哌拉西林他唑巴坦對(duì)類鼻疽伯克霍爾德菌的體外抗菌活性評(píng)估*

黃梅會(huì)，吳華，周曉君，王旭明

(海南省人民醫(yī)院 海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院檢驗(yàn)科，?？?570311)

類鼻疽病是由類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderiapseudomallei，B.pseudomallei)所致的人畜共患病。該病主要分布于南北緯20°之間的熱帶和亞熱帶地區(qū)，如東南亞和澳洲北部地區(qū)[1]。海南島是我國(guó)南部最大的熱帶島嶼，與泰國(guó)、越南、老撾等類鼻疽病高發(fā)國(guó)家臨近，其高溫潮濕的熱帶季風(fēng)氣候使海南島成為B.pseudomallei的主要疫源地。類鼻疽病的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多變，有“似百樣病”之稱。由于該菌能在吞噬細(xì)胞內(nèi)存活，故引起的慢性感染癥狀與結(jié)核分枝桿菌感染相似，當(dāng)細(xì)菌入血時(shí)，可形成菌血癥以及內(nèi)臟膿腫。根據(jù)國(guó)際治療指南[2]，強(qiáng)化階段靜脈注射頭孢他啶或美羅培南至少2周(危重病人需進(jìn)行長(zhǎng)期強(qiáng)化治療)，根除階段口服抗菌藥物(首選藥物復(fù)方磺胺甲噁唑，其次是阿莫西林克拉維酸或強(qiáng)力霉素)至少3個(gè)月。然而，最近有來自世界不同類鼻疽病流行國(guó)家(包括鄰國(guó)印度)的B.pseudomallei對(duì)頭孢他啶、復(fù)方磺胺甲噁唑和阿莫西林克拉維酸耐藥的報(bào)道[3-4]。哌拉西林他唑巴坦抗菌譜廣，注射后組織滲透力強(qiáng)，體液血藥濃度分布高的特點(diǎn)，目前臨床應(yīng)用廣泛，但鮮見用于B.pseudomallei感染的治療。其主要原因是目前美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)還沒有評(píng)估該抗菌藥物對(duì)B.pseudomallei的敏感性，體外藥敏報(bào)告上沒有該抗菌藥物的藥敏結(jié)果，無法選其進(jìn)行治療。另外，經(jīng)驗(yàn)性治療又缺乏臨床數(shù)據(jù)的總結(jié)。本研究通過對(duì)109例住院患者類鼻疽病治療過程進(jìn)行回顧，發(fā)現(xiàn)2例患者使用哌拉西林他唑巴坦治療獲得成功，引發(fā)我們對(duì)其體外抗B.pseudomallei活性的關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于B.pseudomallei對(duì)哌拉西林他唑巴坦的研究相對(duì)較少。Dutta等[5]發(fā)現(xiàn)B.pseudomallei對(duì)哌拉西林他唑巴坦均敏感，而趙梅等[6]的結(jié)果顯示哌拉西林他唑巴坦的敏感性很高，其中21例患者使用了哌拉西林他唑巴坦聯(lián)合左氧氟沙星抗類鼻疽治療。基于上述信息，本研究應(yīng)用E-test藥敏法比較收集自海南省人民醫(yī)院的109株B.pseudomallei對(duì)哌拉西林他唑巴坦、美羅培南(EUCAST敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)[7])和亞胺培南、強(qiáng)力環(huán)素、阿莫西林克拉維酸、四環(huán)素、復(fù)方磺胺甲噁唑(CLSI敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)[8])的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，并為類鼻疽病的治療提供額外選擇。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1菌株來源 收集2010年6月至2018年5月海南省人民醫(yī)院類鼻疽病確診患者各類標(biāo)本中分離培養(yǎng)的B.pseudomallei菌株109株，并進(jìn)行E-test法藥敏試驗(yàn)。其中，70株來源于血液標(biāo)本，8株來源于痰標(biāo)本，5株來源于尿標(biāo)本，26株來源于膿性分泌物標(biāo)本。

