基于3D打印技術(shù)SF/PVA/HA復(fù)合骨支架的制備及表征

安田田，許 燕，周建平，張旭婧

(新疆大學(xué) 機(jī)械工程學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830047)

0 引言

骨缺損是由創(chuàng)傷、感染、腫瘤、骨髓炎手術(shù)清創(chuàng)以及各種先天性疾病等導(dǎo)致的一種常見臨床病。目前，醫(yī)學(xué)上治療骨缺損主要方法為自體骨移植和異體骨移植，自體骨移植是現(xiàn)今最理想的治療方法，但是自體骨來源有限且會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生新的創(chuàng)傷，異體骨移植則可能伴有強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)且可傳播疾病。為克服這些缺陷，研制和尋找理想的骨缺損修復(fù)生物材料，已成為醫(yī)學(xué)和生物材料科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。

1993年，Vacati與Lannger[1]提出骨組織工程的概念，為治療骨缺損修復(fù)提供了新的方法和策略，即三維成型骨組織工程支架植入患者病灶缺損處，最終可達(dá)到骨修復(fù)目的。生物3D打印技術(shù)在骨組織工程支架的成型中廣泛應(yīng)用[2]，此技術(shù)通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)模型生成路徑，調(diào)控打印速率，逐層打印模型，較好解決骨修復(fù)過程中骨組織工程支架的構(gòu)建問題，而目前生物3D打印骨支架材料的開發(fā)是研究的熱點(diǎn)問題。絲素蛋白(SF)是從天然蠶絲中提取的高分子蛋白，富含18種氨基酸并相互排列成線性結(jié)構(gòu)。獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和優(yōu)良的生物相容性，有利于細(xì)胞的黏附和生長，在組織工程中廣泛應(yīng)用[3-4]。SF的分子鏈構(gòu)象主要包含3種：無規(guī)卷曲、α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，其功能特性取決于分子構(gòu)象。SF力學(xué)性能不足，但在一定條件下，可誘導(dǎo)SF分子構(gòu)象由α-螺旋和無規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)，提高SF的機(jī)械性能[5]。聚乙烯醇(PVA)是一種具有親水性、粘接性、生物相容性和優(yōu)良力學(xué)性能的高聚物，被廣泛制備成薄膜、納米纖維[6]、水凝膠和多孔支架等。羥基磷灰石(HA)是人體骨骼中最主要的無機(jī)礦物成分[7]，是一種具有良好生物相容性的生物活性材料，與骨可形成良好的化學(xué)鍵性結(jié)合并促進(jìn)新骨生長，是骨植入材料研究的熱點(diǎn)。但HA存在可塑性差、脆性大、受載易斷裂等缺點(diǎn)，常常需要與其他生物材料復(fù)合來改善性能的不足[8]。方艷等人[9]以SF、HA、聚己內(nèi)酯(PCL)作為生物材料，通過超聲混合，采用二次冷凍干燥法制備出新型骨組織工程材料，可用于骨缺損修復(fù)。徐水等人[10]以SF與HA為基材，磷酸緩沖液為溶劑，戊二醇為交聯(lián)劑，使用氣泡致孔法制備出高強(qiáng)度力學(xué)性能多孔支架材料，且與人體多孔骨的結(jié)構(gòu)相近。吳蕾等人[11]將SF凝膠經(jīng)過電泳作用形成SF固溶膠，再將SF凝膠礦化后表面形成的鈣磷沉積物，反復(fù)清洗去鹽后凍干得SF/HA復(fù)合支架，支架能夠更好地促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。Zhang等人[12]將HA與PVA復(fù)合并反復(fù)凍融提高了材料的機(jī)械強(qiáng)度與耐磨損性能。程威等人[13]將SF、 HA、膠原(Col-I)進(jìn)行共混，低溫3D打印出成孔連通性良好的骨支架，為骨缺損修復(fù)材料的甄選提供參考。

基于相關(guān)研究，本文將SF、PVA、HA三種生物材料通過工藝復(fù)合，復(fù)合材料克服了HA單一使用時(shí)的性能不足，增強(qiáng)支架材料的機(jī)械性能與生物性能。設(shè)計(jì)三因素四水平正交試驗(yàn)探究材料之間最優(yōu)配比參數(shù)，通過擠出成型3D打印技術(shù)，制備出結(jié)構(gòu)完整的多孔骨支架，并對(duì)骨支架的理化性能及生物相容性進(jìn)行檢測(cè)和分析，旨在探究骨支架材料可行性和安全性，為治療骨缺損尋找理想修復(fù)材料。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

