利用13C標(biāo)記和自然豐度三源區(qū)分玉米根際CO2釋放*

孫昭安，張保仁，何敏毅，王開(kāi)永，胡正江，陳 清，孟凡喬?

（1. 濰坊學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東省高校生物化學(xué)與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濰坊 261061；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，農(nóng)田土壤污染防控與修復(fù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3. 桓臺(tái)縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東桓臺(tái) 256400）

土壤碳庫(kù)包括有機(jī)碳（Soil organic carbon，SOC）和無(wú)機(jī)碳（Soil inorganic carbon，SIC）庫(kù)，全球1 m深土層碳儲(chǔ)量分別為1 350和950 Pg C，SIC含量以CaCO3占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[1]。我國(guó)SIC庫(kù)儲(chǔ)量（60 Pg C）是SOC庫(kù)量（50 Pg C）的1.2倍，主要分布在西北和華北地區(qū)[2]。通常認(rèn)為SIC較為穩(wěn)定，以往研究土壤碳循環(huán)多集中在SOC方面，較少考慮SIC的作用[3-4]。隨著土壤碳循環(huán)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)SIC也可以成為碳源（碳酸鹽溶解釋放）[4-5]或碳匯（次生性碳酸鹽形成）[3，6-7]。然而，以往大多數(shù)研究忽略了SIC溶解對(duì)土壤CO2的貢獻(xiàn)，這可能導(dǎo)致對(duì)SOC分解的高估，勢(shì)必造成SOC激發(fā)效應(yīng)評(píng)估的不確定[8-9]。

土壤原有碳庫(kù)背景值很大，土壤碳庫(kù)的短期變化相對(duì)較小，很難直接通過(guò)測(cè)定土壤碳含量來(lái)定量土壤碳庫(kù)的短期改變，測(cè)定土壤CO2的釋放是其中比較有效的間接方法[10]。在種植植物的石灰性土壤上，土壤CO2釋放源有三個(gè)，即外源根源呼吸以及土壤SOC分解和SIC溶解的釋放，三源區(qū)分CO2是定量土壤碳平衡和SOC激發(fā)效應(yīng)的前提。三源碳釋放體系的存在，給土壤CO2區(qū)分研究帶來(lái)挑戰(zhàn)，準(zhǔn)確三源劃分CO2已成為土壤碳釋放和平衡評(píng)估研究的難點(diǎn)[11-12]。相對(duì)于傳統(tǒng)的兩源區(qū)分，三源區(qū)分還缺乏系統(tǒng)研究，在石灰性土壤上的研究更是較少[13-14]。

本研究以華北平原石灰性農(nóng)田土壤為研究對(duì)象，利用13C示蹤結(jié)合自然豐度法，區(qū)分玉米根際土壤CO2的來(lái)源。研究在玉米關(guān)鍵生育期（拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期）進(jìn)行13CO2脈沖標(biāo)記，先利用13C示蹤技術(shù)量化玉米轉(zhuǎn)移到地下各組分（根系、SOC和土壤CO2）的光合碳量，用兩源法區(qū)分根際土壤釋放CO2中源于根系和土壤的比例[15]，進(jìn)而利用秸稈碳、SOC和SIC之間的δ13C差異，借助13C三元混合模型，把土壤總碳的分解拆分為SIC溶解與SOC分解[16-17]，以期提高華北石灰性農(nóng)田土壤碳預(yù)算評(píng)估的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 玉米種植

玉米盆栽在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)溫室進(jìn)行。供試土壤取自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)曲周試驗(yàn)站農(nóng)田（0～20 cm），為始成土，具有粉質(zhì)壤土結(jié)構(gòu)（砂粒62%，粉粒28%，黏粒10%），相關(guān)性質(zhì)見(jiàn)表1。土壤風(fēng)干后，磨碎、挑根，過(guò)5 mm篩。每盆（直徑20 cm×高度35 cm）裝風(fēng)干土9.5 kg，盆內(nèi)土層深度約27 cm。按N 0.55、P 0.19、K 0.31 g·kg–1風(fēng)干土的比例預(yù)拌肥料（相當(dāng)于耕層的田間肥料施用量），作為底肥一次性施入。播種前先將玉米（Zea maysL.，紀(jì)元1號(hào)）種子放在清水中浸泡12 h，然后再取兩粒淺埋入盆內(nèi)土壤中。幼苗生長(zhǎng)至三葉期時(shí)，每盆留1株。用稱重法控制土壤水分，根據(jù)玉米不同生育期對(duì)水分的需求特點(diǎn)，分別在苗期（播種后0～23 d）、拔節(jié)期（24～53 d）、抽穗期（54～66 d）和灌漿期（67～99 d）四個(gè)階段，調(diào)整土壤含水量為田間持水量（0.31 g·g–1）的60%、70%～75%、75%～80%和 70%～75%。