1.1.2抗菌藥物 亞胺培南、美羅培南、阿莫西林克拉維酸、頭孢他啶、四環(huán)素、哌拉西林他唑巴坦、強(qiáng)力霉素及復(fù)方磺胺甲噁唑E-test試紙條(溫州市康泰生物科技有限公司)。

1.1.3培養(yǎng)基 Mueller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基(M-H培養(yǎng)基，江門凱林公司)，5%哥倫比亞羊血平板(鄭州安圖生物公司)。

1.1.4主要儀器 Vitek 2 compact(軟件版本為VT2.R7.01)細(xì)菌分析儀及配套細(xì)菌鑒定GN卡、麥?zhǔn)媳葷醿x、麥?zhǔn)瞎?、Vitek MS(法國(guó)生物梅里埃公司)。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定 所有菌株采用Vitek 2 compact VT2.R7.01版本的GN卡進(jìn)行初步鑒定，然后利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)復(fù)核，最后將菌株送往中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所采用多位點(diǎn)序列分型[9]進(jìn)行確認(rèn)。

1.2.2E-test藥敏試驗(yàn) 將109株B.pseudomallei從-80 ℃超低溫冰箱中取出并復(fù)蘇，轉(zhuǎn)種于5%哥倫比亞羊血平板上，置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，再將其配制成0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝粷舛染?，按照CLSI推薦的標(biāo)準(zhǔn)紙片藥敏試驗(yàn)涂抹法用棉簽蘸取適量菌液，將菌液于不同角度涂布于M-H培養(yǎng)基上(M-H培養(yǎng)基在使用前先置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min，使其表面干燥)，涂布完成后將試紙條具有鋸齒形凹端朝下(此端含有不同藥物濃度的藥物)，垂直插入培養(yǎng)基中，一個(gè)9 cm的M-H瓊脂平板可放入4條E-test試紙條，4條E-test試紙條按照十字形排列，然后將放入E-test試紙條的M-H培養(yǎng)基置于35 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(16～20 h后取出)，最后進(jìn)行結(jié)果判讀。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，該檢測(cè)方法被證明與金標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法一致[10]。

除哌拉西林他唑巴坦及美羅培南外的其他6種抗菌藥物MIC結(jié)果遵循美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2015版發(fā)布的M45-A2[8]進(jìn)行解釋。美羅培南遵循2019版EUCAST歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行解釋[7]。獲得結(jié)果后再分別計(jì)算這7種有判斷標(biāo)準(zhǔn)抗菌藥物的MIC50、MIC90和無判斷標(biāo)準(zhǔn)的哌拉西林他唑巴坦的MIC50和MIC90。

1.3質(zhì)控菌株 質(zhì)控菌株為大腸埃希菌(ATCC 25922)和銅綠假單胞菌(ATCC 27853)，質(zhì)控結(jié)果均符合CLSI規(guī)定范圍[8]。

2 結(jié)果

2.1MIC分布 亞胺培南的MIC值主要分布在0.25～0.5 μg/mL，美羅培南的MIC值主要分布在0.5～1.0 μg/mL，頭孢他啶的MIC值主要分布在1.0～2.0 μg/mL，阿莫西林克拉維酸的MIC值主要分布在2.0～4.0 μg/mL，四環(huán)素的MIC值主要分布在1.0～4.0 μg/mL，哌拉西林他唑巴坦的MIC值主要分布在0.25～0.5 μg/mL，強(qiáng)力霉素的MIC值主要分布在0.25～1.0 μg/mL，復(fù)方磺胺甲噁唑的MIC值主要分布在0.5～2.0 μg/mL。見表1。