蠶繭、羥基磷灰石(粒徑40 nm，純度96%南京愛普瑞納米材料有限公司 )、聚乙烯醇、溴化鋰、碳酸鈉均為分析純，透析帶(截留分子量 6 000～8 000,北京索萊寶科技有限公司 )、DMEM低糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國)、兔成骨細(xì)胞(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物中心提供)。

1.2 儀器與設(shè)備

微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)(方辰儀器設(shè)備有限公司)、HH-1 數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市城東新瑞儀器廠)、離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、高精度數(shù)字電子秤(浙江凱豐集團(tuán)有限公司)、冷凍干燥箱(力辰科技有限公司)、自主研制快速成型裝置。

1.3 復(fù)合骨支架制備

1.3.1SF溶液制備

稱取一定量的蠶繭，剪碎后放入濃度為0.5%的碳酸鈉溶液中，在98～100 ℃條件下脫膠30 min，冷卻后用去離子水沖洗，以上操作重復(fù)3次，擠出水分，干燥。將脫膠后的蠶絲按浴比1∶4加入9.3 mol/L的溴化鋰溶液中，在90℃溫度下溶解120 min，溶絲過程中不斷攪拌。再將SF溶液裝入透析袋中并將其兩端封閉，用去離子水透析4 d，期間每3 h換水一次。收集透析袋中SF溶液，在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液，重復(fù)2次，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2骨支架的制備

按預(yù)先確定的質(zhì)量比稱取一定量PVA加入SF溶液中，在90℃水浴鍋加熱攪拌45 min，待PVA完全溶解到SF溶液，即可得SF/PVA復(fù)合凝膠。再按預(yù)先設(shè)定的比例稱取納米HA與SF/PVA水凝膠混合，攪拌均勻后裝入3D打印料筒中。利用3D打印裝置的上位機(jī)編譯G代碼設(shè)計(jì)打印軌跡與控制三維運(yùn)動(dòng)平臺(tái)的速率，運(yùn)動(dòng)控制器調(diào)控步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的噴頭控制裝置，達(dá)到擠壓速率與復(fù)合材料黏度匹配，保證出絲均勻控制支架質(zhì)量，啟動(dòng)擠出式3D裝置打印復(fù)合材料骨支架，最后骨支架進(jìn)行冷凍干燥。

1.3.3正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以SF溶液濃度、SF與PVA質(zhì)量比、SF/PVA體積與HA質(zhì)量的比為自變量，將材料放入模具，制成直徑0.8 cm，高度1 cm的試樣，以最大壓縮強(qiáng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定材料最優(yōu)配比。因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

1.4 復(fù)合材料測(cè)試與表征

1.4.1力學(xué)性能測(cè)試

將SF/PVA/HA干燥樣品在電子萬能試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行材料力學(xué)性能的測(cè)定。樣品直徑8 mm，高度10 mm，測(cè)試環(huán)境為室溫。采用1 kN的傳感器，壓縮速度為1 mm/min，重復(fù)3次。繪制應(yīng)力-應(yīng)變的曲線，得到復(fù)合材料最大壓縮強(qiáng)度，材料的彈性模量為

(1)

其中，F(xiàn)為試驗(yàn)力，A為橫截面積，L為試樣高度，ΔL為軸向變形，σ為正應(yīng)力，ε為應(yīng)變。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Tab.1 Coded and actual values of independent variables

1.4.2骨支架形貌

選擇出絲直徑為0.85 mm的針頭，使用擠壓成型裝置打印10 mm×10 mm×2.4 mm骨支架。采用排水法[14]計(jì)算骨支架孔隙率，測(cè)量步驟如下：首先電子秤測(cè)量骨支架的干重m1，再將材料置于蒸餾水中，使蒸餾水完全浸入材料孔隙中；約10 min后將支架取出，再次稱量骨支架濕重m2，骨支架的孔隙率(P)的計(jì)算公式為

(2)

其中，ρ為蒸餾水的密度，V為骨支架體積。

1.4.3X射線衍射

取一定量骨支架復(fù)合材料，均勻平鋪于X射線衍射儀樣品臺(tái)上，掃描角度0°～50°，掃描速度4 °/min進(jìn)行檢測(cè)，使用JADE 5.0軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4.4傅立葉紅外光譜

將干燥樣品與溴化鉀粉末混合，壓片，在紅外光譜儀上掃描32次，分辨率4 cm-1，測(cè)定范圍為400～4 000 cm-1，使用Origin 9.1作圖分析。