表1 供試土壤的理化性質(zhì) Table 1 Physical and chemical properties of the test soil

1.2 13CO2脈沖標(biāo)記

分別在玉米出苗后29 d（拔節(jié)期）、57 d（抽穗期）和72 d（灌漿期）進(jìn)行標(biāo)記。每次選取3盆玉米，放入透明塑料制成的密閉標(biāo)記室進(jìn)行13CO2脈沖標(biāo)記[15，18]（圖1）。（1）標(biāo)記前，連接CO2吸收裝置，讓標(biāo)記過(guò)程中根際呼吸產(chǎn)生的13CO2匯聚在盆內(nèi)；（2）將盆內(nèi)土壤和隔板間的空氣與標(biāo)記室空氣隔開(kāi)，隔板和PVC柱的接合處用凡士林密封，并在玉米基部與隔板的間隙中涂上凡士林密封；（3）檢查密閉性：將氣球套在一空心管上，在另一端管口用吸耳球鼓氣，根據(jù)氣球膨脹狀態(tài)判定密封性好壞，然后將空心管管口堵?。唬?）將風(fēng)扇、玉米植株和13C豐度為98%的Ba13CO3放入標(biāo)記室內(nèi)，然后將整個(gè)標(biāo)記室密封；（5）標(biāo)記于上午09：00點(diǎn)開(kāi)始，用注射器向裝有Ba13CO3的燒杯中注入一定量1 mol.L–1的HCl溶液（根據(jù)Ba13CO3計(jì)算HCl的用量），然后開(kāi)始標(biāo)記。此后每隔一段時(shí)間，根據(jù)CO2檢測(cè)儀的讀數(shù)確定是否加入鹽酸，當(dāng)CO2的濃度低于200×10–6時(shí)，向燒杯中注入HCl，維持CO2濃度在360×10–6左右，標(biāo)記時(shí)間持續(xù)7 h。

1.3 玉米根際CO2釋放的取樣和測(cè)定

在27 d的示蹤期內(nèi)（從玉米開(kāi)始標(biāo)記到破壞性取樣），用中性硅酮膠對(duì)隔板和PVC盆的接合處進(jìn)行密封，在莖與隔板的間隙同樣涂抹真空絕緣硅樹(shù)脂（圖1）。每3天更換1次3.5 mol·L–1的NaOH溶液，在27 d示蹤期內(nèi)共進(jìn)行9次動(dòng)態(tài)取樣，定期用空氣泵在土壤與隔板間注入一定量無(wú)CO2的空氣，為玉米地下部提供氧氣。以酚酞作指示劑，用稀鹽酸滴定NaOH溶液中未參加反應(yīng)的NaOH，根據(jù)稀鹽酸和NaOH的體積、濃度，計(jì)算土壤CO2釋放量。將過(guò)量BaCl2溶液加入到土壤CO2的NaOH溶液中，形成BaCO3沉淀，于60 ℃下烘干至恒重，將每次取樣的BaCO3沉淀等比例混合，攪拌混勻形成BaCO3沉淀懸濁液，用注射器先吸取適量懸濁液，然后吸取3 mL 2 mol?L–1的H2SO4溶液，化學(xué)反應(yīng)生成CO2，將針頭立刻插入到帶橡皮塞的5 mL真空采氣瓶中，待注射器中生成的CO2達(dá)到7 mL時(shí)，拔出針頭，把CO2注入到采氣瓶中，用DELTAplusXP型質(zhì)譜儀測(cè)定CO2-δ13C值。