表1 109株類鼻疽伯克霍爾德菌對(duì)8種抗菌藥物MIC分布及累積率

2.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果判讀 哌拉西林他唑巴坦在CLSI上無判斷折點(diǎn)。根據(jù)CLSI敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)，所有菌株對(duì)亞胺培南、頭孢他啶及阿莫西林克拉維酸全部敏感；四環(huán)素有103株B.pseudomallei的MIC值≤4.0 μg/mL，為敏感，5株MIC值=8.0 μg/mL，為中介，1株MIC值≥16.0 μg/mL，為耐藥；強(qiáng)力霉素有108株B.pseudomallei的MIC值≤4.0 μg/mL，為敏感，1株MIC值≥16.0 μg/mL，為耐藥；復(fù)方磺胺甲噁唑有104株B.pseudomallei的MIC值≤2.0 μg/mL，為敏感，5株≥4.0 μg/mL，為耐藥。根據(jù)EUCAST歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，美羅培南有106株B.pseudomallei的MIC值≤2.0 μg/mL，為敏感，3株MIC值為8.0 μg/mL，為耐藥；哌拉西林他唑巴坦有107株B.pseudomalleiMIC值≤0.5 μg/mL，2株為1 μg/mL。通過與CLSI藥物敏感性標(biāo)準(zhǔn)和EUCAST歐盟藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)比較，獲得109株B.pseudomallei對(duì)有判斷折點(diǎn)的7種抗菌藥物的敏感性結(jié)果，并通過計(jì)算獲得這8種抗菌藥物對(duì)B.pseudomallei的MIC50和MIC90。見表2。

表2 類鼻疽伯克霍爾德菌對(duì)7種抗菌藥的藥物敏感度和對(duì)8種抗菌藥的MIC50和MIC90對(duì)比

8種抗菌藥物的MIC50從小到大依次為哌拉西林他唑巴坦(0.25 μg/mL)<亞胺培南、美羅培南、強(qiáng)力霉素(均為0.5 μg/mL)<復(fù)方磺胺甲噁唑、頭孢他啶(均為1 μg/mL)<四環(huán)素、阿莫西林克拉維酸(均為2 μg/mL),MIC90從小到大則依次為哌拉西林他唑巴坦、亞胺培南(均為0.5 μg/mL)<美羅培南(1 μg/mL)<復(fù)方磺胺甲噁唑、頭孢他啶、強(qiáng)力霉素(均為2 μg/mL)<四環(huán)素、阿莫西林克拉維酸(均為4 μg/mL)。

另外，結(jié)合臨床常用的哌拉西林他唑巴坦國(guó)產(chǎn)劑型及進(jìn)口劑型的血藥濃度峰值(Cmax)，計(jì)算各劑型的Cmax及其與MIC50、MIC90的比值，結(jié)果見表3。

表3 哌拉西林他唑巴坦劑型及血藥濃度峰值(Cmax)與其MIC50和MIC90比值

3 討論

類鼻疽病在東南亞和澳大利亞是一種重要的公共衛(wèi)生性疾病，在中國(guó)主要分布在海南、廣東、廣西等。文獻(xiàn)資料顯示該病在墨西哥、中美洲、加勒比海地區(qū)等非流行區(qū)逐漸增多[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，B.pseudomallei感染患者在沒有及時(shí)給予正確抗菌藥物治療時(shí)死亡率高達(dá)80%，但及時(shí)給予正確抗菌藥物治療患者死亡率可降低為14%～40%[12]。因醫(yī)療水平、醫(yī)療條件的不同，該病死亡率在20%～60%不等[6]。隨著早期抗菌藥物的使用，死亡率也可降至10%以下[13]。然而，由于B.pseudomallei對(duì)多種抗菌藥物(如青霉素、氨芐西林、一代和二代頭孢、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、鏈霉素、多黏菌素等)天然耐藥[2]，喹諾酮類抗菌藥物雖然在體外具有輕微的抗菌活性，但治療失敗率較高[3]。因此，對(duì)于類鼻疽病的治療，可選用的藥物種類有限。目前CLSI對(duì)B.pseudomallei有敏感性判讀標(biāo)準(zhǔn)的藥物僅有復(fù)方磺胺甲噁唑、頭孢他啶、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、阿莫西林克拉維酸和亞胺培南[8]。