1.4.5材料細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

首先制備浸提液，將干燥的SF/PVA水凝膠和SF/PVA/HA復(fù)合支架進(jìn)行高溫高壓蒸汽滅菌處理，按50 mg/mL的浸提比例制備浸提液。以兔子成骨細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，制成濃度為104個(gè)/cm2細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁，棄原培養(yǎng)基，更換為浸提液，以單純培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每組3孔，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)于1 d、3 d、5 d取出加入10 μL的CCK-8試劑孵育3 h后，在450 nm波長下檢測(cè)各孔吸光度(OD)值。最后進(jìn)行細(xì)胞相對(duì)增殖率(RGR)計(jì)算，公式為

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

壓縮強(qiáng)度與彈性模量是評(píng)價(jià)骨支架材料機(jī)械性能的主要參數(shù)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化骨支架中各材料之間的配比，確定材料最佳制備工藝參數(shù)，三因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Orthogonal test design and results

正交試驗(yàn)以壓縮強(qiáng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以彈性模量為參考指標(biāo)，表2的正交試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出的均值與極差可以得出影響復(fù)合骨支架材料機(jī)械性能的因素主次順序是：PVA∶SF(質(zhì)量比)>SF水溶液濃度>PVA/SF水凝膠∶HA；其最佳工藝參數(shù)：SF溶液濃度3%、PVA∶SF(質(zhì)量比)=5∶1、PVA/SF水凝膠∶HA=1.6 mL∶1 g。

2.1.1正交試驗(yàn)驗(yàn)證

按照正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的工藝參數(shù)組合進(jìn)行壓縮實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，設(shè)置3組平行試樣，壓縮強(qiáng)度分別為9.390 MPa、11.432 MPa、11.586 MPa，其最優(yōu)組合壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示；計(jì)算彈性模量分別為117.5 MPa，162.8 MPa，153.3 MPa，支架材料力學(xué)性能提高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明正交試驗(yàn)可以較好地優(yōu)化復(fù)合材料配比參數(shù)的可行性。

圖1 壓縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of compression experiment

2.2 骨支架形貌

使用機(jī)械擠壓快速成型裝置成功制備出絲均勻，結(jié)構(gòu)完整，孔隙率較大SF/PVA/HA復(fù)合骨支架，如圖2所示。根據(jù)式(1)計(jì)算骨支架孔隙率約為(55±1.5)%，按照最優(yōu)材料配比制備的混合材料黏度適中，打印過程中出絲流暢，孔隙率可控，支架絲材之間孔隙均勻，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)規(guī)則，具有較好的力學(xué)性能和孔隙連通性，可以增大支架的有效面積，有利于骨細(xì)胞增殖與分化與營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸。

圖2 10 mm×10 mm×2.4 mm骨支架宏觀形貌Fig.2 10 mm×10 mm×2.4 mm bone scaffold macroscopic morphology

2.3 X射線衍射掃描分析

利用XRD對(duì)各個(gè)材料進(jìn)行分析，從圖3的XRD圖譜中可以看出，純SF(c)的 XRD 分析圖譜在2θ=19.7°有一個(gè)明顯的特征衍射峰，純SF主要以Silk I(α-螺旋)結(jié)構(gòu)為主[15]。純PVA(b)在19.5°、22.8°、41.0°附近出現(xiàn)特征衍射峰，而SF/PVA水凝膠(a)在41.0°的衍射峰變得不明顯，在22.8°處的衍射峰基本消失，而只在19.6°出現(xiàn)一個(gè)明顯的衍射峰，可以說明SF與PVA共混后分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的轉(zhuǎn)變，形成了某種新的結(jié)構(gòu)，證明SF與PVA分子之間存在一定的相互作用，有利于改善水凝膠的力學(xué)性能。SF/PVA/HA復(fù)合物中SF與PVA由于含量較少和結(jié)晶度較弱，其主要顯示HA的特征衍射峰并且與標(biāo)準(zhǔn)卡羥基磷灰石的衍射峰基本吻合，無其他磷酸鹽成分，表明HA與SF/PVA水凝膠物理混合過程中無其他物質(zhì)生成，SF/PVA的添加對(duì)HA晶體結(jié)構(gòu)物無影響。