1.4 植株與土壤的取樣和測(cè)定

經(jīng)過(guò)27 d的示蹤期，分別在玉米出苗后56、84和99 d時(shí)，破壞性取樣，從玉米基部剪斷植株，將盆中土壤反復(fù)過(guò)2 mm篩，剔除根系、研磨，過(guò)0.15 mm篩，測(cè)定根系的δ13C值。取約20 g土壤置于白色板上，剔除殘留細(xì)根后加入50 mL的3 mol·L–1的HCl溶液，用于去除土壤中的碳酸鹽。充分?jǐn)嚢璨㈧o止2 d后，以3 000 r·min–1的轉(zhuǎn)速離心3 min，將上清液倒掉，重復(fù)此過(guò)程，洗至上清液中性為止，并將酸化前的上清液倒回?zé)?，?0℃條件下烘干，研磨，過(guò)0.15 mm 篩，用DELTAplusXP型質(zhì)譜儀測(cè)定SOC-δ13C值。SIC-δ13C值測(cè)定：在70℃，于真空系統(tǒng)中將土壤樣品與100%的H3PO4反應(yīng)3 h，用DELTAplusXP型質(zhì)譜儀分析生成CO2的δ13C值。碳同位素值采用PDB（Peedee Belemnite）標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 計(jì)算方法

1）量化地下部的光合碳輸入和兩源區(qū)分根際CO2釋放（13C脈沖標(biāo)記法）[15，19]。

分別在拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期，對(duì)玉米進(jìn)行13C脈沖標(biāo)記后，地上部光合固定的13C轉(zhuǎn)運(yùn)到地下部各組分，包括根系、根際沉積物和土壤CO2釋放，則進(jìn)入地下各組分的13C量為：

式中，13Ci和Ci分別為各組分的13C量（mg·pot–1）和C量（g·pot–1），F(xiàn)i和FNL為各組分標(biāo)記和不標(biāo)記的13C百分含量。

各個(gè)時(shí)期輸入到地下各組分的光合碳量（g·pot–1）：

式中，CΔ地上部為各生育時(shí)期內(nèi)地上部的生物碳量變化，以地上部作為參照是考慮到地上部的生物碳量可以準(zhǔn)確定量。

通過(guò)式（2）定量根源呼吸（CRoot），進(jìn)而土壤CO2（CT）劃分為土壤源CO2（CSoil）和根源呼吸：

式中，F(xiàn)Root和FSoil分別為根源呼吸和土壤總碳釋放占根際釋放CO2的比值。

2）根據(jù)玉米根碳、SOC與SIC之間的δ13C差異（分別為–14.1‰、–3.4‰和–22.2‰），借助13C三元混合模型，進(jìn)一步兩源劃分土壤源CO2（13C自然豐度結(jié)合13C脈沖標(biāo)記法）[16-17]。

式中，F(xiàn)SIC和FSOC分別為SIC源和SOC源CO2占根際CO2釋放的比值（未知量），2COδ、δRoot、δSIC和δSOC分別為根際釋放CO2、根系、SIC和SOC的δ13C值（已知量）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013軟件作圖，圖數(shù)據(jù)的表達(dá)形式為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。方差分析采用SPSS 17.0軟件計(jì)算。生物量、根系占植株干重的比值、光合13C分配在不同生育期的之間的顯著性差異分析比較采用最小顯著差異法（Least Significant Difference，LSD；P<0.05水平）。

2 結(jié) 果

2.1 不同生育期玉米生物量變化

玉米從拔節(jié)到灌漿期，根系生物量無(wú)顯著變化，而地上部和整個(gè)植株生物量在抽穗期達(dá)到最大，然后維持不變（圖2a）。從拔節(jié)期到灌漿期，根系生物量/整個(gè)植株生物量的比值顯著遞減（圖2b）。

2.2 玉米生長(zhǎng)向地下部輸入的光合碳

在玉米關(guān)鍵生育期進(jìn)行13C脈沖標(biāo)記，地上部保留了大部分的光合13C，并且隨著玉米生長(zhǎng)，地上部的13C分配比例顯著增加，而輸入到地下部的13C分配比例顯著遞減（圖3）。從拔節(jié)期到灌漿期，玉米地上部輸入到地下部各組分（根系、根際沉積碳和根源呼吸）的光合碳量呈遞減趨勢(shì)，拔節(jié)期的各組分碳輸入顯著高于后兩個(gè)生育期，后兩個(gè)生育期之間無(wú)顯著差異（圖4）。

