均未檢出SARS-CoV-2病毒ORF1ab/N靶基因(檢出限350 copies/mL)。

2.213種呼吸道病原檢出率 未成年組77例中，檢出陽性67例，檢出率為87.0%，其中檢出率排前五位為InfB、HRV、InfA、HRSV與Mp，HCoV與Ch未檢出。成年組291例中，檢出陽性116例，檢出率為39.8%，其中檢出率前五位為InfA、HRV、H3N2、InfB與HMPV；未發(fā)現(xiàn)HCoV、Boca和甲型H1N1流感病毒。未成年組檢出率高于成年組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=108.366，P=0.000)。見表1。

表1 2020—2021年冬季發(fā)熱門診13種呼吸道病原體檢出情況[n(%)]

2.3混合感染情況 183例陽性病例中，有34例混合感染(檢出2種及以上病原體)，陽性病例中混合感染率占18.6%。其中，2種病原體混合感染28例，3種病原體感染3例，4種病原體感染3例。見圖1。

注：InfA，甲型流感病毒；HADV，腺病毒；Boca，博卡病毒；HRV，鼻病毒；HPIV，副流感病毒；HMPV，偏肺病毒；InfB，乙型流感病毒；Mp，肺炎支原體；H3N2，甲型H3N2流感病毒；HRSV，呼吸道合胞病毒。

3 討論

本文針對COVID-19疫情防控常態(tài)化背景下病毒感染流行季節(jié)中發(fā)熱門診其他常見13種呼吸道病原體的感染流行分布情況進行調(diào)查研究。結(jié)果顯示，未檢出SARS-CoV-2患者仍存在其他病原體感染。13種呼吸道病原體在未成年人組檢出率87.0%，成年人組中為39.8%。從類型分析，冬季呼吸道感染流行主要的病原體為流感病毒。各年齡群中InfA、InfB檢出率均居前位，與報道基本相一致[4-5]。未成年組中，HRV、RSV、Mp檢出率較高，成年組中H3N2與HMPV檢出較高。不同人群機體免疫力不同，生活環(huán)境與方式存在差異，即使在同一地區(qū)其感染的病原體也存在差異。根本原因在于冬季區(qū)域環(huán)境中流行的病原體存在方式不同，各研究報道的呼吸道病毒檢出率均存在顯著差異[6-7]。2020—2021年COVID-19疫情常態(tài)化防控背景下，對病毒感染流行有較大程度的影響。隔離阻斷、改變社交方式等預防措施能有效降低呼吸道感染病原體的傳播。未成年組檢出率仍較高，可能是由于未成年人機體免疫尚在建立，學習活動聚集性高，預防意識較差等因素造成。因此，未成年人群仍將是冬季流感病毒主要受眾人群。

混合感染現(xiàn)象較為普遍，檢出率在18.6%，與上海、連云港近年檢出的混合感染率基本一致[4-5]。混合感染多為2種病原體感染，其中InfA/InfB混合感染現(xiàn)象最為嚴重?；旌细腥径喟l(fā)生在未成年組中，與聚集性學習生活方式可能相關。臨床要注意區(qū)分病原體種類，對其造成的感染疾病采取相應的治療方案。3種以上病原體混合感染較少，混合感染的機制與臨床意義有待探討。

COVID-19疫情的發(fā)生大大推動了核酸檢測在病原學診斷中的普及，而技術的自動化發(fā)展更促進了核酸檢驗高效、快捷、低廉的市場優(yōu)勢。病原學核酸檢測將成為病原學診斷重要的直接證據(jù)。