圖3 不圖復(fù)合材料XRD圖譜Fig.3 XRD pattern of composite

2.4 傅立葉紅外光譜分析

由圖4傅立葉紅外光譜圖可知，純SF(b)在1 654 cm-1、1 536 cm-1、1 224 cm-1有明顯吸收峰，表明制備的純SF中主要以無規(guī)卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)為主。在SF與PVA混合后，其主要的峰值出現(xiàn)在1 649 cm-1、1 421 cm-1、1 329 cm-1，吸收峰發(fā)生較明顯的偏移，表明SF與PVA復(fù)合后，SF分子和PVA分子間發(fā)生了一定程度的相互作用。純PVA(a)在3 164 cm-1處是-OH的吸收峰，PVA/SF復(fù)合凝膠在3 264 cm-1處出現(xiàn)-OH吸收峰向高波數(shù)偏移，說明該作用為分子間的氫鍵相互作用。在SF/PVA/HA復(fù)合材料(c)的紅外圖譜中1 036 cm-1、602 cm-1、564 cm-1代表不同結(jié)構(gòu)空間的PO43-特征峰，同時(shí)也表現(xiàn)出SF/PVA水凝膠的特征峰，說明HA與SF/PVA水凝膠為物理混合，無發(fā)生相互作用，與X-射線衍射分析結(jié)果一致。

注： a PVA；b SF；c SF/PVA/HA復(fù)合材料；d SF/PVA水凝膠

2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證復(fù)合材料的安全性，兔成骨細(xì)胞與SF/PVA水凝膠、SF/PVA/HA骨支架材料進(jìn)行CCK-8法檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增值率。表3是SF/PVA水凝膠、SF/PVA/HA骨支架材料于1 d、3 d、5 d計(jì)算出的細(xì)胞相對(duì)增值率，SF/PVA水凝膠與SF/PVA/HA骨支架的細(xì)胞增值率均大于75%，根據(jù)ISO10993-5—2009醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，試樣的細(xì)胞相對(duì)增殖率大于70% 可認(rèn)為無毒，則SF/PVA/HA骨支架材料無毒副作用，具有良好的生物安全性。

表3 復(fù)合材料細(xì)胞相對(duì)增值率Tab.3 Relative value-added rate of composite cells

3 討論

理想的骨缺損修復(fù)材料應(yīng)具備的條件[16]是：1)可塑性強(qiáng)，可被加工成所需的形狀，并保持良好機(jī)械強(qiáng)度。2)良好的生物相容性和表面活性，為細(xì)胞提供生長和繁殖的微環(huán)境。3)較高的孔率，易于細(xì)胞營養(yǎng)成分的滲入以及細(xì)胞代產(chǎn)物的排出。4)一定的降解性能，保持缺損處達(dá)到骨支架降解速率與新骨形成速率相匹配。本文設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)快速高效優(yōu)化各材料之間的配比參數(shù)，最優(yōu)參數(shù)組合制備出的復(fù)合材料的壓縮強(qiáng)度和彈性模量都提高，滿足骨缺損修復(fù)材料的力學(xué)性能。通過3D打印技術(shù)制備多孔SF/PVA/HA組織工程骨支架，保證骨支架有較高的孔隙率和孔連通性，三維結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供良好生長空間并有利營養(yǎng)物質(zhì)流動(dòng)。SF與PVA復(fù)合形成的水凝膠兩種材料的分子之間發(fā)生一定的相互作用，有良好的結(jié)合性，改善水凝膠的韌性和黏結(jié)性，HA與SF/PVA水凝膠混合形成的復(fù)合骨支架材料具有優(yōu)異的機(jī)械特性，克服HA單一材料力學(xué)強(qiáng)度和脆性大等局限性。CCK-8法是一種高效高靈敏度的細(xì)胞毒性檢測(cè)方法且檢測(cè)誤差小[17]，用其方法檢測(cè)體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)得出SF/PVA/HA復(fù)合骨支架材料無毒性，可以安全應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，也為后期動(dòng)物體內(nèi)相容性和降解實(shí)驗(yàn)提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本課題選取生物材料HA、PVA以及SF，通過正交試驗(yàn)探究出骨支架材料之間配比，當(dāng)SF溶液濃度為3%、SF與PVA質(zhì)量比為1∶5、SF/PVA水凝膠與HA的比為1.6 mL∶1 g時(shí)，組織工程骨支架的機(jī)械性能最優(yōu)。通過X射線衍射和傅立葉紅外光譜分析SF/PVA/HA復(fù)合材料的晶態(tài)與分子構(gòu)象的結(jié)構(gòu)特征，得出SF分子與PVA分子間發(fā)生一定程度相互作用，兩者有良好的結(jié)合性；體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證骨支架材料有良好的生物安全性。本研究采用3D打印技術(shù)制備的SF/PVA/HA組織工程骨支架具有成型質(zhì)量好、優(yōu)良的機(jī)械性能、較高的孔隙率和良好的生物安全性等優(yōu)點(diǎn)，是較理想的骨缺損修復(fù)材料。下一步研究中還需對(duì)細(xì)胞在骨支架材料內(nèi)部增殖黏附狀況以及材料降解速率進(jìn)行深入探索。