2.3 兩源和三源法區(qū)分玉米根際CO2釋放

基于13CO2脈沖標(biāo)記量化的根源呼吸量（圖4），玉米根際的CO2可以劃分為根源和土壤源CO2。從玉米拔節(jié)期到灌漿期，根源呼吸占土壤CO2的比例 呈降低趨勢(shì)，即從拔節(jié)期的66.7%降低至灌漿期的25.8%，在該生長(zhǎng)階段，根源呼吸累計(jì)排放量占土壤CO2的比例約為50%（圖5）。

在兩源法區(qū)分根際CO2的基礎(chǔ)上（圖5），借助13C三元混合模型（13C自然豐度法），將土壤源CO2進(jìn)一步拆分為SOC和SIC源CO2（圖6），發(fā)現(xiàn)SOC 和SIC源CO2占土壤CO2的貢獻(xiàn)比例在灌漿期較高（SIC和SOC源的貢獻(xiàn)比例分別為44.1%和30.1%），在前兩個(gè)生育期較?。⊿IC和SOC源的平均比例分別為23.1%和13.2%）。從拔節(jié)期到灌漿期，SOC和SIC源的累計(jì)CO2占根際CO2排放的貢獻(xiàn)比例約為30%和20%。

2.4 土壤碳收支平衡

從拔節(jié)期到生育期末，玉米生長(zhǎng)對(duì)土壤轉(zhuǎn)移的光合碳量為17.1 g·pot–1（根系+根際沉積物），土壤本身碳（SOC+SIC）釋放碳量為12.9 g·pot–1，因此土壤凈固定碳量為4.2 g·pot–1（土壤光合碳輸入量減去土壤本身碳釋放；圖7）。

3 討 論

3.1 三源區(qū)分土壤CO2的方法比較

區(qū)分土壤CO2是量化根源呼吸和土壤本身碳釋放的前提，13C/14C同位素可以有效劃分CO2的排放來(lái)源[10，12]。由于單一13C/14C通常僅可以兩源區(qū)分土壤CO2，相對(duì)于傳統(tǒng)的兩源法，三源法區(qū)分CO2技術(shù)挑戰(zhàn)較大，一直是研究土壤有機(jī)質(zhì)激發(fā)效應(yīng)的難點(diǎn)。通過(guò)同位素三源區(qū)分土壤CO2組分，一般通過(guò)如下7種途徑（表2）：1）穩(wěn)定同位素溯源軟件[20-21]，2）附加法[13-14]，3）13C源合并和組合法[22]，4）13C和18O自然豐度法[23]，5）14C標(biāo)記結(jié)合13C自然豐度[11-12，24]，6）14C和13C雙標(biāo)記[25-26]，以及7）13C標(biāo)記和自然豐度[16-17]。根據(jù)同位素線性混合模型，n個(gè)同位素，僅適用于精確區(qū)分n+1個(gè)源的貢獻(xiàn)比例[20]，因此，采用13C和14C兩種C同位素（14C標(biāo)記結(jié)合13C自然豐度、14C和13C雙標(biāo)記），可以較為精確三源區(qū)分土壤CO2釋放來(lái)源。在以上區(qū)分方法中，最精準(zhǔn)的是14C和13C雙標(biāo)記方法，它可以克服13C自然豐度方法中同位素分餾效應(yīng)的干擾，也不需要特定的C3/C4植物和土壤條件[25-26]。然而，14C材料有一定輻射危害，受到高度監(jiān)管，僅限于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)[18]。與14C和13C雙標(biāo)記相比，利用不同13C豐度的材料是一個(gè)替代方案，例如本研究采用13C標(biāo)記玉米和13C自然豐度方法三源區(qū)分的根際土壤CO2[16-17]：首先13C標(biāo)記玉米量化根源呼吸和土壤源CO2比例[15]，然后借助13C三元混合模型（13C自然豐度玉米），將土壤源CO2進(jìn)一步劃分為源于SOC和SIC的貢獻(xiàn)比例。這個(gè)方法中由于土壤碳（SOC和SIC）與13C自然豐度根系之間的δ13C差異太小，13C分餾效應(yīng)存在一定不確定性[22]。

表2 三源區(qū)分土壤釋放CO2的方法比較 Table 2 Comparison of the methods for partitioning soil CO2 emission by three source

3.2 碳酸鹽溶解對(duì)土壤釋放CO2的貢獻(xiàn)