為給類鼻疽病的治療提供更多用藥選擇，本研究結(jié)合7種有敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)的抗菌藥物和哌拉西林他唑巴坦進(jìn)行了試驗(yàn)比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)哌拉西林他唑巴坦的MIC50和MIC90分別為0.25 μg/mL和0.5 μg/mL，MIC50小于其他7種抗菌藥物的MIC50，而MIC90除了與亞胺培南的MIC90相等之外，也均小于其他6種抗菌藥物的MIC90。該結(jié)果說明其體外抗菌活性強(qiáng)于其他所測(cè)藥物。

哌拉西林是一種廣譜半合成β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，通過抑制細(xì)菌的隔膜形成和細(xì)胞壁的合成發(fā)揮殺菌作用，在體外對(duì)許多革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性的需氧菌及厭氧菌具有抗菌活性[14]。他唑巴坦又名三氮甲基青霉烷砜，是多種β-內(nèi)酰胺酶的強(qiáng)效抑制劑。在哌拉西林他唑巴坦的配方中，他唑巴坦的存在增強(qiáng)并擴(kuò)展了哌拉西林的抗菌譜，使該藥對(duì)許多原先對(duì)哌拉西林以及對(duì)其他β-內(nèi)酰胺抗菌藥物耐藥的產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌有效[14]。哌拉西林他唑巴坦注射后在各種組織和體液中分布廣泛，其臨床治療適應(yīng)癥也比較廣，如下呼吸道感染、細(xì)菌性敗血癥、婦科感染等。

哌拉西林他唑巴坦對(duì)于腸桿菌科細(xì)菌在CLSI上已有敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于非發(fā)酵菌，除了銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、流感嗜血桿菌外，其他菌尚無敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究結(jié)果提示哌拉西林他唑巴坦對(duì)B.pseudomallei的MIC50和MIC90均低于已有判斷標(biāo)準(zhǔn)的亞胺培南、頭孢他啶、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、阿莫西林克拉維酸、復(fù)方磺胺甲噁唑和美羅培南，說明其體外抗B.pseudomallei活性強(qiáng)于其他對(duì)照藥物，結(jié)合其在體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)無論是國(guó)產(chǎn)還是進(jìn)口的多種劑型，其血藥濃度峰值都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其MIC50和MIC90值，而一般認(rèn)為，抗菌藥物的血藥濃度高于其對(duì)目標(biāo)菌的MIC值4～6倍以上，在體內(nèi)就有抑菌或殺菌作用。用于分析哌拉西林他唑巴坦對(duì)B.pseudomallei的敏感性標(biāo)準(zhǔn)大多參照CLSI中銅綠假單胞菌的MIC敏感折點(diǎn)[5]。Dutta等[5]發(fā)現(xiàn)來自孟加拉國(guó)的20株B.pseudomallei對(duì)哌拉西林他唑巴坦均敏感(參照CLSI中銅綠假單胞菌的MIC敏感折點(diǎn))，其MIC50和MIC90均為2 μg/mL。該報(bào)道中的MIC值顯著高于本研究結(jié)果，但其樣本數(shù)量可能太少，所有分離株對(duì)3種常用抗菌藥物(亞胺培南、頭孢他啶和阿莫西林克拉維酸)的MIC50和MIC90值均較高(≥2 μg/mL，瓊脂稀釋法)。另外，董素芳等[15]亦研究了B.pseudomallei對(duì)哌拉西林他唑巴坦的敏感性，文中僅提示其參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判定。綜上所述，本研究仍具有一定的參考意義，為臨床應(yīng)用哌拉西林他唑巴坦治療B.pseudomallei感染提供理論依據(jù)。

本研究對(duì)哌拉西林他唑巴坦體外對(duì)B.pseudomallei的MIC濃度進(jìn)行初步研究，旨在引起人們對(duì)B.pseudomallei感染中抗菌藥物選擇的重視，提高B.pseudomallei感染的治愈率，降低死亡率。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)與臨床緊密合作，以便獲取更多的哌拉西林他唑巴坦治療B.pseudomallei感染的臨床藥效學(xué)總結(jié)，為其治療用藥提供更有力的證據(jù)。