通過(guò)對(duì)全球23篇關(guān)于SIC釋放的文獻(xiàn)整合分析，發(fā)現(xiàn)SIC溶解對(duì)土壤總碳（SIC+SOC）釋放的貢獻(xiàn)在3%～95%之間，平均值為46%，95%置信區(qū)間分布為37%～55%（表3），與本研究的結(jié)果接近，即在整個(gè)玉米旺盛生長(zhǎng)階段（從拔節(jié)到生育期末）， SIC源CO2占土壤源CO2的比例為40%（圖6），這就說(shuō)明SIC溶解對(duì)穩(wěn)定全球碳庫(kù)和調(diào)節(jié)CO2濃度方面非常重要[27]，然而，以往研究較少考慮SIC溶解對(duì)CO2排放的貢獻(xiàn)，這將導(dǎo)致SOC分解的高估，影響SOC激發(fā)效應(yīng)的定量[8-9，28]。

表3 碳酸鹽溶解對(duì)土壤CO2釋放的貢獻(xiàn)比較 Table 3 Contribution of carbonate dissolution to soil CO2 emission

隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)集約化水平不斷提高，銨態(tài)氮肥和尿素用量也不斷增加，通過(guò)硝化作用產(chǎn)生H+，影響的弱酸平衡體系，屬于強(qiáng)酸與碳酸鹽的直接反應(yīng)，加劇碳酸鹽的溶解[37-39，50]。因此，今后有必要量化氮肥投入對(duì)華北農(nóng)田SIC溶解的影響，提高區(qū)域石灰性農(nóng)田土壤碳預(yù)算的準(zhǔn)確性。

石灰性土壤中存在著CO2（氣相）-HCO-3（液相）-CaCO3（固相）的三相平衡，SOC分解、根源呼吸與SIC溶解/沉淀平衡之間存在耦合關(guān)系，體現(xiàn)在SOC分解和根源呼吸產(chǎn)生的CO2，既可以驅(qū)動(dòng)碳酸鹽的溶解與釋放，也可以與鈣、鎂離子結(jié)合形成次生性碳酸鹽[3-4，7]：

本研究中，根源呼吸占根際土壤CO2的貢獻(xiàn)比例為50%。玉米生長(zhǎng)增加土壤中CO2分壓，可能加劇SIC的溶解與釋放。此外，根系生長(zhǎng)也可以分泌質(zhì)子和有機(jī)酸，促進(jìn)SIC的溶解[13，51]。因此，玉米根際效應(yīng)對(duì)SIC溶解的影響是不可忽視的。

3.3 玉米生長(zhǎng)對(duì)土壤碳平衡的影響

盡管作物生長(zhǎng)可以產(chǎn)生正根際效應(yīng)，促進(jìn)SOC分解和SIC溶解，但引發(fā)正根際效應(yīng)的植物來(lái)源的有機(jī)碳（根際沉積碳和根系）并未被微生物完全分解釋放到大氣中，殘留部分可以補(bǔ)充因根際效應(yīng)引起的SOC和SIC損失[52]，在本研究中土壤碳收支平衡表現(xiàn)為碳匯。在石灰性土壤，作物生長(zhǎng)不僅可以貢獻(xiàn)SOC的截存[15，53-54]，還可以貢獻(xiàn)SIC的次生形成[55]，但由于土壤SIC背景太大和13C檢測(cè)限（約為10–7mol）較高，本研究在SIC中沒(méi)有檢測(cè)到標(biāo)記的13C信號(hào)[15]，今后可以考慮用檢測(cè)限更加敏感的14C（約為10–13mol）來(lái)解決[55-56]。

4 結(jié) 論

對(duì)于石灰性土壤，從玉米拔節(jié)期到生育期末，根源呼吸和土壤總碳（SIC+SOC）釋放對(duì)根際土壤CO2釋放的貢獻(xiàn)比值為1∶1，SIC溶解對(duì)土壤源釋放CO2的貢獻(xiàn)比例約為40%，說(shuō)明SIC溶解對(duì)于土壤碳庫(kù)穩(wěn)定和大氣CO2濃度調(diào)節(jié)具有雙重作用。若忽視SIC溶解對(duì)土壤CO2釋放的貢獻(xiàn)，有可能導(dǎo)致對(duì)SOC分解的高估，進(jìn)而影響土壤碳平衡的評(píng)估。從拔節(jié)期到生育期末，玉米生長(zhǎng)對(duì)地下部的光合碳輸入（根系+根際沉積物）超過(guò)土壤總碳（SIC+SOC）釋放的損失，土壤表現(xiàn)為碳匯。